Macierz układ liczb, symboli lub wyrażeń zapisanych w postaci prostokątnej tablicy

Transkrypt

1

2 Macierz układ liczb, symboli lub wyrażeń zapisanych w postaci prostokątnej tablicy Macierz wymiaru m x n przedstawia się jako tablicę złożoną z m*n liczb rzeczywistych ustawionych w m wierszach i n kolumnach. Elementy macierzy mogą być liczbami rzeczywistymi, zespolonymi lub funkcjami algebra-macierze.prv.pl

3 Uporządkowany zbiór jednoniciowych fragmentów DN (sond molekularnych), unieruchomionych na określonej powierzchni w ściśle zdefiniowanym porządku. Jaros, 2006 Miniaturowe układy hybrydyzacyjne składające się z sond specyficznie rozpoznających fragmenty genów lub transkryptów Formanowicz i in., 2008

4 Rodzaj sond cdn sondy o długości kilkuset nt Oligonukleotydowe: o sondach długich (50 70nt) o sondach krótkich (18 25nt) el eskperymentu naliza ekspresji enotypowanie NV (ang. copy number variation) lternatywny splicing Metylacja DN

5 Mikromacierze cdn Sondy: Krótkie sekwencje ekspresyjne ES (ang. expressed sequence tag) Sekwencje cdn otrzymane po odwrotnej transkrypcji Każda sonda powstaje oddzielnie Powstałe sondy nanoszone są na płytkę Dostępne są biblioteki klonów i komercyjne zestawy

6 kanka kontrolna kanka badana Ogólny przebieg eksperymentu Mikromacierz ekspresyjna Izolacja mrn Odwrotna transkrypcja Znakowanie cdn yanine-5 (y5) yanine-3 (y3) Hybrydyzacja z sondami na mikromacierzy Odczyt i interpretacja wyników naliza danych

7 Odczyt i interpretacja wyników naliza danych Ekspresja tylko w tkance kontrolnej Ekspresja tylko w tkance badanej Porównywalna ekspresja w obu tkankach

8 Expression profiling of HS27 newborn foreskin fibroblasts upon red light irradiation by using a 10,000 human cdn microarray. () Microarray image overlapping y3 (control) and y5 (sample) fluorescence images. (B) n enlarged region of the microarray image. () (D) Summary of the microarray data. Statistical analysis of microarray data. Song i in. 2003

9 statyczne sondy immobilozowane na płytce, np. chipy DN (ang. enehips) Mikromacierze typu statycznego. Źródło:

10

11

12

13

14

15 przepływowe sondy zakotwiczone w ziarnach swobodnie pływających w roztworze (ang. bead arrays) Znakowanie i identyfikacja ziaren. Źródło:

16 Bead hip BovineSNP50 Beadhip v1 (54001 sond) i v2 (54609 sond) Schemat obrazujący budowę mikromacierzy Bead hip

17 Ogólny przebieg eksperymentu Dzień 1 mplifikacja DN podczas inkubacji izotermalnej Dzień 2 Dzień 3 Fragmentacja produktu amplifikacji podczas procesu kontrolowanego enzymatycznie Wytrącanie DN Zawieszanie DN w buforze do hybrydyzacji Hybrydyzacja próby z sondami umieszczonymi na powierzchni mikromacierzy Beadhip Przemywanie Beadhip Dobudowanie nukleotydu do sondy zgodnie z sekwencją badanej próby DN oraz wybarwianie Skanowanie i odczyt wyników

18 Dzień 1 mplifikacja DN podczas inkubacji izotermalnej Inkubacja 20-24h w temperaturze 37 w piecu hybrydyzacyjnym (Hybridization Oven, Illumina ). Dzień 2 Fragmentacja produktu amplifikacji podczas procesu kontrolowanego enzymatycznie Inkubacja 1h w temperaturze 37 w bloku grzejnym Hybex Microsample Incubator (Sciene, US) z wkładem MIDI Heat Block Insert (Illumina )

19 Dzień 2 Wytrącanie DN Zawieszanie DN w buforze do hybrydyzacji Worteks (High Speed Microplate Shaker, Illumina) Wirówka do płytek z możliwością chłodzenia (entrifuge 5804R, Eppendorf) Odwrócona płytka zawierająca wytrącony DN (niebieski osad) w trakcie suszenia Zdjęcie pochodzi z Infinium II ssay Multi-Sample Protocols (Illumina )

20 Dzień 2 Hybrydyzacja próby z sondami umieszczonymi na powierzchni mikromacierzy Beadhip Uszczelka do komory hybrydyzacyjnej (Hyb hamber askets, Illumina ) Komora hybrydyzacyjna (Beadhip Hyb hamber, Illumina ) Inserty do komory hybrydyzacyjnej (Beadhip Hyb hamber inserts, Illumina ) Zdjęcia pochodzą z Infinium II ssay Multi-Sample Protocols (Illumina )

21 Dzień 2 Hybrydyzacja próby z sondami umieszczonymi na powierzchni mikromacierzy Beadhip BovineSNP50 Beadhip Illumina

22 Dzień 3 Przemywanie Beadhip Przygotowanie mikromacierzy Beadhip do kolejnego etapu Zdjęcia pochodzą z Infinium II ssay Multi-Sample Protocols (Illumina )

23 Dzień 3 Dobudowanie nukleotydu do sondy zgodnie z sekwencją badanej próby DN e-flow, EN, Szwajcaria Zdjęcia pochodzą z Infinium II ssay Multi- Sample Protocols (Illumina ) Znakowanie fluorescencyjne dobudowanych nukleotydów Zdjęcia pochodzą z Infinium II ssay Multi-Sample Protocols (Illumina )

24 Sample 1 Sample 2 Sample 3 Dzień 3 Dobudowanie nukleotydu do sondy zgodnie z sekwencją badanej próby DN oraz znakowanie go fluorescencyjnie

25 Dzień 3 Skanowanie i odczyt wyników Skanowanie mikromacierzy: HiScanSQ, Illumina Odczyt wyników: enomestudio M, Illumina Zdjęcia pochodzą ze strony

26 SNP raph pokazujący prawidłowy podział na klastry. SNP raphs pokazujące błędny podział na klastry. zarne kropki oznaczają próbki zaklasyfikowane "No alls"

27 Podstawowe informacje uzyskane po analizie mikromacierzy: Zdjęcia pochodzą z enomestudio M enotyping Module v1.0 User uide

28 Przykłady badań z wykorzystaniem mikromacierzy

29

30

31 Wykorzystanie mikromacierzy DN w badaniach populacji dzikich zwierząt Zastosowanie panelu sond opracowanego dla gatunków modelowych lub użytkowych: naliza zmienności genetycznej, określenie struktury populacji Wyszukiwanie różnic na poziomie molekularnym między gatunkami lub między populacjami w obrębie jednego gatunku Identyfikacja gatunków Badania asocjacyjne

32 Zastosowano mikromacierz OvineSNP50 Beadhip ( SNPs) muflon kanadyjski (Ovis canadensis) muflon Dalla (Ovis dalli) Pomyślnie zgenotypowano markery 570 markerów polimorficznych Fot. Lon Lauber Pomyślnie zgenotypowano markery 330 markerów polimorficznych Miller i wsp. 2011

33 W obrębie gatunku Muflona kanadyjskiego analizowano dwie populację: Ram Moutain Wyoming nalizy pozwoliły na jednoznaczne rozróżnienie osobników z dwóch populacji, ponadto stwierdzono występowanie podgrup w populacji Ram Moutain Miller i wsp. 2011

34 Zastosowano mikromacierz BovineSNP50 Beadhip ( SNPs) kozica alpejska (Rupicapra rupicapra rupicapra) Libor Hudík 4 osobniki (3 z obszarów wysokogórskich i 1 z obszarów Niżnych atr) P. Dubois 3 osobniki z pasma górskiego Wielka Fatra 3 osobniki z płaskowyżu Słowacki Raj Demontis i wsp. 2011

35 ylko 505 markerów okazało się polimorficznych, wytypowano 48 SNPs do analizy struktury genetycznej badanej grupy zwierząt naliza struktury genetycznej wykonana w programie Structure. Każdy z osobników reprezentowany jest przez pionowy słupek. Kolory odpowiadają oszacowanym proporcjom udziału w konkretnej populacji.

36 Zastosowano mikromacierz BovineSNP50 Beadhip ( SNPs) jeleń wirginijski (Odocoileus virginianus) Max llen D. Busby

37 nalizując wspólnie wszystkie zwierzęta otrzymano 1068 polimorficznych markerów: 639 SNPs u mulaka 634 SNPs u jelenia czarnoogonowego 599 SNPs u jelenia wirginijskiego W wyniku analizy struktury genetycznej wszystkich zwierząt w programie Structure, otrzymano dwa klastry (mulak i jeleń czarnoogonowy zgrupowane wspólnie, jeleń wirginijski w oddzielnej grupie ) Powtórzona analiza z wyłączeniem jelenia wirginijskiego, wykazała różnice między podgatunkami Odocoileus hemionus

38 Demontis D., zarnomska S. D., Hajkova P., Zemanova B., Bryja J., Loeschcke V., Pertoldi haracterization of 151SNPs for population structure analysis of the endangered atra chamois (Rupicapra rupicapra tatrica) and its relative, the lpine chamois (R. r. rupicapra). Mammalian Biology 76, Formanowicz Piotr, Radosław Urbaniak, Luiza Handschuh, Dorota Formanowicz, Marek Figlerowicz. Mikromacierze DN zasady projektowania sond. Biotechnologia 4 (83) Haynes.D., Latch E. K Identification of Novel Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs) in Deer (Odocoileus spp.) Using the BovineSNP50 Beadhip. PLoS ONE Volume 7, Issue 5, e36536 Jaros S. Mikromacierze DN i ich wykorzystanie w parazytologii i medycynie. Wiadomooeci Parazytologiczne 2006, 52(1),13 29 Miller J. M., Poissant J., Kijas J.W., oltman D.W genome-wide set of SNPs detects population substructure and long range linkage disequilibrium in wild sheep. Molecular Ecology Resources 11, Shipeng Song, Yaou Zhang, hi-hun Fong, hi-hung sang, Zhong Yang, Mengsu Yang, cdn Microarray nalysis of ene Expression Profiles in Human Fibroblast ells Irradiated with Red Light, In Journal of Investigative Dermatology, Volume 120, Issue 5, 2003, Pages