2. ZNACZENIE KLINICZNE

Transkrypt

1 PLATELIA Toxo IgG 1 płytka TEST IMMUNOENZYMATYCZNY DO ILOŚCIOWEGO WYKRYWANIA PRZECIWCIAŁ KLASY IgG PRZECIWKO TOXOPLASMA GONDII W LUDZKIEJ SUROWICY LUB OSOCZU /11 1. ZASTOSOWANIE Platelia Toxo IgG jest pośrednim testem immunoenzymatycznym ELISA do ilościowego oznaczania przeciwciał IgG Toxoplasma gondii w ludzkiej surowicy lub osoczu. 2. ZNACZENIE KLINICZNE T. gondii jest pierwotniakiem wywołującym zakażenia u licznych gatunków ssaków i ptaków. Toksoplazmoza występująca u ludzi i zwierząt przeważnie przebiega bezobjawowo. Częstość występowania zakażeń w danej populacji, wykrywanych metodami serologicznymi, waha się w różnych krajach i zależy od wieku badanych. Toksoplazmoza ciężarnych może powodować poważne zaburzenia rozwoju płodu (zwłaszcza uszkodzenie funkcji mózgu), a czasami prowadzić do obumarcia płodu. Wykrycie przeciwciał IgG przeciw T. gondii u kobiet przed zapłodnieniem pozwala uzyskać pewność ochrony płodu przed zakażeniem wrodzonym, w przypadku wystąpienia toksoplazmozy w czasie ciąży. Skłonność do występowania toksoplazmozy o ostrym przebiegu występuje u chorych z nabytym zespołem niedoboru odporności (AIDS) oraz u innych osób z immunosupresją. Zakażenia te są najczęściej spowodowane reaktywacją cyst pierwotniaka, obecnych w organizmie chorego przed zakażeniem wirusem HIV. Diagnostyka zakażenia T. gondii może być skomplikowana, a izolacja pasożyta jest rzadka. Serologiczne potwierdzenie występowania przeciwciał przeciwko T. gondii świadczy o kontakcie z pasożytem i jest powszechnie akceptowane w celu określenia statusu immunologicznego pacjenta i podatności na zakażenie. Wykrywanie poszczególnych izotypów pomaga określić czas zakażenia T. gondii i zastosowanie odpowiedniego leczenia w przypadku niedawnej infekcji lub propozycję profilaktyki, obejmującej zalecenia higieniczno-dietetyczne dla kobiet w ciąży lub chemioprofilaktykę pacjentów z upośledzoną odpornością. 3. ZASADA TESTU Platelia Toxo IgG jest pośrednim testem immunoenzymatycznym ELISA do wykrywania i oznaczania miana przeciwciał klasy IgG przeciw Toxoplasma gondii w ludzkiej surowicy lub osoczu. Do opłaszczenia mikropłytki stosowany jest antygen T. gondii. Jako koniugat używane jest znakowane peroksydazą przeciwciało monoklonalne przeciwko ludzkim łańcuchom gamma (anty-igg). Wykonanie oznaczenia obejmuje następujące etapy: Etap 1 Próbki od pacjentów i kalibratory są rozcieńczane w stosunku 1/21, a następnie przenoszone do studzienek mikropłytki. W czasie 1 godziny inkubacji w temperaturze 37 C, przeciwciała IgG T. gondii obecne w próbce wiążą się z antygenem T. gondii opłaszczonym na studzienkach mikropłytki. Po inkubacji niezwiązane, nieswoiste przeciwciała oraz inne białka surowicy są usuwane przez wymywanie. 1

2 Etap 2 Koniugat (znakowane peroksydazą przeciwciało monoklonalne przeciwko ludzkim łańcuchom gamma) jest dodawany do studzienek mikropłytki. W czasie 1 godziny inkubacji w temperaturze 37 C, znakowane przeciwciało wiąże się z IgG surowicy związanym przez antygen T. gondii. Niezwiązany koniugat jest usuwany przez wymywanie na końcu inkubacji. Etap 3 Obecność kompleksów immunologicznych (antygen T. gondii, przeciwciała IgG T. gondii, koniugat anty-igg) jest wykazywana przez dodanie roztworu substratu dla enzymu do każdej studzienki. Etap 4 Po inkubacji w temperaturze pokojowej ( C) reakcja enzymatyczna jest zatrzymywana przez dodanie 1N roztworu kwasu siarkowego. Odczyt optycznej gęstości uzyskiwany przy pomocy spektrofotometru ustawionego na 450/620 nm jest proporcjonalny do ilości przeciwciał IgG T. gondii obecnych w próbce i jest przeliczany na IU/ml przy pomocy krzywej standardowej skalibrowanej zgodnie z Międzynarodowym Standardem TOX-M WHO (WHO International Standard TOX-M). 4. SKŁAD ZESTAWU Odczynniki wystarczają na wykonanie 96 oznaczeń. Wszystkie odczynniki zestawu służą wyłącznie do diagnostyki in vitro. Etykieta Postać odczynnika Opakowanie R1 Mikropłytka Mikropłytka (gotowa do użytku): 1 12 pasków z 8 łamanymi studzienkami opłaszczonymi inaktywowanym antygenem T. gondii R2 Skoncentrowany Skoncentrowany roztwór do płukania (20x): 1 x 70 ml roztwór do Bufor TRIS-NaCl (ph 7,4), 2% Tween 20 płukania (20x) Konserwant: 0,04% ProClin 300 R3 Kalibrator 0 Kalibrator 0: 1 x 0,75 ml Ludzka surowica, ujemna pod względem przeciwciał anty-t.gondii, oraz ujemna pod względem antygenu powierzchniowego wirusa hepatitis B (HBs-Ag) i przeciwciał anty-hiv1, anty-hiv2 i anty-hcv Konserwant: 0,098% ProClin 300 R4a Kalibrator 6 Kalibrator 6 IU/ml: 1 x 0,75 ml Ludzka surowica, dodatnia pod względem przeciwciał IgG anty-t.gondii, oraz ujemna pod względem antygenu powierzchniowego wirusa hepatitis B (HBs- Ag) i przeciwciał anty-hiv1, anty-hiv2 i anty-hcv Konserwant: 0,098% ProClin 300 R4b Kalibrator 60 Kalibrator 60 IU/ml: 1 x 0,75 ml Ludzka surowica, dodatnia pod względem przeciwciał IgG anty-t.gondii, oraz ujemna pod względem antygenu powierzchniowego wirusa hepatitis B (HBs- Ag) i przeciwciał anty-hiv1, anty-hiv2 i anty-hcv Konserwant: 0,098% ProClin 300 R4c Kalibrator 240 Kalibrator 240 IU/ml: Ludzka surowica, dodatnia pod względem przeciwciał IgG anty-t.gondii, oraz ujemna pod względem antygenu powierzchniowego wirusa hepatitis B (HBs- Ag) i przeciwciał anty-hiv1, anty-hiv2 i anty-hcv Konserwant: 0,098% ProClin x 0,75 ml R6 Koniugat (51x) Koniugat (51x): Mysie przeciwciała monoklonalne przeciwko ludzkim IgG, znakowane peroksydazą chrzanu Konserwant: 0,159% ProClin x 0,7 ml 2

3 R7 Rozcieńczalnik Rozcieńczalnik do próbek i koniugatu (gotowy do użytku): Tris-NaCl (ph 7,7), glicerol, 0,1% Tween 20, czerwień fenolowa Konserwant: 0,148% ProClin 300 R9 Chromogen TMB Chromogen (gotowy do użytku): 3,3,5,5 czterometylobenzydyna (< 0,1%), H2O2 R10 Roztwór zatrzymujący reakcję (<1%) Roztwór zatrzymujący reakcję (gotowy do użytku): Roztwór 1N kwasu siarkowego 1 x 100 ml 1 x 28 ml 1 x 28 ml Informacje dotyczące warunków przechowywania i daty ważności znajdują się na opakowaniu. 5. ZALECENIA DLA UŻYTKOWNIKA Wiarygodność wyników zależy od przestrzegania zasad Dobrej Praktyki Laboratoryjnej: Nie używać przeterminowanych odczynników. Podczas jednego oznaczenia używać wyłącznie odczynników o tym samym numerze serii. UWAGA: W przypadku roztworu do płukania (R2, etykieta: 20x koloru zielonego), chromogenu (R9, etykieta: TMB koloru turkusowego) oraz roztworu zatrzymującego reakcję (R10, etykieta: 1N koloru czerwonego), możliwe jest użycie innych serii niż zawarte w zestawie, pod warunkiem, że odczynniki te są identyczne i w danym badaniu używana jest ta sama seria. UWAGA: Używanie rozcieńczalnika (R7) z innych serii niż seria dostarczona w zestawie jest zabronione. Zabrania się również używać rozcieńczalnika (R7) dostarczonego w zestawach Platelia Toxo IgM (nr ref ). UWAGA: Dodatkowo w przypadku roztworu do płukania (R2, etykieta: 20x koloru zielonego), możliwe jest zmieszanie z dwoma innymi roztworami znajdującymi się w różnych zestawach odczynników Bio-Rad (R2, etykiety: 10x koloru niebieskiego lub 10x koloru pomarańczowego) przy prawidłowym ich rozcieńczeniu, pod warunkiem, że w danym badaniu używana jest tylko jedna mieszanina. Przed użyciem należy odczekać 30 minut, aby pozwolić odczynnikom osiągnąć temperaturę pokojową ( C). Ostrożnie rozcieńczyć lub rozpuścić odczynniki nie dopuszczając do zanieczyszczenia. Nie przeprowadzać testu w obecności reaktywnych oparów (kwasów, zasad i aldehydów) lub kurzu, które mogą wpłynąć na aktywność enzymatyczną koniugatu. Używać dokładnie umytych naczyń szklanych po przepłukaniu ich wodą dejonizowaną lub, jeśli to możliwe, naczyń jednorazowego użytku. Mycie mikropłytki jest bardzo ważnym etapem procedury: należy przeprowadzić zalecaną liczbę cykli mycia i upewnić się, że studzienki zostaną całkowicie wypełnione, a następnie całkowicie opróżnione. Nieprawidłowe mycie może być powodem błędnych wyników. Nie dopuszczać do wyschnięcia mikropłytek po zakończeniu mycia i przed wprowadzeniem odczynników. Nigdy nie używać tego samego pojemnika na koniugat i roztwór substratu, wywołujący reakcję barwną. Reakcja enzymatyczna jest bardzo wrażliwa na obecność metalu lub jonów metali. Z tego powodu nie można pozwolić na kontakt żadnego metalowego elementu z różnymi roztworami zawierającymi koniugat lub chromogen. Roztwór chromogenu (R9) powinien być bezbarwny. Pojawienie się niebieskiego koloru oznacza, że odczynnik nie nadaje się do użycia i należy go wymienić. Do każdej próbki należy używać nowej końcówki pipety. Należy skontrolować pipety i inny sprzęt pod względem dokładności i prawidłowego działania. 3

4 BEZPIECZEŃSTWO I HIGIENA PRACY Materiał pochodzenia ludzkiego użyty do przygotowania odczynników został przebadany i wykazał brak reaktywności w kierunku antygenu powierzchniowego wirusa zapalenia wątroby typu B (HBs Ag), przeciwciał przeciw wirusowi zapalenia wątroby typu C (anty-hcv) oraz wirusom ludzkiego niedoboru odporności (anty-hiv1 i anty-hiv2). Ponieważ nie ma metod absolutnie wykluczających obecność czynników zakaźnych, odczynniki pochodzące z materiału ludzkiego powinny być traktowane jako materiał potencjalnie zakaźny: Każdy materiał, łącznie z roztworami do płukania, który wejdzie w bezpośredni kontakt z próbkami i odczynnikami zawierającymi materiał pochodzenia ludzkiego, należy traktować jako potencjalnie zakaźny. Podczas pracy z próbkami i odczynnikami należy używać rękawiczek jednorazowych. Nie pipetować ustami. Unikać rozlewania próbek lub roztworów zawierających próbki. Miejsca, w których nastąpiło rozlanie należy przepłukać wybielaczem rozcieńczonym do 10%. W przypadku rozlania kwasu, należy go najpierw zneutralizować wodorowęglanem sodu, a następnie przemyć miejsce rozlania wybielaczem rozcieńczonym do 10% i osuszyć papierem chłonnym. Materiał użyty do czyszczenia należy wyrzucić do pojemnika ze skażonymi odpadami. Próbki pacjentów, odczynniki zawierające materiał pochodzenia ludzkiego oraz skażony materiał i produkty należy wyrzucać dopiero po ich odkażeniu: - przez zanurzenie w wybielaczu w stężeniu 5% podchlorynu sodu na 30 minut - lub przez sterylizacje w autoklawie w 121 C przez co najmniej 2 godziny. UWAGA: Nie wprowadzać do autoklawu roztworów zawierających podchloryn sodu Unikać kontaktu ze skórą i błoną śluzową wszelkich odczynników, również tych uważanych za bezpieczne. Chemiczne i biologiczne pozostałości należy traktować i utylizować zgodnie z dobrymi praktykami laboratoryjnymi. W celu zapoznania się z zaleceniami dotyczącymi zagrożeń i środków ostrożności związanych z niektórymi substancjami chemicznymi zawartymi w niniejszym zestawie należy skorzystać z piktogramów wskazujących rodzaj zagrożenia znajdujących się na etykietach i w informacjach zamieszczonych na końcu instrukcji obsługi. Karta charakterystyki jest dostępna na stronie internetowej 6. PRÓBKI 1. Zalecanymi typami próbek są surowica i osocze (EDTA, heparyna lub cytrynian). 2. Podczas przetwarzania, przechowywania i pracy z próbkami krwi należy stosować się do poniższych zaleceń: Próbki krwi należy pobrać zgodnie z rutynową procedurą, z wkłucia dożylnego. Próbki surowicy pozostawić do powstania skrzepu przed odwirowaniem. Próbówki z próbkami przez cały czas powinny być zamknięte. Po odwirowaniu jak najszybciej oddzielić surowicę lub osocze od czerwonych krwinek i przenieść do szczelnie zamykanej próbówki. Jeśli test będzie wykonany w ciągu 7 dni, próbki można przechować w temp C. Jeśli test będzie wykonany później, lub próbki będą transportowane, należy je zamrozić w temp. -20 C lub niższej. Nie należy używać próbek, które zostały rozmrożone więcej niż pięć razy. Wcześniej zamrożone próbki powinny być po rozmrożeniu dokładnie zmieszane (vortex) przed przystąpieniem do oznaczenia. 3. Próbki zawierające 90 g/l albuminy lub 100 mg/l wolnej bilirubiny, próbki lipemiczne zawierające ekwiwalent 36 g/l oleiny (trójglicerydu) oraz hemolizowane próbki zawierające do 10 g/l hemoglobiny nie mają wpływu na wyniki. 4. Nie należy podgrzewać próbek. 4

5 7. PROCEDURA OZNACZENIA 7.1 Wymagane materiały, które nie znajdują się w zestawie Worteks. Czytnik mikropłytek wyposażony w filtry 450 nm i 620 nm (*). Inkubator mikropłytek ustawiony termostatycznie na 37±1 C (*). Automatyczna, półautomatyczna lub ręczna płuczka mikropłytek (*). Jałowa woda destylowana lub dejonizowana. Rękawiczki jednorazowego użytku. Gogle lub okulary ochronne. Papier chłonny. Automatyczne lub półautomatyczne pipety lub multipipety regulowane lub ze stałym ustawieniem do odmierzania i wprowadzania od 10 µl do 1000 µl, oraz 1 ml, 2 ml i 10 ml. Cylindry z podziałką pojemności 25 ml, 50 ml, 100 ml i 1000 ml. Podchloryn sodu (wybielacz) i wodorowęglan sodu. Pojemnik na odpady niebezpieczne dla człowieka i środowiska. Probówki jednorazowego użytku. (*) Szczegółowe informacje na temat zalecanego sprzętu można uzyskać kontaktując się z działem technicznym naszej firmy. 7.2 Rozcieńczanie odczynników R1: Przed otwarciem pozostawić torebkę na 30 minut w temperaturze pokojowej ( C). Wyciągnąć ramkę, niewykorzystane paski natychmiast schować z powrotem do torebki i sprawdzić obecność środka osuszającego. Dokładnie zamknąć ponownie torebkę i przechowywać w temperaturze +2-8 C. R2: Rozpuścić roztwór do płukania R2 w stosunku 1/20 w wodzie destylowanej: na przykład 50 ml R2 i 950 ml wody destylowanej w celu otrzymania gotowego do użytku roztworu do płukania. Przygotować 350 ml rozcieńczonego roztworu do płukania dla jednej płytki z 12 paskami w przypadku mycia manualnego. R3, R4a, R4b, R4c: Rozcieńczyć w rozcieńczalniku (R7) w stosunku 1/21 (przykład: 300 µl R µl kalibratora). R6+R7: Koniugat (R6) jest koncentratem 51x i przed użyciem musi być poddany homogenizacji. Rozcieńczyć w rozcieńczalniku (R7) w stosunku 1/51. Dla jednej płytki rozcieńczyć 0,5 ml koniugatu (R6) w 25 ml rozcieńczalnika (R7). Podzielić objętości przez 10, aby otrzymać objętość potrzebną dla jednego paska. 7.3 Przechowywanie i okres przydatności otwartych i/lub rozcieńczonych odczynników Pod warunkiem przechowywania przed otwarciem w temperaturze +2-8 C, każdy składnik może zostać użyty do upływu daty przydatności umieszczonej na zewnętrznej etykiecie zestawu. R1: Po otwarciu paski pozostaną stabilne do 8 tygodni, jeśli przechowywane będą w temperaturze +2-8 C w tej samej dokładnie zamkniętej torebce (sprawdzić obecność środka osuszającego). R2: Po rozcieńczeniu roztwór do płukania może być przechowywany do 2 tygodni w temperaturze C. Po otwarciu skoncentrowany roztwór do płukania przechowywany w temperaturze C przy braku zanieczyszczeń pozostanie stabilny do upływu daty przydatności oznaczonej na etykiecie. R3, R4a, R4b, R4c, R6, R7: Po otwarciu i przy braku zanieczyszczeń odczynniki przechowywane w temperaturze +2-8 C pozostaną stabilne do 8 tygodni. R6+R7: Po rozcieńczeniu roboczy roztwór koniugatu pozostanie stabilny przez 8 godzin w temperaturze pokojowej ( C) lub przez 2 tygodnie w temperaturze +2-8 C. R9: Po otwarciu i przy braku zanieczyszczeń odczynnik przechowywany w temperaturze +2-8 C pozostanie stabilny do 8 tygodni. R10: Po otwarciu i przy braku zanieczyszczeń odczynnik przechowywany w temperaturze +2-8 C pozostanie stabilny do upływu daty przydatności oznaczonej na etykiecie. 5

6 7.4 Procedura Należy bezwzględnie przestrzegać procedury oznaczenia i zasad Dobrej Praktyki Laboratoryjnej. Przed użyciem należy pozwolić odczynnikom osiągnąć temperaturę pokojową ( C). Użycie odłamywalnych studzienek wymaga szczególnej uwagi podczas pracy z nimi. Podczas każdego cyklu należy użyć wszystkich kalibratorów w celu weryfikacji wyników testu. 1. Dokładnie ustalić plan wprowadzania i identyfikacji kalibratorów i próbek pacjenta. 2. Przygotować rozcieńczony roztwór do czyszczenia (R2) [patrz: punkt 7.2]. 3. Wyjąć ramkę i paski (R1) z opakowania [patrz: punkt 7.2]. 4. W oznakowanych probówkach rozcieńczyć kalibratory R3, R4a, R4b i R4c oraz próbki pacjentów (S1, S2 ) w rozcieńczalniku (R7) w stosunku 1/21: 300 µl rozcieńczalnika (R7) i 15 µl próbki [patrz: punkt 7.2]. Wymieszać rozcieńczone próbki. 5. Nanieść rozcieńczone kalibratory i próbki po 200 l do każdego dołka, ściśle wg podanego schematu: A R3 S5 S13 B R4a S6 C R4b S7 D R4c S8 E S1 S9 F S2 S10 G S3 S11 H S4 S12 6. Przykryć mikropłytkę folią adhezyjną i mocno docisnąć do płytki w celu zapewnienia szczelności. Natychmiast przystąpić do inkubacji mikropłytki w łaźni wodnej kontrolowanej termostatem lub w suchym inkubatorze przez 1 godzinę 5 minut w temperaturze 37 C 1 C. 7. Przed zakończeniem pierwszego okresu inkubacji przygotować roboczy roztwór koniugatu (R6+R7) [patrz: punkt 7.2]. 8. Po zakończeniu inkubacji zdjąć folię. Zaaspirować zawartość wszystkich studzienek do pojemnika na odpady zakaźne (zawierającego podchloryn sodu). Przemyć mikropłytkę 4 razy 350 µl roztworu do płukania (R2). Odwrócić mikropłytkę i delikatnie ostukać na papierze chłonnym w celu usunięcia pozostałej ilości płynu. 9. Natychmiast dodać 200 µl roboczego roztworu koniugatu (R6+R7) do wszystkich studzienek. Przed użyciem roztworu należy nim delikatnie wstrząsnąć. 10. Przykryć mikropłytkę folią adhezyjną i mocno docisnąć do płytki w celu zapewnienia szczelności. Natychmiast przystąpić do inkubacji mikropłytki w łaźni wodnej kontrolowanej termostatem lub w suchym inkubatorze przez 1 godzinę 5 minut w temperaturze 37 C 1 C. 11. Po zakończeniu inkubacji zdjąć folię. Zaaspirować zawartość wszystkich studzienek do pojemnika na odpady zakaźne (zawierającego podchloryn sodu). Przemyć mikropłytkę 4 razy 350 µl roztworu do czyszczenia (R2). Odwrócić mikropłytkę i delikatnie ostukać na papierze chłonnym w celu usunięcia pozostałej ilości płynu. 12. Szybko dodać 200 µl roztworu chromogenu (R9) do każdej studzienki z dala od światła. Pozwolić reakcji przebiegać w ciemności przez 30 ± 5 minut w temperaturze pokojowej ( C). W czasie tej inkubacji nie używać folii adhezyjnej. 13. Zatrzymać reakcję enzymatyczną przez dodanie 100 µl roztworu zatrzymującego reakcję (R10) do każdej studzienki. Zastosować tę samą sekwencję i szybkość wprowadzania jak w przypadku roztworu preparatu enzymatycznego. 14. Ostrożnie przetrzeć dolną stronę płytki. Odczytać gęstość optyczną przy 450/620 nm korzystając z czytnika płytki w ciągu 30 minut po zatrzymaniu reakcji. Przed dokonaniem odczytu paski muszą znajdować się ciągle z dala od światła. 15. Przed wydaniem wyników należy sprawdzić zgodność odczytu z planem dystrybucji płytki i próbek. 6

7 8 INTERPRETACJA WYNIKÓW 8.1 Wykreślanie standardowej krzywej Występowanie i poziom przeciwciał IgG przeciwko T.gondii w badanej próbce określa porównanie gęstości optycznej (OD) próbki z wartością OD standardów. Test Platelia Toxo IgG jest skalibrowany wg Standardu WHO (TOX M 185). Dla tej samej surowicy badanej różnymi metodami serologicznymi możliwe jest uzyskanie niezgodnych wyników miana. Rozbieżności te są wynikiem różnych proporcji rozpuszczalnych antygenów błonowych T.gondii, zastosowanych w poszczególnych testach. Standardową krzywą (gęstość optyczna = funkcja (IU/ml)] należy wykreślić zaznaczając odczyty OD kalibratorów R3, R4a, R4b, R4c w osi pionowej (OY), i podając stężenie w IU/ml w osi poziomej (OX). Dla każdej badanej próbki należy obliczyć stężenie przeciwciał anty-t. gondii IgG poprzez odczyt wartości z osi OX dla uzyskanego odczytu OD. 8.2 Kontrola jakości Dla każdej mikropłytki i każdego cyklu należy uwzględnić wszystkie kalibratory i przeanalizować uzyskane wyniki. W celu weryfikacji testu należy spełnić następujące kryteria: Wartości gęstości optycznej: OD R4a 0,200 OD R4b 0,400 Stosunki gęstości optycznej: OD R4a / OD R3 5,00 OD R4b / OD R4a 2,20 OD R4c / OD R4b 1,15 Jeśli te kryteria kontroli jakości nie zostaną spełnione, należy powtórzyć test. 8.3 Interpretacja wyników Miano przeciwciał anty-t. gondii (Jednostki międzynarodowe/ml) Stężenie < 6 IU/ml Wynik Negatywny 6 IU/ml Stężenie < 9 IU/ml Niejednoznaczny Stężenie 9 IU/ml Pozytywny Interpretacja Negatywny lub niejednoznaczny wynik wskazuje na brak nabytej odporności, ale nie może wykluczyć niedawnej infekcji. Jeśli podejrzewana jest niedawna infekcja pacjenta, należy zbadać drugą próbkę około dwóch tygodni później. Pozytywny wynik zazwyczaj wskazuje na infekcję w przeszłości. Jednak nie można wykluczyć niedawnej infekcji, zwłaszcza, jeśli obecne są przeciwciała anty-t. gondii IgM. Większą różnorodność stężeń można zaobserwować powyżej wartości 200 IU/ml. 8.4 Rozwiązywanie problemów Wyniki nie spełniające kryteriów walidacji i niepowtarzalne reakcje są często powodowane przez: Niedokładne przemycie mikropłytek. Zanieczyszczenie negatywnych próbek surowicą lub osoczem o wysokim stężeniu przeciwciał. Zanieczyszczenie roztworu preparatu enzymatycznego chemicznymi odczynnikami utleniającymi (wybielacz, jony metalu...). Zanieczyszczenie roztworu zatrzymującego reakcję. 7

8 9 CHARAKTERYSTYKA TESTU Charakterystyka testu Platelia Toxo IgG została oceniona w 2 ośrodkach przy użyciu w sumie 1310 próbek od kobiet ciężarnych i dawców krwi. W jednym ośrodku przeprowadzono badanie porównawcze przy użyciu testu Platelia Toxo IgG TMB (72741) metodą manualną. W drugim ośrodku własności testu Platelia Toxo IgG oceniono w porównaniu do testu Platelia Toxo IgG TMB (72741) użytego w automatycznym analizatorze mikropłytek EIA. 9.1 Prewalencja Występowanie przeciwciał anty-toxoplasma gondii IgG zostało oznaczone przy pomocy produktu Platelia Toxo IgG na panelu 538 próbek głównie od kobiet ciężarnych z Paryża i okolic (Francja), monitorowanych w czasie ciąży. 128 próbek dało pozytywny wynik na obecność przeciwciał antytoksoplazma IgG. Prewalencja oznaczona przy pomocy testu Platelia Toxo IgG została określona na 23,8% (128/538). 9.2 Badanie porównawcze (Ośrodek 1) Charakterystyki testu Platelia Toxo IgG dokonano na panelu 745 próbek pogrupowanych w następujący sposób: 606 próbek surowicy od dawców krwi 139 próbek surowicy od kobiet w ciąży Wyniki zostały porównane z tymi uzyskanymi przy pomocy testu Platelia Toxo IgG TMB (72741) uznanego za źródło odniesienia. Platelia Toxo IgG (72840) Platelia Toxo IgG TMB (72741) Negatywny Wątpliwy* Pozytywny Suma Negatywny Wątpliwy* Pozytywny Suma Zgodność całkowita: 743/ % [IC 95% = 99,5% - 100,0%] Swoistość względna: 365/ % [IC 95% = 99,0% - 100,0%] Czułość względna: 378/ % [IC 95% = 99,0% - 100,0%] *Wątpliwe próbki nie zostały włączone do obliczeń czułości, swoistości i zgodności. [IC95%] = 95% przedział ufności 9.3 Wydajność (ośrodek 2) Badanie prospektywne przeprowadzono na 538 próbkach głównie od kobiet ciężarnych monitorowanych w czasie ciąży badanych z użyciem rutynowych procedur laboratoryjnych. Próbki te przetestowano równolegle testami Platelia Toxo IgG i Platelia Toxo IgG TMB (72741). Dodatkowo wszystkie próbki od nieznanych pacjentów w bazie danych laboratorium o stężeniu mniejszym niż 100 IU/ml były kontrolowane przez zastosowanie drugiej metody: Czuła aglutynacja (antygen laboratoryjny: T. gondii, szczep RH) dla próbek surowicy o stężeniu > 10 UI/ml. Pośrednia immunofluorescencja (antygen laboratoryjny: T. gondii, szczep RH) dla próbek surowicy o stężeniu między 3 i 10 UI/ml. Wyniki zostały porównane z tymi uzyskanymi przy pomocy testu Platelia Toxo IgG TMB (72741) uznanego za źródło odniesienia. 8

9 Platelia Toxo IgG TMB (72741) Negatywny Wątpliwy* Pozytywny Suma Negatywny Platelia Toxo IgG (72840) Wątpliwy* Pozytywny Suma Zgodność całkowita: 517/524 98,7% [IC 95% = 97,3% -99,5%] Swoistość względna: 406/413 98,3% [IC 95% = 96,5% -99,3%] Czułość względna: 111/ ,0% [IC 95% = 96,8% - 100,0%] *Wątpliwe próbki nie zostały włączone do obliczeń czułości, swoistości i zgodności. [IC95%] = 95% przedział ufności 7 próbek o rozbieżnych wynikach przy użyciu testu Platelia Toxo IgG uzyskało wyniki pozytywne przy użyciu metod uzupełniających używanych przez laboratorium (czuła aglutynacja, pośrednia immunofluorescencja). Dodatkowo przetestowano 9 paneli serokonwersji po 3 próbki przy użyciu testów Platelia Toxo IgG (72840) i Platelia Toxo IgG TMB (72741). Dla każdego panelu pierwsza próbka uzyskała wynik negatywny na obecność przeciwciał anty-toxoplasma gondii IgG i IgM. W 8 z 9 paneli serokonwersji oba testy dały identyczne wyniki. W jednym panelu druga próbka surowicy uzyskała wynik pozytywny przy użyciu testu Platelia Toxo IgG, ale wątpliwy przy użyciu testu Platelia Toxo IgG TMB. 9.4 Charakterystyka testu dla próbek krwi pępowinowej Przebadano 47 próbek krwi pępowinowej, wg. protokołu opisanego w 7.4 (rozcieńczenie próbki 1:21): 22 próbki z przypadków potwierdzonej toksoplazmozy wrodzonej 18 próbek z przypadków uprzednio przebytej toksoplazmozy matczynej 7 próbek bez infekcji Wszystkie próbki dla toksoplazmozy wrodzonej oraz przebytej infekcji matczynej dawały wynik dodatni w teście Platelia Toxo IgG (72840), przy jednoczesnym wyniku ujemnym w teście Platelia Toxo IgM (72841)dla próbek przebytej infekcji matczynej. Wszystkie 7 próbek z przypadków bez infekcji zostało potwierdzone jako ujemne. Platelia Toxo IgG (72840) Platelia Toxo IgM (72841) Dodatni Wątpliwy Ujemny Dodatni Wątpliwy Ujemny Toksoplazmoza wrodzona (n=22) Uprzednio przebyta infekcja matczyna (n=18) Ujemne (n=7)

10 9.5 Reaktywność krzyżowa Panel 197 próbek zawierający 159 próbek o wyniku pozytywnym dla różyczki, CMV, EBV, HSV, VZV, świnki, odry i HIV oraz 38 próbek o wyniku pozytywnym dla czynnika reumatoidalnego, autoprzeciwciał i przeciwciał heterofilnych został poddany testom Platelia Toxo IgG (72840) oraz Platelia Toxo IgG TMB (72741). 141 próbek uzyskało wynik negatywny, 55 próbek uzyskało wynik pozytywny i 1 próbka uzyskała wynik wątpliwy przy użyciu testu Platelia Toxo IgG. Wszystkie pozytywne próbki uzyskały również pozytywny wynik przy użyciu testu Platelia Toxo IgG TMB. 9.6 Precyzja Powtarzalność wewnątrz-testowa (powtarzalność): W celu oceny powtarzalności w ramach jednego testu przetestowano jedną próbkę o wyniku negatywnym i trzy próbki o wyniku pozytywnym 32 razy w ciągu tego samego cyklu. Dla każdej próbki określone zostało stężenie (IU/ml). Poniższa tabela zawiera średnie stężenie (IU/ml), standardowe odchylenie (SD) oraz współczynnik zmienności (%CV) każdej próbki: Powtarzalność Próbka słabo Próbka Próbka wysoko Próbka ujemna N=32 dodatnia dodatnia dodatnia Stężenie (IU/ml) Średnia 0,15 16,0 39,8 167,5 SD 0,01 2,3 2,7 23,1 %CV 7,2% 14,4% 6,9% 13,8% Powtarzalność pomiędzy-testowa (odtwarzalność): W celu oceny powtarzalności pomiędzy testami przetestowano cztery próbki (jedną próbkę o wyniku negatywnym i trzy próbki o wyniku pozytywnym) 20 razy w dwóch cyklach dziennie przez okres 20 dni. Dla każdej próbki określone zostało stężenie (IU/ml). Poniższa tabela zawiera średnie stężenie (IU/ml), standardowe odchylenie (SD) oraz współczynnik zmienności (%CV) każdej próbki: Odtwarzalność Próbka słabo Próbka Próbka wysoko N=80 Próbka ujemna dodatnia dodatnia dodatnia Stężenie (IU/ml) Średnia 0,15 15,2 41,7 166,5 SD 0,05 2,4 4,2 21,0 %CV 32,6% 15,5% 10,1% 12,6% 9.7 Dokładność i liniowość W celu oceny dokładności kalibracji przetestowano kilka roztworów Międzynarodowego Standardu TOX-M WHO. Uzyskane wyniki wykazały, że test Platelia TOXO IgG jest dokładnie skalibrowany, zgodnie z Międzynarodowym standardem TOX-M WHO dla wartości do 30 IU/ml. Powyżej 30 IU/ml, uzyskane wyniki są zaniżone o około 25 do 50%. Przy użyciu seryjnych rozcieńczeń 5 próbek dodatnich, ustalono zakres testu Platelia Toxo IgG między 7 i 200 UI/ml. 10 OGRANICZENIA PROCEDURY Rozpoznanie zakażenia T. gondii może być postawione wyłącznie na podstawie połączenia danych klinicznych i biologicznych. Wynik pojedynczego testu oznaczenia miana przeciwciał anty-t. gondii IgG nie stanowi dostatecznego dowodu, aby postawić diagnozę niedawnej infekcji Toxoplasma gondii. Diagnoza niedawnej infekcji może zostać postawiona wyłącznie na podstawie pełnych informacji na temat pacjenta, łącznie z danymi klinicznymi i biologicznymi (znaczny wzrost przeciwciał anty- T. gondii IgG w 2 próbkach surowicy pacjenta pobranych w odstępie 3 tygodni i przetestowanych w ramach tego samego cyklu, znacząca obecność anty-t. gondii IgM, niska awidność anty-t. gondii IgG). 10

11 Obecność przeciwciał anty-t. gondii IgM nie jest wystarczającym dowodem potwierdzającym niedawną infekcję, ponieważ IgM mogą utrzymywać się przez kilka miesięcy lub nawet lat po infekcji. Po wykryciu IgM należy przeprowadzić badanie ilościowe przeciwciał anty-t. gondii IgG oraz dalsze badanie ewolucji przeciwciał anty-t. gondii, przynajmniej na drugiej próbce surowicy pobranej trzy tygodnie później. Jeśli próbka zostanie poddana testowi zbyt wcześnie w czasie niedawnej infekcji pierwotnej, przeciwciała anty-t. gondii IgM mogą jeszcze nie być obecne. Jeśli istnieje podejrzenie zakażenia, należy pobrać drugą próbkę około 3 tygodni później i przeprowadzić na niej ponownie test na obecność IgM. 11 KONTROLA JAKOŚCI PRODUCENTA Wszystkie produkowane i wprowadzane do sprzedaży odczynniki są przygotowywane zgodnie z systemem jakości, poczynając od materiałów wyjściowych, aż do ostatecznego produktu komercyjnego. Odczynniki każdej serii podlegają oznaczeniu kontrolnemu, i są dopuszczane do użytkowania, jeśli spełniają wymagane kryteria. Odpowiednie protokoły produkcji i kontroli jakości każdej serii są przechowywane w firmie. 12 LITERATURA ANDERSON S.E. and REMINGTON J.S. : The diagnosis of toxoplasmosis. Southern Med. J. 1975; 68, DECOSTER A., DARCY F., CARON A., VINATIER D., HOUZE DE L AULNOIS D., VITTU G., NIEL G., HEYER F., LECOLIER B., DELCROIX M., MONNIER J.C., DUHAMEL M. and CAPRON A. : Anti-P30 IgA antibodies as prenatal markers of congenital Toxoplasma infection. 1992; 87, JENUM P.A., STRAY-PEDERSEN B., MELBY K.K., KAPPERUD G., WHITELAW A., ESKILD A. and ENG J. : Incidence of Toxoplasma gondii infection in pregnant women in Norway and pregnancy outcome for infected women. J. Clin.Microbiol. 1998; 36, JENUM P.A. and STRAY-PEDERSEN B. : Development of specific immunoglobulins G, M, and A following Toxo-plasma gondii infection in pregnant women in Norway and pregnancy outcome for infected women. J. Clin. Microbiol. 1998; 36, JENUM P.A., STRAY-PEDERSEN B. and GUNDERSEN A.G. : Improved Diagnosis of primary Toxoplasma gondii infection in early pregnancy by determination of anti-toxoplasma immunoglobulin G avidity. J. Clin. Microbiol ; 35, LECOLIER B. and PUCHEU : Usefulness of IgG avidity analysis for the diagnosis of toxoplasmosis. Path. Biol. 1993; 42, REMINGTON J.S. and DESMONTS G. : Toxoplasmosis in infectious disease of the fetus and newborn infant. JS Remington and JO Klein, eds. WB Saunders Co., Philadelphia 1976; SULHANIAN A., NUGUES C., GARIN J.F., PELLOUX H., LONGUET P., SLIZEWICZ B. and DEROUIN F. : Serodiagnosis of toxoplasmosis in patients with acquired or reactivating toxoplasmosis and analysis of the specific IgA antibody response by ELISA, agglutination and immunoblotting.immunol.infect. Dis. 1993; 3, WILSON M., REMINGTON J.S., CLAVET C., VARNEY G., PRESS C., WARE D. and the FDA TOXOPLASMOSIS AD HOC WORKING group : Evaluation of six commercial kits for detection of human immunoglobulin M. antibodies to Toxoplasma gondii. J. Clin. Microbiol. 1997; 35, WONG S.Y. and REMINGTON J.S. : Biology of Toxoplasma gondii. AIDS 1993; 7,

12 12

13 13

14 Bio-Rad 3, boulevard Raymond Poincare Marnes-la-Coquette - France Tel. : +33 (0) /11 Fax : +33 (0)