2- ZNACZENIE KLINICZNE

Transkrypt

1 PLATELIA TOXO IgA TMB 1 płytka TEST IMMUNOENZYMATYCZNY DO WYKRYWANIA PRZECIWCIAŁ KLASY IgA PRZECIWKO TOXOPLASMA GONDII W W LUDZKIEJ SUROWICY LUB OSOCZU /06 1- ZASTOSOWANIE Test Platelia Toxo IgA TMB jest zestawem do diagnostyki in vitro stosowanym w celu jakościowego oznaczania przeciwciał IgA przeciwko Toxoplasma gondii (T. gondii) w ludzkiej surowicy lub osoczu. 2- ZNACZENIE KLINICZNE T. gondii jest pierwotniakiem wywołującym zakażenia u licznych gatunków ssaków i ptaków. Toksoplazmoza występująca u ludzi i zwierząt przeważnie przebiega bezobjawowo. Częstość występowania zakażeń w danej populacji, wykrywanych metodami serologicznymi, waha się w różnych krajach i zależy od wieku badanych. Toksoplazmoza ciężarnych może powodować poważne zaburzenia rozwoju płodu (zwłaszcza uszkodzenie funkcji mózgu), a czasami prowadzić do obumarcia płodu. Wykrycie przeciwciał IgG przeciw T. gondii u kobiet przed zapłodnieniem pozwala uzyskać pewność ochrony płodu przed zakażeniem wrodzonym, w przypadku wystąpienia toksoplazmozy w czasie ciąży. Skłonność do występowania toksoplazmozy o ostrym przebiegu występuje u chorych z nabytym zespołem niedoboru odporności (AIDS) oraz u innych osób z immunosupresją. Zakażenia te są najczęściej spowodowane reaktywacją cyst pierwotniaka, obecnych w organizmie chorego przed zakażeniem wirusem HIV. Diagnostyka zakażenia T. gondii może być skomplikowana, a izolacja pasożyta jest rzadka. Serologiczne potwierdzenie występowania przeciwciał przeciwko T. gondii świadczy o kontakcie z pasożytem i jest powszechnie akceptowane w celu określenia statusu immunologicznego pacjenta i podatności na zakażenie. Wykrywanie poszczególnych izotypów pomaga określić czas zakażenia T. gondii i zastosowanie odpowiedniego leczenia w przypadku niedawnej infekcji lub propozycję profilaktyki, obejmującej zalecenia higienicznodietetyczne dla kobiet w ciąży, lub chemioprofilaktykę pacjentów z upośledzoną odpornością. 3- ZASADA TESTU PLATELIA Toxo IgA TMB jest pośrednim testem immunoenzymatycznym, w którym z fazą stałą wiązane są przeciwciała IgA (studzienki mikropłytki są opłaszczone przeciwciałami przeciwko ludzkim łańcuchom alfa). Znakowane peroksydazą monoklonalne przeciwciała specyficzne dla T. gondii, skierowane są przeciwko powierzchniowemu antygenowi białkowemu, PM , które jest jedną z głównych determinant odpowiedzi immunologicznej. Etap pierwszy Kontrole ujemna, cut-off i dodatnia oraz próbki rozcieńcza się w stosunku 1:101 (1:20 w przypadku surowic płodowych i noworodkowych) nanosi do studzienek mikropłytki. Podczas inkubacji przez 1 godzinę w temp. 37 C, obecne w próbce przeciwciała IgA przeciwko T.gondii wiążą się z fazą stałą. Po inkubacji, podczas płukania, zostają usunięte IgG i inne białka surowicy. Etap drugi Do studzienek nanosi się roztwór zawierający antygen T.gondii (T.gondii Ag, szczep RH) oraz monoklonalne przeciwciało przeciwko T.gondii skoniugowane z peroksydazą chrzanową (ACM-POD). Podczas inkubacji przez 1 godzinę w temp. 37 C, przeciwciała IgA anty-t.gondii występujące w próbce związane z fazą stałą zwiążą kompleks antygen - koniugat. Po inkubacji, nadmiar antygenu i koniugatu jest usuwany podczas płukania. Etap trzeci Wykrycie kompleksu (przeciwciało anty-iga na fazie stałej, przeciwciało IgA anty T.gondii, T.gondii Ag, koniugat anty-t.gondii Ag) następuje po dodaniu roztworu zawierającego substrat dla peroksydazy i chromogen wywołujący reakcję barwną,. Etap czwarty Po półgodzinnej inkubacji w temp. pokojowej (18-30 C) i dodaniu 1 N kwasu siarkowego następuje zatrzymanie reakcji enzymatycznej. Uzyskana przy długości fali 450/620 nm wartość OD, jest proporcjonalna do ilości przeciwciał IgA przeciwko T.gondii w badanej próbce. Obecność przeciwciał IgA przeciwko T.gondii określa się przez porównanie wartości OD próbki z wartością OD surowicy kontrolnej o wartości granicznej cut-off. 1

2 4- SKŁAD ZESTAWU Wszystkie odczynniki zestawu są przeznaczone wyłącznie do diagnostyki in vitro. R1 R2 R3 R4a R4b Etykietka Odczynnik Ilość Mikropłytka (gotowa do użycia): 12 pasków każdy po 8 odłamywanych Microplate studzienek opłaszczonych przeciwciałami przeciwko łańcuchom alfa 1 Bufor do płukania (10x): Concentrated Washing TRIS-NaCl (ph 7.4), 1% Tween ml Solution (10x) Konserwant: 0.01% thimerosal Negative Control Cut-off control Positive Control Kontrola ujemna: Ludzka surowica, ujemna pod względem przeciwciał IgA anty-t. gondii, oraz ujemna pod względem antygenu powierzchniowego wirusa hepatitis B (HBs-Ag) i przeciwciał anty-hiv1, anty-hiv2 i anty-hcv. Konserwant: 0.01% thimerosal Kontrola cut-off: Ludzka surowica, dodatnia pod względem przeciwciał IgA anty-t. gondii, oraz ujemna pod względem antygenu powierzchniowego wirusa hepatitis B (HBs-Ag) i przeciwciał anty-hiv1, anty-hiv2 i anty-hcv. Konserwant: 0.01% thimerosal Kontrola dodatnia: Ludzka surowica, dodatnia pod względem przeciwciał IgA anty-t. gondii, oraz ujemna pod względem antygenu powierzchniowego wirusa hepatitis B (HBs-Ag) i przeciwciał anty-hiv1, anty-hiv2 i anty-hcv. Konserwant: 0.01% thimerosal 1 ml 1 ml 1 ml R6a Antigen Antygen Liofilizowany antygen T. gondii (szczep RH) 4 fiolki 3 ml R6b Koniugat: Mysie przeciwciała monoklonalne przeciwko T. gondii, Conjugate (80x) skoniugowane z peroksydazą chrzanową. Stężone 80X ml Konserwant: 0.01% thimerosal R7 Rozcieńczalnik próbek i koniugatu (gotowy do użycia) 2 fiolki x Diluent Bufor TRIS-NaCl (ph ), albumina bydlęca + 0.1% Tween 20, 80 ml czerwień fenolowa. Konserwant: < 0.01% thimerosal. R8 Bufor do substratu TMB: Kwas cytrynowy i octan sodu (ph 4.0), TMB Substrate Buffer zawierający 0.015% H 2 O 2 i 4% DMSO 60 ml R9 Chromogen: TMB Chromogen 0.25% tetrametylobenzydyna (TMB) 5 ml R10 Roztwór zatrzymujący (gotowy do użycia) Stopping Solution 1 N kwas siarkowy 28 ml 5- ZALECENIA DLA UŻYTKOWNIKA Uzyskanie prawidłowego wyniku zależy od przestrzegania zasad pracy laboratoryjnej: Nie używać odczynników po upływie terminu przydatności. Podczas jednego oznaczenia używać wyłącznie odczynników o tym samym numerze serii. Uwaga: Podczas danego oznaczenia można wymiennie używać następujących odczynników, lecz w jednym teście powinny być one z tej samej serii: roztwór płuczący (R2, oznaczony 10x na niebiesko), substrat (R8, oznaczony TMB buf. na niebiesko), chromogen (R9, oznaczony TMB sol. na zielono) oraz roztwór zatrzymujący (R10, oznaczony 1N na czerwono). Odczynników tych można używać również w innych testach Bio-Rad; informacji udzieli serwis techniczny. Przed użyciem przenieść odczynniki w celu stabilizacji na 30 minut do temp. pokojowej ( C). Unikać zanieczyszczenia podczas rekonstytucji odczynników. Nie wykonywać testu w obecności kurzu ani reaktywnych par związków zasadowych, kwasów i aldehydów, które mogą wpływać na aktywność enzymatyczną koniugatu. Używać szkła dokładnie umytego i przepłukanego wodą destylowaną lub, co jest wskazane, materiałów jednorazowych. Reakcja enzymatyczna jest bardzo wrażliwa na działanie metali i jonów metali. Należy unikać kontaktu elementów metalowych z roztworami zawierającymi koniugat lub substrat. Roztwór wywołujący reakcję barwną (substrat + chromogen) powinien być bezbarwny. Wystąpienie niebieskiej barwy kilka minut po rekonstytucji świadczy o nie przydatności roztworu do użycia. Roztwór należy przygotowywać w jednorazowym plastikowym pojemniku przy pomocy jednorazowych pipet lub końcówek, lub używając szkła płukanego 1N kwasem solnym, wodą destylowaną i wysuszonego. Roztwór należy przechowywać w ciemności. Do każdej badanej próbki zmieniać końcówkę pipety. Płukanie studzienek jest istotnym etapem oznaczenia; należy przestrzegać przewidzianych cykli płukania, oraz zwracać uwagę, czy studzienki są prawidłowo napełniane i całkowicie opróżniane. Nieprawidłowe płukanie jest przyczyną fałszywych wyników. 2

3 Nie dopuszczać do wysuszenia mikropłytki pomiędzy etapem płukania a dodawaniem kolejnego odczynnika. Nigdy nie używać tego samego pojemnika na koniugat i roztwór substrat-chromogen. Sprawdzać, czy pipety i sprzęt są prawidłowo nastawione oraz, czy aparatura prawidłowo pracuje. Nie zmieniać opisanej procedury. HIGIENA I BEZPIECZEŃSTWO PRACY Wszystkie odczynniki są przeznaczone wyłącznie do diagnostyki in vitro. Podczas pracy z odczynnikami i próbkami należy używać rękawiczek jednorazowych. Nie pipetować ustami. Ludzkie surowice używane do przygotowania odczynników były ujemne pod względem antygenu powierzchniowego wirusa hepatitis B (HBs Ag), przeciwciał przeciwko wirusowi hepatitis C (anty-hcv) oraz przeciwciał anty-hiv 1 i anty- HIV 2. Ponieważ nie ma metod absolutnie wykluczających obecność czynników zakaźnych, odczynniki pochodzące z materiału ludzkiego powinny być traktowane jako materiał potencjalnie zakaźny. Materiały mające kontakt z próbkami lub odczynnikami pochodzenia ludzkiego, w tym także zużyty roztwór płuczący, należy traktować jako skażone i dekontaminować przed wyrzuceniem. Unikać rozlania próbek i odczynników je zawierających. Zanieczyszczone powierzchnie czyścić 10% roztworem podchlorynu. W przypadku rozlania kwasu należy go najpierw zneutralizować dwuwęglanem sodu, potem zmyć powierzchnię roztworem podchlorynu i osuszyć bibułą. Materiał używany do czyszczenia wyrzucić do pojemnika na odpady. Próbki, materiały i produkty zanieczyszczone materiałem biologicznym dekontaminować przed wyrzuceniem. - przez moczenie w 5% podchlorynie sodu przez 30 minut, - lub autoklawowanie w temp. 121 C przez co najmniej 2 godziny. Autoklawowanie przez co najmniej godzinę w temp. 121 C jest najlepszą metodą inaktywacji wirusów HIV i wirusów zapalenia wątroby. UWAGA: NIE AUTOKLAWOWAĆ ROZTWORÓW ZAWIERAJĄCYCH PODCHLORYN SOD. Odczynniki chemiczne powinny być stosowane i utylizowane zgodnie z zasadami Dobrej Praktyki Laboratoryjnej. Unikać kontaktu skóry i błon śluzowych z roztworem substratu, chromogenem i roztworem zatrzymującym (możliwość zatrucia, podrażnienia lub poparzenia). W celu zapoznania się z zaleceniami dotyczącymi zagrożeń i środków ostrożności związanych z niektórymi substancjami chemicznymi zawartymi w niniejszym zestawie należy skorzystać z piktogramów wskazujących rodzaj zagrożenia znajdujących się na etykietach i w informacjach zamieszczonych na końcu instrukcji obsługi. Karta charakterystyki jest dostępna na stronie internetowej 6- PRÓBKI 1. Zalecanym materiałem jest surowica lub osocze, pobrane na antykoagulant (EDTA, cytrynian, heparyna). 2. Zalecenia dotyczące pobierania, obróbki i przechowywania próbek: - Próbki krwi należy pobrać zgodnie z rutynową procedurą, z wkłucia dożylnego. - Próbki krwi przed odwirowaniem pozostawić do powstania skrzepu. - Próbówki z próbkami przez cały czas powinny być zamknięte. - Po odwirowaniu oddzielić surowicę lub osocze od skrzepu i przenieść do szczelnie zamykanej próbówki. - Jeśli test będzie wykonany w ciągu 7 dni, próbki można przechować w temp C. - Jeśli test będzie wykonany później, lub próbki będą transportowane, należy je zamrozić w temp. -20 C lub niższej. - Unikać częstego rozmrażania i ponownego zamrażania próbek. Próbki można zamrozić i rozmrozić najwyżej 3 razy. - Po rozmrożeniu próbki należy dokładnie wymieszać przed oznaczeniem. Test jest przeznaczony dla próbek surowicy rozcieńczonych 1:101. Ponieważ poziom przeciwciał IgA u płodów i noworodków jest dużo niższy niż u dorosłych, surowice te należy rozcieńczyć 1: Na oznaczenie nie wywiera wpływu obecność w surowicy 90 g/l albuminy, 100 mg/l bilirubiny, poziom lipemii odpowiadający 36 g/l trioleiny (trójglicerydów), ani hemoliza wynosząca do 10 g/l hemoglobiny. 4. Nie ogrzewać próbek. 7- PROCEDURA 7.1. INNE NIEZBĘDNE MATERIAŁY I SPRZĘT Worteks Czytnik mikropłytek z filtrami 450 i 620 nm (*) Łaźnia wodna lub inkubator mikropłytek nastawiony na 37 1 C (*) Płuczka mikropłytek: manualna, półautomatyczna lub automatyczna (*) Pojemnik na materiał zakaźny i zanieczyszczone odpady Podchloryn sodu (wybielacz) i dwuwęglan sodu Jałowa woda destylowana lub dejonizowana Cylindry miarowe na 25 ml, 50 ml, 100 ml i 1000 ml Rękawiczki jednorazowe Okulary ochronne Bibuła Pipety lub multipipety automatyczne lub półautomatyczne, regulowane lub o stałej pojemności, pobierające od 10 l do 1000 l, oraz 1, 2 i 10 ml. Próbówki jednorazowe * Dział Techniczny firmy udziela informacji na temat zalecanych aparatów. 3

4 7.2. PRZYGOTOWANIE ODCZYNNIKÓW R1: Foliową torebkę przeciąć na wysokości cm. Nieużywane paski jak najszybciej schować do torebki. Sprawdzić czy jest w niej pochłaniacz wilgoci. Torebkę szczelnie zamknąć i przechowywać w temp C. R2: Rozcieńczyć wodą destylowaną 1:10, wymieszać. Do manualnego płukania 12 pasków potrzeba 350 ml rozcieńczonego roztworu płuczącego. R3, R4a, R4b: Rozcieńczyć 1:101 za pomocą R7 (np. 10 l r ml R7). R6a: Liofilizowany antygen zrekonstytuować w 3 ml rozcieńczalnika (R7) na fiolkę. Roztwór rozpuszczonego antygenu musi być zawsze idealnie przejrzysty. Zawartość jednej fiolki wystarcza na 3 paski. Uwaga: nie należy używać odczynnika, w którym występuje wyraźne zmętnienie. W takim wypadku należy wymienić odczynnik. Po uwodnieniu antygen należy od razu zamrozić w temp. -20 C, gdzie może być przechowywany przez 3 miesiące. Zamrożony antygen można rozmrozić tylko raz. R6b: Monoklonalne przeciwciało znakowane peroksydazą (koniugat) jest roztworem stężonym 80x. Na jedną mikropłytkę należy rozcieńczyć ml stężonego koniugatu w 12 ml rozcieńczalnika R7. Dobrze wymieszać. Rozcieńczony koniugat zużyć od razu. Roboczy roztwór koniugatu: rozcieńczony R6a + rozcieńczony R6b: na jedną mikropłytkę zmieszać 12 ml rozcieńczonego koniugatu R6b i 12 ml zrekonstytuowanego antygenu R6a (4 fiolki). R9: Rozcieńczyć 1:11 w R8, np. 1 ml R ml R PRZECHOWYWANIE OTWARTYCH I/LUB ZREKONSTYTUOWANYCH ODCZYNNIKÓW R1: Po otwarciu oryginalnego opakowania studzienki mikropłytek zachowują zdolność reakcyjną przez 1 miesiąc w temp C, przechowywane w szczelnie zamkniętej torebce z pochłaniaczem wilgoci. R2: Rozcieńczony roztwór do płukania można przechowywać 2 tygodnie w temp C. Roztwór stężony można przechowywać w temp C; nie zanieczyszczony mikrobiologicznie, jest trwały zgodnie z datą ważności. R6: Rozcieńczony roztwór jest trwały do 4 godzin w temp. pokojowej ( C). R9: Rozcieńczony roztwór jest trwały do 6 godzin, w ciemności, w temp. pokojowej ( C). R3, R4a, R4b, R7 i R10: Odczynniki (także otwarte) przechowywane w temp C, nie zanieczyszczone mikrobiologicznie, są trwałe zgodnie z datą ważności. Zestaw należy przechowywać w temp C zgodnie z datą ważności podaną na opakowaniu. Uwaga: Odczynniki są gotowe do użycia po osiągnięciu temp. pokojowej. 7.4 PROCEDURA Należy postępować dokładnie wg opisanej procedury. Podczas każdego testu oznaczyć surowice wzorcowe, co zapewnia walidację testu. Przed użyciem odczynniki przenieść na 30 minut do temp. pokojowej (18-30 C). 1. Zanotować rozkład nanoszenia próbek i kontroli. 2. Przygotować rozcieńczony roztwór płuczący R2 (patrz rozdział 7.2). 3. Wyjąć potrzebną liczbę pasków, pozostałe zamknąć ponownie w oryginalnym opakowaniu. 4. Przepłukać paski rozcieńczonym roztworem R2 (jeden raz). Osuszyć odwróconą mikropłytkę postukując nią na bibule. 5. Rozcieńczyć badane próbki oraz kontrole w R7 stosunku 1:101, dodając 10 l próbki lub kontroli do 1 ml rozcieńczalnika R7. Wymieszać próbki na worteksie. 6. Nanieść 200 l rozcieńczonych 1:101 kontroli (R3, R4a i R4b) oraz rozcieńczonych 1:101 badanych próbek (S1, S2, itd.) w sugerowany sposób: A R3 S5 B R4a S6 C R4a S7 D R4b S8 E S1 S9 F S2 S10 G S3 S11 H S4 S12 7. Zakryć szczelnie mikropłytkę folią adhezyjną. Inkubować w łaźni wodnej z termostatem lub w inkubatorze mikropłytek przez godzinę 5 minut w temp. 37 C 1 C. 8. Przed końcem inkubacji przygotować odpowiednią ilość roztworu koniugatu R6b i roztworu antygenu R6a. Przygotować roboczy roztwór koniugatu (patrz rozdział 7.2). 9. Po pierwszej inkubacji zdjąć folię adhezyjną. Zaaspirować zawartość studzienek (do pojemnika z podchlorynem sodu). Wykonać 3 cykle płukania i osuszyć mikropłytkę na bibule. 10. Do wszystkich studzienek nanieść po 200 l roboczego roztworu koniugatu (R6a + R6b). Roztwór wstrząsnąć przed użyciem. 11. Zakryć szczelnie mikropłytkę folią adhezyjną. Inkubować w łaźni wodnej z termostatem lub w inkubatorze mikropłytek przez godzinę 5 minut w temp. 37 C 1 C. 4

5 12. Zdjąć folię. Zaaspirować zawartość studzienek (do pojemnika z podchlorynem sodu). Wykonać 4 cykle płukania jak wyżej i osuszyć odwróconą mikropłytkę na bibule. 13. Przygotuj roboczy roztwór substratu (R8 + R9, patrz rozdział 6.2) i nanieś po 200 μl do wszystkich studzienek. Pozostawić reakcję w ciemności na 30 5 minut w temp. pokojowej (18-30 C). Nie zakrywać mikropłytki folią adhezyjną. 14. Zatrzymać reakcję enzymatyczną przez dodanie do każdej studzienki 100 l (R10), w tej samej kolejności, w której dodawany był roztwór substratu. 15. Ostrożnie wytrzeć spód mikropłytki i w ciągu 30 minut od zatrzymania reakcji zmierzyć gęstość optyczną (OD) każdej studzienki w czytniku mikropłytek, przy długości fali 450/620 nm (przed odczytem chronić paski od światła). 16. Przed opisem wyników sprawdzić zgodność kolejności odczytu z ustalonym na początku rozkładem studzienek, oraz zgodność pomiędzy odczytem spektrofotometrycznym a wizualnym. 8- INTERPRETACJA WYNIKÓW 8.1. Walidacja Podczas każdego oznaczenia należy włączyć wszystkie surowice wzorcowe. Aby wyniki testu były ważne, muszą być spełnione odpowiednie kryteria: Wartości OD: - OD R4b > Współczynniki: - średnia OD dla R4a / OD R3 > OD R4b / średnia OD R4a > Jeśli nie spełnione są kryteria kontroli jakości, test należy powtórzyć Obliczenie wartości cut-off (CO) CO = średnia OD dla R4a 8.3. Obliczenie współczynnika próbki Współczynnik próbki = OD próbki / CO (średnia OD R4a) Wynik można wyrazić także obliczając indeks fiksacji: Indeks fiksacji = (OD próbki OD M R4a) / (OD R4b OD M R4a) x Interpretacja wyników Współczynnik Wynik Interpretacja - postępowanie 1.00 Dodatni Niezbędne wykrycie swoistych przeciwciał IgM i ilościowe oznaczenie IgG anty-t. gondii. Wynik należy potwierdzić po dniach, 2 paski po 8 odłamywanych dołków opłaszczonych przeciwciałami przeciw łańcuchom alfa każdy. 0.8 i < 1.00 Wątpliwy Wynik należy potwierdzić po dniach. W tej samej próbce wykryć przeciwciała IgM i IgG anty- T. gondii. < 0.80 Ujemny Jeśli test jest ujemny pod względem swoistych IgM, prawdopodobnie nie ma świeżego zakażenia T. gondii. Indeks fiksacji pozwala na pół-ilościową interpretację wyników uzyskanych dla dwóch surowic tego samego pacjenta. Próbka o indeksie fiksacji pomiędzy 0 i 2 odpowiada surowicy o dodatniej wartości granicznej Najczęstsze problemy Wyniki nieważne lub niepowtarzalne najczęściej są spowodowane przez: Nieodpowiednie płukanie mikropłytki. Zanieczyszczenie próbek ujemnych próbką o wysokim poziomie przeciwciał. Zanieczyszczenie roztworu substratu czynnikiem utleniającym (wybielacz, jony metali). Zanieczyszczenie roztworu zatrzymującego reakcję. 9- OGRANICZENIA METODY Rozpoznanie niedawnego zakażenia pierwotniakiem można postawić dopiero po połączeniu danych klinicznych i wyników testu serologicznego. Wynik uzyskany dla jednej próbki nie wystarcza do potwierdzenia niedawnego zakażenia. Jedynie połączenie objawów klinicznych i wyników serologicznych (znamienny wzrost poziomu przeciwciał IgG anty-t. gondii w dwóch próbkach pobranych w odstępie co najmniej trzech tygodni, oznaczanych jednocześnie, oraz obecność przeciwciał IgM anty-t. gondii w znamiennym mianie) potwierdza świeże zakażenie. Ponieważ przeciwciała IgG mogą pojawić się później, w przypadku kobiet w ciąży należy oznaczać przeciwciała w klasie IgM (Platelia TM Toxo IgM TMB). 10- CHARAKTERYSTYKA TESTU Ocenę właściwości testu Platelia TM Toxo IgA TMB prowadzono oznaczając w trzech różnych miejscach próbki pobrane od kobiet w ciąży, noworodków, oraz surowice płodowe. Swoistość i czułość została określona w teście Platelia TM Toxo IgA (OPD), nr kat , podczas oznaczania próbek o znanych wynikach pod względem obecności przeciwciał IgG i IgM. Następnie wykonano badania porównawcze testów: Platelia TM Toxo IgA (OPD), nr kat i Platelia TM Toxo IgA TMB, nr kat

6 Swoistość Oznaczono 430 próbek od 405 pacjentów, w tym 23 próbki od 21 płodów i 73 próbki od 50 noworodków bez klinicznych objawów toksoplazmozy, oraz 143 próbki od pacjentów z przewlekłym zakażeniem i 191 próbek od osób nie immunizowanych. Swoistość testu dla tej populacji wynosiła 99.8% (429/430). Jedna próbka od noworodka dała wynik wątpliwy w klasie IgA, i ujemny w klasie IgM. Czułość Oznaczono 287 próbek od 118 pacjentów o znanym stanie klinicznym: 13 próbek od 8 płodów, których matki uległy zakażeniu podczas ciąży. 187 próbek od 23 noworodków, których matki były zakażone w czasie ciąży (miejsce 1). 87 próbek od pacjentów z zakażeniem w ostrej fazie (45 w miejscu 1 i 42 w miejscu 2). Przeciwciała IgA wykryto w 4 przypadkach na 8 płodów (obecność IgA u płodu zależy od czasu zakażenia matki oraz od czasu pobrania od płodu próbki surowicy). Wśród noworodków, przeciwciała IgA wykryto w 15 przypadkach w chwili urodzenia, w 2 przypadkach w macicy i w 6 przypadkach w ciągu kilku tygodni po urodzeniu. Badając 87 pacjentów w ostrej fazie choroby, przeciwciała IgA wykryto u 69 chorych. Badania porównawcze W teście Platelia TM Toxo IgA TMB (nr kat ) i w teście Platelia TM Toxo IgA OPD (nr kat ) oznaczono 252 próbki, pochodzące od kobiet w ciąży (ujemne i dodatnie). Wyniki badań: Platelia Toxo IgA TMB (72737) Platelia Toxo IgA OPD(72733) Ujemny Wątpliwy Dodatni Ogółem Ujemny Wątpliwy 1* Dodatni 0 1* Ogółem 213 1* *powtarzając oznaczenie za pomocą obu testów, uzyskano dla tych dwóch próbek te same wyniki. Zgodność pomiędzy dwoma testami wynosiła 100%. PRECYZJA Powtarzalność wewnątrz-testowa 3 próbki dodatnie 1 i jedną ujemną oznaczano 30 razy w tym samym teście: Próbka Ujemna Dodatnia 1 Dodatnia 2 Dodatnia 3 Współczynnik Średnia SD % CV Powtarzalność pomiędzy-testowa 4 próbki (1 ujemną i 3 dodatnie) oznaczano w duplikacie, w dwóch testach dziennie, przez okres dwudziestu dni: Próbka Ujemna Dodatnia 1 Dodatnia 2 Dodatnia 3 Współczynnik Średnia SD % CV REAKCJE KRZYŻOWE W teście Platelia Toxo IgA TMB oznaczano 136 próbek, dodatnich pod względem markerów wirusowych, mogących dawać potencjalne reakcje krzyżowe (CMV, EBV, HSV, VZV, świnka, różyczka, odra) i 39 próbek dodatnich pod względem czynnika reumatoidalnego, autoprzeciwciał i przeciwciał heterofilnych oraz próbek od pacjentów ze szpiczakiem. Nie stwierdzono reakcji krzyżowych wszystkie próbki były ujemne (175/175). 11- BIBLIOGRAFIA 1. ANDERSON S.E. and REMINGTON J.S. : The diagnosis of toxoplasmosis. Southern Med. J. 1975; 68, BELANGER F., DEROUIN F., GRANGEOT-KEROS L., MEYER L. and the HEMOCO and SEROCO Study Groups : Incidence and risk factors of toxoplasmosis in a cohort of Human immunodeficiency virus-infected patients ( ). Clinical Infectious Diseases 1999; 28, BULLOCK S.L., and WALLS, K.W. : Evaluation of some of the parameters of the enzyme-linked immunospecific assay. J. Inf. Dis. (Suppl.) 136: 2, S279-S DAFFOS, FORESTIER F., CAPELLA-PAVLOVSKY M., THULLIEZ P., AUFRANT C., VALENTI D. and COX L. : Prenatal management of 746 pregnancies at risk for congenital toxoplasmosis. New Eng. J. Med. 1988; 318,

7 5. DECOSTER A., DARCY F., CARON A., VINATIER D., HOUZE DE L AULNOIS D., VITTU G., NIEL G., HEYER F., LECOLIER B., DELCROIX M., MONNIER J.C., DUHAMEL M. and CAPRON A.: Anti-P30 IgA antibodies as prenatal markers of congenital Toxoplasma infection. 1992; 87, DEROUIN F., LEPORT C., PUEYO S., MORLAT P., LETRILLART B., CHENE G., ECOBICHON J.L., LUFT B., AUBERTIN J., HAFNER R., VILDE J.L., SALAMON R. and ANRS 005/ACTG 154 Trial Group Predictive value of Toxoplasma gondii antibody titres on the occurrence of toxoplasmic encephalitis in HIV-infected patients.aids 1996; 10, DESMONTS G., COUVREUR J., THULLIEZ Ph., SAINT JOIGNY G. and COLIN J. : Sérodiagnostic de la Toxoplasmose, des méthodes simples, pour des questions précises. Le concours médical 1985; , DUBEY J.P. and BEATTIE C.P. : Toxoplasmosis of animal and man. CRC Press (1988) 9. JENUM P.A., STRAY-PEDERSEN B., MELBY K.K., KAPPERUD G., WHITELAW A., ESKILD A. and ENG J. : Incidence of Toxoplasma gondii infection in pregnant women in Norway and pregnancy outcome for infected women. J. Clin. Microbiol. 1998; 36, JENUM P.A. and STRAY-PEDERSEN B. : Development of specific immunoglobulins G, M, and A following Toxoplasma gondii infection in pregnant women in Norway and pregnancy outcome for infected women. J. Clin. Microbiol. 1998; 36, JENUM P.A., STRAY-PEDERSEN B. and GUNDERSEN A.G. : Improved Diagnosis of primary Toxoplasma gondii infection in early pregnancy by determination of anti-toxoplasma immunoglobulin G avidity. J. Clin. Microbiol ; 35, LAPPALAINEN M., KOSKELA P., KOSKINIEMI M., AMMALA P., HILESMAA V., TERAMO K., RAIVIO K.O., REMINGTON J.S., HEDMAN K.: Toxoplasmosis acquired during pregnancy: improved serodiagnosis based on avidity of IgG. J. Infect. Dis. 1993; 41, LECOLIER B. and PUCHEU : Usefulness of IgG avidity analysis for the diagnosis of toxoplasmosis. Path. Biol. 1993; 42, LEBECH M., JOYNSON D.H.M., SEITZ H.M. THULLIEZ P., GILBERT R.E., DUTTON G.N., OVLISEN B. and PETERSEN E., : Classification system and case definition of Toxoplasma gondii infection in immunocompetent pregnant women and their congenitally infected offspring. Eur. J. Microbiol. Infect. Dis. 1996; 15, LUFT B.J. and REMINGTON J.S. : Toxoplasmic encephalitis. Clinical Infectious Diseases 1992; 15, NAESSENS A., HEUNINCKX W., FOULON W. and LAUWERS S. : Evaluation of seven commercially available enzyme immunoassays for immunoglobulin G and M antibody detection of Toxoplasma gondii. Immunol. Infect. Dis. 1993; 3, PETITHORY J.C., REITER-OWONA I., BERTHELOT F., MILGRAM M., DE LOYE J. and PETERSEN E. : Performance of European laboratories testing serum samples for Toxoplasma gondii. Eur. J. Microbiol. Infect. Dis. 1996; 15, REMINGTON J.S. and DESMONTS G. : Toxoplasmosis in infectious disease of the fetus and newborn infant. JS Remington and JO Klein, eds. WB Saunders Co., Philadelphia 1976; SABIN A.B., and FELDMAN H.A. : Dyes as microchemical indicators of a new immunity phenomenon affecting a protozoan parasite (Toxoplasma), Science 1948; 108: SANTORO F., AFCHAIN D., PIERCE J.R., CESBRON J.Y., OVLAQUE G. and CAPRON A.: Serodiagnosis of Toxoplasma infection using a purified parasite protein P30. Clin. Exp. Immunol. 1985; 62, SHARMA S.D., MULLENAX J., ARAUJO F.G., ERLICH H.A. and REMINGTON J.S. : Western Blot analysis of the antigens of Toxoplasma gondii recognized by human IgM and IgG antibodies. J. Immunol. 1983; 131: SULHANIAN A., NUGUES C., GARIN J.F., PELLOUX H., LONGUET P., SLIZEWICZ B. and DEROUIN F. : Serodiagnosis of toxoplasmosis in patients with acquired or reactivating toxoplasmosis and analysis of the specific IgA antibody response by ELISA, agglutination and immunoblotting. Immunol. Infect. Dis. 1993; 3, SULZER A.J. and HALL EC. : Indirect fluorescent antibody tests for parasitic diseases : IV Statistical study of variation in the indirect fluorescent antibody (IFA) test for toxoplasmosis. Amer. J. Epidemiol. 1967; 86: WILSON M., REMINGTON J.S., CLAVET C., VARNEY G., PRESS C., WARE D. and the FDA TOXOPLASMOSIS AD HOC WORKING group : Evaluation of six commercial kits for detection of human immunoglobulin M. antibodies to Toxoplasma gondii. J. Clin. Microbiol. 1997; 35, WONG S.Y. and REMINGTON J.S. : Biology of Toxoplasma gondii. AIDS 1993; 7,

8 STRESZCZENIE PROCEDURY WYKONANIA TESTU 1. Ustaw inkubator na 37 ± 1 0 C. 2. Rozcieńcz chromogen R9 1:11 w buforze do substratu R8 (roztwór do reakcji enzymatycznej). 3. Rozcieńcz wodą destylowaną 1:10 roztwór płuczący R2 10x (R2d). 4. Przepłucz jeden raz paski rozcieńczonym roztworem płuczącym (R2d). 5. Rozcieńcz badane próbki oraz kontrole w R7 stosunku 1: Nanieść 200 l rozcieńczonych kontroli i badanych próbek w sugerowany sposób: A R3 S5 B R4a S6 C R4a S7 D R4b S8 E S1 S9 F S2 S10 G S3 S11 H S4 S12 7. Inkubacja przez godzinę w temp. 37 C 1 C. 8. Przygotuj roztwór roboczy koniugatu (R6b + R6a). 9. Zaaspirować zawartość studzienek i przepłukać 3 razy roztworem do płukania (R2d). 10. Do wszystkich studzienek nanieść po 200 l roboczego roztworu koniugatu. 11. Inkubacja przez godzinę w temp. 37 C 1 C. 12. Zaaspirować zawartość studzienek i przepłukać 4 razy roztworem do płukania (R2d). 13. Do wszystkich studzienek nanieść po 200 l roztworu do reakcji enzymatycznej (R8 + R9). 14. Inkubacja w ciemności, przez 30 minut, w temperaturze pokojowej ( C ). 15. Dodać do każdej studzienki po 100 l roztworu zatrzymującego reakcję (R10). 16. Zmierzyć absorbancję w czytniku mikropłytek, przy długości fali 450/620 nm. 8

9 9

10 Bio-Rad 3, boulevard Raymond Poincare Marnes-la-Coquette - France Tel. : +33 (0) /06 Fax : +33 (0)