PLATELIA LYME IgM /11

Transkrypt

1 PLATELIA LYME IgM 1 płytka Test immunoenzymatyczny do jakościowego wykrywania przeciwciał klasy IgM przeciwko borrelia burgdorferi sensu lato w ludzkiej surowicy lub osoczu /11 1. PRZEZNACZENIE Platelia TM Lyme IgM jest testem immunoenzymatycznym do jakościowego wykrywania przeciwciał klasy IgM przeciwko Borrelia burgdorferi sensu lato w ludzkiej surowicy lub osoczu metodą immunocapture. 2. ZNACZENIE KLINICZNE Borelioza z Lyme (lub choroba z Lyme) jest to choroba niezakaźna, wywoływana przez Borrelia burgdorferi bakterię z rodziny krętków, przenoszoną przez kleszcze z rodzaju Ixodes (2). Gospodarzami tej bakterii są różne zwierzęta, a przeniesienie choroby na człowieka zachodzi poprzez ukąszenie przez zainfekowanego kleszcza. Ryzyko przeniesienia zakażenia jest tym większe im dłuższy jest czas pobierania pokarmu przez kleszcza (tj. czas ukąszenia). Częstość występowania choroby z Lyme jest wysoka w krajach o klimacie umiarkowanym i chłodnym na półkuli północnej, od Chin do Ameryki Północnej oraz od Skandynawii po Afrykę Północną. Szacuje się, że każdego roku w Stanach Zjednoczonych zgłaszanych jest około przypadków (3), a w Europie przypuszczalnie ponad , przy czym stwierdzonym dodatnim gradiencie częstości w kierunku z zachodu na wschód(4). Wyraźnie wykazano, że Borrelia burgdorferi opisana w 1984 roku jako unikalny gatunek bakterii, w rzeczywistości sklada się z kilku gatunków, spośród których pięć jest chorobotwórczych dla człowieka: Borrelia burgdorferi sensu stricto (ss), Borrelia garinii, Borrelia afzelii, Borrelia spielmanii i Borrelia bavariensis (7,8). Dwa pozostałe gatunki są potencjalnie patogenne: Borrelia valaisiana i Borrelia lusitaniae. Te siedem gatunków krąży w Europie, a tylko B. burgdorferi sensu stricto występuje w Stanach Zjednoczonych. Objawy kliniczne choroby z Lyme są zróżnicowane i czasami trudne do rozpoznania (6). W klinicznym przebiegu choroby wyróżnić można trzy etapy. Etap wczesny (Stadium I) może być bezobjawowy i charakteryzuje się występowaniem zespołu objawów grypopodobnych. W 50 do 80% przypadków, kilka dni lub tygodni po ukąszeniu, pojawia się typowo zlokalizowana wysypka skórna, rozchodząca się koliście, określana jako rumień wędrujący (erythema migrans, EM). Jeżeli nie zostanie wdrożone leczenie, rozsiew bakterii drogą krwiopochodną powoduje wystąpienie po kilku tygodniach zapalenia stawów, zaburzeń neurologicznych lub o charakterze zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych oraz objawów skórnych lub sercowych (Stadium II). Po kilku miesiącach lub latach, choroba może przejść w stadium przewlekłe związane z występowaniem zanikowego zapalenia skóry obwodowych części kończyn (acrodermatitis chronica atrophicans), zapalenia mózgu, zapalenia mózgu i rdzenia kręgowego oraz przewlekłego zapalenia stawów (Stadium III) (1). Każdy z gatunków Borrelia burgdorferi wykazuje specyficzny tropizm. Rumień wędrujący w stadium I występuje w przypadku wszystkich trzech gatunków. Jednakże powikłania neurologiczne częściej występują w przypadku zakażenia wywołanego przez B. garinii, zapalenie stawów częściej związane jest z zakażeniem wywołanym przez B. burgdorferi ss, podczas gdy zanikowe zapalenie skóry jest swoiste dla B. afzelii. Nie należy stawiać rozpoznania boreliozy bez dokładnej analizy historii choroby pacjenta, kryteriów klinicznych i biologicznych oraz bez oszacowania ryzyka narażenia na ukąszenie przez kleszcze. Ze względu na trudności w wykryciu bezpośrednim, izolacji z hodowli i wdrażaniu metod biologii molekularnej, badania serologiczne stanowią kluczowy element w biologicznej diagnostyce boreliozy (1,5,9). Przeciwciała klasy IgM przeciwko Borrelia burgdorferi pojawiają się około 3 do 6 tygodni po zakażeniu i mogą utrzymywać się przez okres rozwoju choroby, podczas gdy przeciwciała klasy IgG pojawiają się później i osiągają wysoki poziom dopiero po kilku miesiącach lub latach. Nawet, jeżeli badanie serologiczne jest mniej przydatne w stadium wczesnym, jest ono bardzo istotne w stadium drugim i trzecim, zwłaszcza przy braku rumienia wędrującego. Jeżeli wynik badania serologicznego jest ujemny, mimo sugerującego zakażenie obrazu klinicznego, kolejne badanie serologiczne należy wykonać po trzech tygodniach od pierwszego badania. Obecność swoistych przeciwciał klasy IgM nie jest jednoznaczna ze stwierdzeniem niedawnego zakażenia. Podobnie, obecność swoistych przeciwciał klasy IgG nie zawsze świadczy o przebytym zakażeniu. Antygeny i przeciwciała wykorzystane w testach Platelia TM Lyme IgM (nr ref ) oraz Platelia TM Lyme IgG (nr ref ) zostały dobrane tak, aby pozwolić na wykrycie swoistych przeciwciał klasy IgG i klasy IgM, przeciwko zróżnicowanym amerykańskim i europejskim szczepom Borrelia burgdorferi sensu lato (B. burgdorferi ss, B. garinii, B. azfelii). 3. ZASADA Platelia TM Lyme IgM jest testem immunoenzymatycznym do jakościowego wykrywania przeciwciał klasy IgM przeciwko Borrelia burgdorferi sensu lato w ludzkiej surowicy lub osoczu wykorzystującym wiązanie przeciwciał klasy IgM na fazie stałej. Przeciwludzkie przeciwciała łańcuchów μ są pokrywane na fazie stałej (studzienki mikropłytek). Mieszanina natywnego antygenu Borrelia i antygenu monoklonalnego anty-borrelia flagellar znakowana peroksydazą stosowana jest jako koniugat. Test wykorzystuje następujące etapy: 1

2 Etap 1 Próbki pacjenta i kontrole rozcieńczane są w stosunku 1/101, a następnie nanoszone są do studzienek mikropłytki. Podczas trwającej jedną godzinę inkubacji w temperaturze 37 C, przeciwciała klasy IgM przeciwko Borrelia burgdorferi, występujące w próbce, wiążą się z przeciwciałami anty-µ, którymi opłaszczone są studzienki mikropłytki. Po inkubacji, niezwiązane przeciwciała niespecyficzne i inne białka surowicy usuwane są przez płukanie. Etap 2 Do studzienek mikropłytki dodawany jest koniugat (mieszanina antygenu Borrelia oraz przeciwciał przeciwko antygenowi Borrelia znakowanych peroksydazą). Podczas trwającej jedną godzinę inkubacji w temperaturze 37 C, koniugat wiąże się ze swoistymi przeciwciałami klasy IgM skierowanymi przeciwko antygenowi Borrelia. Niezwiązany koniugat usuwany jest przez płukanie po zakończeniu inkubacji. Etap 3 Obecność kompleksów immunologicznych (przeciwciała przeciwko ludzkim łańcuchom µ/ przeciwciała klasy IgM przeciwko antygenowi Borrelia / antygen Borrelia / przeciwciała monoklonalne przeciwko antygenowi Borrelia, znakowane peroksydazą) wykazywana jest przez dodanie do każdej studzienki roztworu wyzwalającego reakcję enzymatyczną. Etap 4 Po inkubacji w temperaturze pokojowej ( C), reakcja enzymatyczna zatrzymywana jest przez dodanie roztworu 1N kwasu siarkowego. Odczyt gęstości optycznej uzyskany za pomocą czytnika ustawionego na 450/620 nm jest proporcjonalny do ilości przeciwciał klasy IgM przeciwko Borrelia burgdorferi, występujących w próbce. 4. INFORMACJA O PRODUKCIE Dostarczona ilość odczynników umożliwia wykonanie 96 oznaczeń w maksymalnie 6 seriach. Wszystkie odczynniki przeznaczone są wyłącznie do diagnostyki in vitro. R1 R2 R3 R4 R5 R6a Etykieta Odczynnik Opis Mikropłytka (gotowa do użytku) Microplate 12 pasków, po 8 odłamywalnych studzienek każdy, pokrytych 1 mikropłytka przeciwciałami przeciwko ludzkim łańcuchom µ Concentrated Washing Stężony roztwór płuczący (20x) Solution Tris-NaCl (ph 7,4), 2% Tween 20 1 x 70 ml (20x) Środek konserwujący: 0,04 % ProClin 300 Kontrola ujemna Ludzka surowica, ujemna pod względem przeciwciał klasy IgM Negative Control przeciwko Borrelia burgdorferi oraz negatywna pod względem 1 x 0,75 ml antygenu HBs, przeciwciał anty-hiv1, anty-hiv2 i anty-hcv Środek konserwujący: 0,15 % ProClin 300 Kontrola cut-off Ludzka surowica reaktywna pod względem przeciwciał klasy IgM Cut-off Control przeciwko Borrelia burgdorferi oraz ujemna pod względem 1 x 0,75 ml antygenu HBs, przeciwciał anty-hiv1, anty-anti-hiv2 i anty-hcv Środek konserwujący: 0,15 % ProClin 300 Kontrola dodatnia Ludzka surowica reaktywna pod względem przeciwciał klasy IgM Positive Control przeciwko Borrelia burgdorferi oraz ujemna pod względem 1 x 0,75 ml antygenu HBs, przeciwciał anty-hiv1, anty-anti-hiv2 i anty-hcv Środek konserwujący: 0,15 % ProClin 300 Antygen (liofilizowany) Antigen Albumina surowicy wołowej, antygen Borrelia 2 x około 8,0 ml R6b R7 R9 Conjugate (51x) Diluent Chromogen TMB Koniugat (51x) Mysie przeciwciało monoklonalne przeciwko antygenowi Borrelia, 1 x 0,4 ml znakowane peroksydazą Środek konserwujący: 0,16 % ProClin 300 Rozcieńczalnik dla próbek i koniugatu (gotowy do użytku) Tris-NaCl (ph 7.7), płodowa surowica cielęca, 0,1% Tween 20 2 x 65 ml oraz czerwień fenolowa Środek konserwujący: 0,15 % ProClin 300 Chromogen (Gotowy do użytku) 3,3,5,5 tetrametylobenzydyna (< 0.1%), H 2O 2 (<1%) 1 x 28 ml R10 Stopping Solution Roztwór zatrzymujący reakcję (gotowy do użytku) 1N roztwór kwasu siarkowego 1 x 28 ml Warunki przechowywania oraz datę przydatności do użytku podano na opakowaniu zestawu. 2

3 5. ZALECENIA DLA UŻYTKOWNIKA Wiarygodność uzyskiwanych wyników zależy od właściwego stosowania następujących zasad Dobrej Praktyki Laboratoryjnej: Nie używać odczynników po upływie daty ważności. Nie mieszać i nie łączyć w ramach jednego oznaczenia odczynników z różnych serii. UWAGA: W przypadku roztworu płuczącego (R2, oznaczenie na etykiecie: 20x, kolor zielonego), chromogenu (R9, oznaczenie na etykiecie: TMB, kolor turkusowy) oraz roztworu zatrzymującego reakcję (R10, oznaczenie na etykiecie: 1N, kolor czerwony), można stosować inne serie niż zawarte w zestawie, pod warunkiem, że odczynniki są ściśle równoważne i w ramach jednego oznaczenia stosowana jest ta sama seria odczynnika. Przed użyciem odczekać 30 minut, aby odczynniki osiągnęły temperaturę pokojową ( C). Starannie rekonstytuować lub rozcieńczać odczynniki, unikając ich zanieczyszczenia. Nie wykonywać oznaczenia w obecności reaktywnych par związków (kwasów, zasad, aldehydów) lub kurzu, które mogą wpływać na aktywność enzymatyczną koniugatu. Stosować naczynia szklane dokładnie umyte i wypłukane wodą dejonizowaną lub najlepiej materiały jednorazowego użytku. Płukanie mikropłytki stanowi ważny etap procedury: należy przestrzegać zalecanej liczby cykli płukania i upewnić się, że studzienki są całkowicie napełniane, a następnie całkowicie opróżniane. Nieprawidłowe płukanie może być przyczyną do błednych wyników. Nie dopuszczać do wyschnięcia mikropłytki między zakończeniem płukania a naniesieniem odczynnika. Nie stosować nigdy tych samych pojemników dla koniugatu i roztworu wywołującego. Reakcja enzymatyczna jest bardzo wrażliwa na metale lub jony metali. W związku z tym nie należy dopuszczać do kontaktu jakiegokolwiek elementu metalowego z roztworami zawierającymi koniugat lub chromogen. Roztwór chromogenu (R9) powinien być bezbarwny. Pojawienie się niebieskiego zabarwienia oznacza, że odczynnik nie może być stosowany i musi zostać wymieniony. Do każdej próbki stosować nową końcówkę pipety. Sprawdzać pipety i pozostały sprzęt pod względem dokładności i poprawności działania. Higiena i bezpieczeństwo pracy Materiał pochodzenia ludzkiego użyty do przygotowania odczynników został przebadany i uznany za niereaktywny pod względem obecności antygenu powierzchniowego wirusa zapalenia wątroby typu B (HBs Ag), przeciwciał przeciwko wirusowi zapalenia wątroby typu C (anty-hcv) oraz przeciwko ludzkiemu wirusowi niedoboru odporności (anty-hiv1 i anty-hiv2). Ze względu na to, iż żadna metoda nie daje całkowitej pewności co do braku czynników zakaźnych, odczynniki pochodzenia ludzkiego oraz próbki pacjentów należy traktować jako potencjalnie zakaźne. Każdy materiał, który ma bezpośredni kontakt z próbkami i odczynnikami zawierającymi materiały pochodzenia ludzkiego, również roztwory płuczące, należy traktować jak materiał potencjalnie zakaźny. Pracując z próbkami i odczynnikami stosować rękawice jednorazowego użytku. Nie pipetować ustami. Unikać rozlewania próbek lub roztworów zawierających próbki. Rozlany materiał należy spłukać wybielaczem, rozcieńczonym do 10%. W razie rozlania kwasu, należy najpierw zobojętnić go dwuwęglanem sodu, a następnie spłukać środkiem wybielającym rozcieńczonym do 10% i osuszyć bibułą. Materiał stosowany do czyszczenia należy wyrzucać do pojemnika z odpadami zakaźnymi. Próbki pacjenta, odczynniki zawierające materiał pochodzenia ludzkiego, jak również materiały skażone należy wyrzucać po odkażeniu: - przez zanurzenie w środku wybielającym o ostatecznym stężeniu podchlorynu sodu wynoszącym 5%, na 30 minut; - lub przez sterylizację w autoklawie w temperaturze 121 C przez co najmniej 2 godziny. UWAGA: Nie wstawiać do autoklawu roztworów zawierających podchloryn sodu. Unikać kontaktu chromogenu i roztworu zatrzymującego reakcję ze skórą i błoną śluzową (ryzyko zatrucia, podrażnienia lub poparzenia). Z odpadami chemicznymi i biologicznymi należy postępować i usuwać je zgodnie z zasadami Dobrej Praktyki Laboratoryjnej. Wszystkie odczynniki w zestawie przeznaczone są wyłącznie do diagnostyki in vitro. W celu zapoznania się z zaleceniami dotyczącymi zagrożeń i środków ostrożności związanych z niektórymi substancjami chemicznymi zawartymi w niniejszym zestawie należy skorzystać z piktogramów wskazujących rodzaj zagrożenia znajdujących się na etykietach i w informacjach zamieszczonych na końcu instrukcji obsługi. Karta charakterystyki jest dostępna na stronie internetowej 6. POBIERANIE, PRZYGOTOWANIE I PRZECHOWYWANIE PRÓBEK 1. Zalecane rodzaje próbek to surowica i osocze (pobrane na EDTA, heparynę lub cytrynian). 2. Podczas pobierania, obróbki i przechowywania próbek krwi należy przestrzegać poniższych zaleceń: Próbki krwi żylnej pobierać zgodnie z rutynową procedurą. W przypadku surowicy, przed wirowaniem odczekać do pełnego wykrzepienia próbek. 3

4 Probówki powinny być cały czas zamknięte. Po odwirowaniu, oddzielić surowicę lub osocze od skrzepu lub krwinek czerwonych do dokładnie zamkniętej probówki do przechowywania. Próbki można przechowywać w temperaturze +2-8 C, jeżeli badanie zostanie wykonane w ciągu 7 dni. Jeżeli badanie nie zostanie wykonane w ciągu 7 dni lub w przypadku przygotowania do wysyłki, próbki należy zamrozić w temperaturze -20 C lub niższej. Nie używać próbek, które były rozmrażane więcej niż pięć razy. Uprzednio zamrożone próbki należy przed badaniem, po rozmrożeniu, dokładnie wymieszać (Vortex). 3. Na wynik oznaczenia nie wypływa obecność w próbkach 90 g/l albuminy lub 100 mg/l wolnej bilirubiny, lipemia odpowiadająca 36 g/l trójoleiny (trojglicerydy) i hemoliza do 10 g/l hemoglobiny. 4. Nie ogrzewać próbek. 7. PROCEDURA BADANIA 7.1 Materiały wymagane, ale nie dostarczone przez producenta Mieszadło Vortex. Czytnik mikropłytek wyposażony w filtry o długości fali 450 nm i 620 nm (*). Inkubator mikropłytek termostatem ustawionym na temp. 37±1 C (*). Automatyczne, półautomatyczne lub ręczne urządzenie do płukania mikropłytek (*). Jałowa woda destylowana lub dejonizowana. Rękawiczki jednorazowego użytku. Gogle lub okulary ochronne. Papier adsorbujący. Automatyczne lub półautomatyczne, nastawne lub stało-objętościowe pipety jedno- lub wielokanałowe, do odmierzania i dozowania objętości od 10 µl do 1000 µl oraz 1 ml, 2 ml i 10 ml. Cylindry miarowe o pojemności 25 ml, 50 ml, 100 ml i 1000 ml. Podchloryn sodu (środek wybielający) i dwuwęglan sodu. Pojemnik na odpady stanowiące zagrożenie biologiczne. Probówki jednorazowego użytku. (*) Szczegółowe informacje dotyczące zalecanego wyposażenia uzyskać można w naszym dziale technicznym. 7.2 Rekonstutucja odczynników R1: Przed otwarciem torebki, odczekać 30 minut, aby ogrzać mikropłytkę do temperatury pokojowej ( C). Wyjąć ramkę, niewykorzystywane paski włożyć natychmiast z powrotem do torebki i sprawdzić czy w torebce znajduje się środek osuszający. Dokładnie zamknąć torebkę i przechowywać ją w temperaturze +2-8 C. R2: Rozcieńczyć roztwór płuczący 1/20 w wodzie destylowanej: na przykład 50 ml R2 i 950 ml wody destylowanej, aby uzyskać gotowy do użytku roztwór płuczący. Jeżeli płukanie wykonywane jest ręcznie, przygotować 350 ml rozcieńczonego roztworu płuczącego na jedną płytkę zawierającą 12 pasków. R3, R4, R5: Rozcieńczyć 1/101 w Rozcieńczalniku (R7) (przykład: 10 µl R3 + 1 ml R7). R6a: Na jedną płytkę, uwodnić liofilizowany antygen przez dodanie 8 ml rozcieńczalnika (R7) do każdej fiolki. Dokładnie wymieszać. 15 minutowe oczekiwanie przed zmieszaniem z koniugatem (R6b) pozwala na homogenne uwodnienie antygenu. R6b: Przygotować ilość koniugatu potrzebną na jedną serię oznaczenia dodając jedną objętość stężonego koniugatu (51x) do 50 objętości rozcieńczalnika (R7). Na jedną płytkę, wymieszać 0.3 ml R6b oraz 15 ml R7. R6 (R6a+R6b): Wymieszać równe objętości rozcieńczonych odczynników R6a i R6b. Na jedną płytkę, wymieszać 12 ml przygotowanego roztworu R6a i 12 ml przygotowanego roztworu R6b. Odczekać 45 minut przed użyciem. 7.3 Przechowywanie oraz trwałość otwartych i / lub zrekonstytuowanych odczynników Zestaw należy przechowywać w temperaturze +2-8 C. Przed pierwszym otwarciem, każdy składnik zestawu przechowywanego w temperaturze +2-8 C, zachowuje trwałość do daty przydatności do użytku, podanej na etykiecie zewnętrznej zestawu. R1: Po otwarciu, paski pozostają stabilne przez okres jednego miesiąca, o ile przechowywane są w temperaturze +2-8 C, w tej samej dokładnie zamkniętej torebce (sprawdzić czy w torebce jest środek osuszający). R2: Roztwór płuczący po rozcieńczeniu można przechowywać przez 2 tygodnie w temperaturze C. Stężony roztwór płuczący przechowywany w temp C jest stabilny do czasu upływu terminu przydatności do użytku podanego na etykiecie, pod warunkiem, że nie dojdzie do zanieczyszczenia. R3, R4, R5, R6b, R7: Po otwarciu, jeżeli nie dojdzie do zanieczyszczenia, odczynniki przechowywane w temperaturze +2-8 C są stabilne przez okres jednego miesiąca. R6a+R7: Po uwodnieniu, antygen jest stabilny przez 15 dni w temperaturze +2-8 C lub zamrożony w temperaturze -20 C. Antygen uwodniony i przechowywany zamrożony nie powinien być rozmrażany więcej niż trzy razy. R6b+R7: Po uwodnieniu, roztwór koniugatu jest stabilny przez 8 godzin w temperaturze pokojowej ( C) lub przez 24 godziny w temperaturze +2-8 C. R6 (R6a+R6b): Po przygotowaniu, roboczy roztwór koniugatu jest stabilny przez 8 godzin w temperaturze pokojowej ( C). R9: Po otwarciu, jeżeli nie dojdzie do zanieczyszczenia, odczynnik przechowywany w temperaturze +2-8 C jest stabilny przez okres 2 miesięcy. 4

5 R10: Po otwarciu, jeżeli nie dojdzie do zanieczyszczenia, odczynnik przechowywany w temperaturze +2-8 C jest stabilny do czasu upływu terminu przydatności podanego na etykiecie. 7.4 Procedura Ściśle przestrzegać procedury badania oraz zasad Dobrej Praktyki Laboratoryjnej. Przed użyciem odczekać, aby odczynniki osiągnęły temperaturę pokojową ( C). W celu walidacji uzyskanych wyników, w każdej serii badań stosować kontrolę ujemną, kontrolę cut-off oraz kontrolę dodatnią. 1. Dokładnie ustalić rozkład i plan identyfikacji kontroli i próbek pacjentów. 2. Przygotować rozcieńczony roztwór płuczący (R2) [Zobacz Rozdział 7.2]. 3. Wyjąć ramkę i paski (R1) z torebki ochronnej [Zobacz Rozdział 7.2]. 4. Uwodnić antygen R6a dodając 8 ml rozcieńczalnika (R7). Dokładnie wymieszać. 5. Rozcieńczyć kontrole R3, R4, R5 oraz próbki pacjentów (S1, S2...) w rozcieńczalniku (R7), aby uzyskać rozcieńczenie 1/101: 10 µl próbki i 1,0 ml rozcieńczalnika (R7). Wymieszać rozcieńczone próbki na mieszadle Vortex. 6. Przygotować roztwór roboczy koniugatu (R6), rozcieńczyć potrzebną ilość koniugatu 1/51 rozcieńczalnikiem (R7). Następnie wymieszać równe objętości rozrobionych odczynników R6a i R6b [Zobacz Rozdział 7.2]. Roztwór roboczy koniugatu należy przygotować co najmniej 45 minut przed naniesieniem na płytkę. Dokładnie wymieszać. 7. Ściśle przestrzegać przedstawionej poniżej sekwencji postępowania, nanieść do każdej studzienki po 200 µl rozcieńczonych kontroli i próbek pacjenta: A R3 S5 S13 B R4 S6 C R4 S7 D R5 S8 E S1 S9 F S2 S10 G S3 S11 H S4 S12 8. Zakryć mikropłytkę folią adhezyjną i docisnąć mocno do płytki, aby zapewnić szczelność. Natychmiast inkubować mikropłytkę w łaźni wodnej kontrolowanej termostatem lub w suchym inkubatorze, przez 1 godzinę ± 5 minut, w temperaturze 37 C ± 1 C. 9. Po zakończeniu pierwszej inkubacji zdjąć folię adhezyjną. Zaaspirować zawartość wszystkich studzienek i usunąć do pojemnika na odpady zakaźne (zawierającego podchloryn sodu). Wypłukać mikropłytkę 4 razy stosując 350 µl roztworu płuczącego (R2). Odwrócić mikropłytkę na bibule i delikatnie postukując usunąć pozostały płyn. 10. Nanieść po 200 µl roboczego roztworu koniugatu (R6) do wszystkich studzienek. Roztwór należy delikatnie wstrząsnąć przed użyciem. 11. Zakryć mikropłytkę folią adhezyjną i docisnąć mocno do płytki, aby zapewnić szczelność. Natychmiast inkubować mikropłytkę w łaźni wodnej kontrolowanej termostatem lub w suchym inkubatorze, przez 1 godzinę ± 5 minut, w temperaturze 37 C ± 1 C. 12. Po zakończeniu drugiej inkubacji zdjąć folię adhezyjną. Zaaspirować zawartość wszystkich studzienek i usunąć do pojemnika na odpady zakaźne (zawierającego podchloryn sodu). Wypłukać mikropłytkę 4 razy stosując 350 µl roztworu płuczącego (R2). Odwrócić mikropłytkę na bibule i delikatnie postukując usunąć pozostały płyn. 13. Chroniąc przed dostępem światła, szybko nanieść do każdej studzienki po 200 µl roztworu chromogenu (R9). Inkubować reakcję w ciemności, przez 30 ± 5 minut, w temperaturze pokojowej ( C). Nie stosować folii adhezyjnej podczas tej inkubacji. 14. Zatrzymać reakcję enzymatyczną dodając po 100 µl roztworu zatrzymującego reakcję (R10) do każdej studzienki. Nanosić roztwór w tej samej kolejności i z taką samą szybkością jak roztwór wywołujący reakcję. 15. Ostrożnie wytrzeć spód płytki. W ciągu 30 minut po zatrzymaniu reakcji, odczytać gęstość optyczną przy filtrze 450/620 nm, stosując czytnik płytek. Przed odczytem, chronić paski przed działaniem światła. 16. Przed podaniem wyników, sprawdzić zgodność między odczytem a planem rozkładu płytki i próbek. 8 OBLICZANIE I INTERPRETACJA WYNIKÓW 8.1 Obliczanie wartości odcięcia (CO) Wartość odcięcia (cut-off value, CO) odpowiada średniej wartości gęstości optycznej (OD) duplikatów kontroli wartości odcięcia (R4): CO = średnia OD R4 8.2 Obliczanie współczynnika próbki Wynik próbki podawany jest jako współczynnik, przy zastosowaniu następującego wzoru: Współczynnik próbki = OD próbki/co 5

6 8.3 Kontrola jakości Na każdej płytce i w każdej serii oznaczeń należy uwzględniać wszystkie kontrole i przeanalizować uzyskane wyniki. W celu walidacji serii oznaczeń, muszą być spełnione następujące kryteria: Wartości gęstości optycznej: - CO > x CO < OD R4 powtórzenie 1 < 1.20 x CO x CO < OD R4 powtórzenie 2 < 1.20 x CO (OD każdego powtórzenia kontroli wartości odcięcia (R4) nie może różnić się o więcej niż 20% od wartości CO). Współczynniki gęstości optycznej: - Współczynnik R3 (OD R3 / CO) < Współczynnik R5 (OD R5 / CO) > 2.0 Jeżeli nie są spełnione powyższe kryteria kontroli jakości, oznaczenie należy powtórzyć. 8.4 Interpretacja wyników Współczynnik próbki Wynik Interpretacja Współczynnik < 0,80 Ujemny Próbkę należy traktować jako niereaktywną pod względem przeciwciał klasy IgM przeciwko Borrelia burgdorferi sensu lato. 0,80 współczynnik < 1,2 Niejednoznaczny Próbka traktowana jest jako niejednoznaczna pod względem przeciwciał klasy IgM przeciwko Borrelia burgdorferi sensu lato. Wynik należy potwierdzić za pomocą kolejnego badania wykonanego na nowej próbce krwi pobranej w odstępie co najmniej 3 tygodni od czasu tego badania. indeks 1,2 Dodatni Próbkę należy traktować jako reaktywną pod względem przeciwciał klasy IgM przeciwko Borrelia burgdorferi sensu lato. Jeżeli podejrzewa się zakażenie, do potwierdzenia rozpoznania przydatne mogą być uzupełniające badania serologiczne takie jak wykrywanie przeciwciał klasy IgG anty-borrelia. Jeżeli wynik badania serologicznego jest dodatni lub niejednoznaczny, zaleca się przebadanie próbki metodą potwierdzającą np. Western-Blot (9). 8.5 Rozwiązywanie problemów Wyniki nie spełniające kryteriów walidacji lub niepowtarzalne mogą wynikać z następujących przyczyn: Niewłaściwe płukanie mikropłytki. Zanieczyszczenie próbek ujemnych przez surowicę lub osocze o wyższym mianie przeciwciał. Zanieczyszczenie roztworu wywołującego reakcję przez utleniające czynniki chemiczne (środek wybielający, jony metali...). Zanieczyszczenie roztworu zatrzymującego reakcję. 8.6 Przykład obliczeń Uwaga: Poniższe dane stanowią przykład i nie powinny być stosowane zamiast wyników uzyskanych przez użytkownika. Kontrole i próbki pacjentów OD (450/620 nm) Współczynnik Wynik R Ujemny R / / R / / R Dodatni Próbka Dodatni Próbka 2, itd Dodatni Wartość odcięcia: - CO = ( )/2 = Wartości gęstości optycznej: - OD CO = (N > 0.200) - OD R4 Powtórzenie 1 = (0.80 x OD CO < OD R4 Powtórzenie 1 < 1.20 x OD CO) - OD R4 Powtórzenie 2 = (0.80 x OD CO < OD R4 Powtórzenie 2 < 1.20 x OD CO) Współczynniki gęstości optycznej: - Współczynnik R3 = 0.22 (N < 0.5) - Współczynnik R5 = 3.24 (N > 2.0) Kontrola jakości: Zaakceptowana 6

7 9 CHARAKTERYSTYKA TESTU 9.1 Wartości spodziewane Wartości spodziewane dla oznaczenia poziomu przeciwciał klasy IgM przeciwko Borrelia burgdorferi sensu lato w surowicy ludzkiej wyznaczono wykorzystując panel 296 próbek pochodzących od dawców krwi z terenu Francji Północnej. Uzyskano następujące wyniki: 286 ujemnych, 8 niejednoznacznych, 2 surowice dodatnie. Prewalencja wyznaczona z wykorzystaniem testu Platelia Lyme IgM wynosi 0.68% (2/296). 9.2 Swoistość Swoistość na terenach nie-endemicznych Swoistość oznaczono wykorzystując panel 286 surowic uzyskanych od zdrowych dawców krwi pochodzących z rejonów nieendemicznych na terenie północnej Francji. Próbki zostały wyselekcjonowane na podstawie ujemnego wyniku badania z użyciem komercyjnych testów EIA wykorzystywanych w Europie (oznakowanych znakiem CE) i uznanych za referencyjne Swoistość na terenach endemicznych Swoistość oznaczono także z wykorzystaniem panelu 197 surowic uzyskanych od zdrowych dawców krwi pochodzących z rejonów endemicznych na terenie wschodniej Francji, z których żaden nie spełniał kryteriów kwalifikujących w kierunku choroby z Lyme (brak objawów klinicznych boreliozy, ani też doniesień o ugryzieniu przez kleszcza). Próbki zostały wyselekcjonowane na podstawie ujemnego wyniku badania z użyciem komercyjnych testów EIA wykorzystywanych w Europie (oznakowanych znakiem CE) i uznanych za referencyjne. Uzyskane wyniki przedstawiono w tabeli: Panel surowic Ujemny Niejednoznaczny (1) Dodatni (2) Swoistość Rejon nie-endemiczny (n=286) Rejon endemiczny (n=197) % (280/281) [98,0%-] 99.0% (191/193) [96,3%-99,9%] (1) Wyniki niejednoznaczne nie zostały uwzględnione w obliczeniach swoistości. (2) Jedna z trzech próbek dodatnich w teście Platelia Lyme IgM została uznana za dodatnią także w teście Western-Blot. IC 95%: 95% przedział ufności. 9.3 Czułość Czułość testu Platelia Lyme IgM wyznaczono z użyciem panelu 70 próbek pochodzących od pacjentów prezentującyh zróżnicowane objawy boreliozy z różnych etapów zakażenia i podano razem z wynikami czułości dla testu Platelia Lyme IgG (nr kat ). Uzyskane wyniki przedstawiono w poniżej tabeli i porównano z wynikami czułości uzyskanymi dla komercyjnych testów EIA wykorzystywanych w Europie (oznakowanych znakiem CE) i uznanych za referencyjne: Stadium kliniczne Liczba surowic Platelia Lyme (1) Test ref. Europa (1) IgM IgG IgG + IgM IgG + IgM Erythema migrans (Stadium I) % [32.9%-81.6%] 66.7% [38.4%-88.2%] 82,4% [56,6%-96,2%] 93,3% [68,1%-99,8%] Neuroborelioza (Stadium II) % [19.9%-56.1%] 96.9% [83.4%-99.9%] 96,9% [83,4%-99,9%] 97,0% [84,2%-99,9%] Acrodermatitis chronica atrophicans (Stadium III) % [0.05%-71.6%] 100.0% [54.9%-100.0%] [54,9%-] [54,9%-] Lyme Arthritis (Stadium III) % [0.0%-18.1%] (1) Wyniki niejednoznaczne nie zostały uwzględnione w obliczeniach czułości. IC 95%: 95% przedział ufności % [81.9%-100.0%] [81,9%-] [81,9%-] 7

8 Czułość testu Platelia Lyme IgM wyznaczono także z użyciem panelu udokumentowanych próbek z kolekcji CDC (Centre for Disease Control) i porównano z wynikami czułości uzyskanymi dla komercyjnych testów EIA wykorzystywanych w Europie (oznakowanych znakiem CE) oraz USA (zatwierdzonych przez FDA) i uznanych za referencyjne. Wyniki przedstawiono w poniższej tabeli: Stadium kliniczne Erythema migrans Liczba surowic 28 Test referencyjny Platelia Lyme (1) Europa (1) USA (1) IgM IgG IgG + IgM IgG + IgM IgG + IgM 73.7% [48.8%-90.9%] 38.5% [20.2%-59.5%] 86,4% [65,1%-97,1%] 70,4% [49,8%-86,3%] 87,0% [66,4%-97,2%] Arthritis / Arthralgia % [5.3%-85.3%] 100.0% [60.7% %] [60,7%- ] [60,7%-] [60,7%-] Stadium nieznane % [0.05% %] 100.0% [36.8% %] (1) Wyniki niejednoznaczne nie zostały uwzględnione w obliczeniach czułości. IC 95%: 95% przedział ufności. [47,3%- ] [19,4%-99,9%] [36,8%-] 9.4 Dokładność Dokładność wewnątrz-testowa (powtarzalność): W celu oceny powtarzalności w ramach jednego cyklu, jedną próbkę negatywną i trzy pozytywne przebadano 30 razy w tym samym cyklu. Dla każdej próbki określono współczynnik (OD próbki / CO). Średni współczynnik, odchylenie standardowe (SD) oraz współczynnik zmienności (%CV) dla każdej z czterech próbek podano w poniższej tabeli: Precyzja w ramach jednego cyklu (powtarzalność) N=30 Próbka ujemna Próbka dodatnia o Próbka dodatnia niskim mianie Współczynnik (OD próbki / wartość odcięcia) Próbka dodatnia o wysokim mianie Średnia SD %CV 15.2% 4.4% 3.7% 2.5% Powtarzalność między-testowa (odtwarzalność): W celu oceny odtwarzalności, każdą z czterech próbek (jedna ujemna i trzy dodatnie) badano w duplikatach, w dwóch seriach dziennie, przez 20 dni. Dla każdej próbki określono współczynnik (OD próbki / CO). Średni współczynnik, odchylenie standardowe (SD) oraz współczynnik zmienności (%CV) dla każdej z czterech próbek podano w poniższej tabeli: Powtarzalność między-testowa (odtwarzalność) N=80 Próbka ujemna Próbka dodatnia o Próbka dodatnia niskim mianie Współczynnik (OD próbki / wartość odcięcia) Próbka dodatnia o wysokim mianie Średnia SD %CV 12.0% 5.5% 5.9% 3.7% 8

9 9.5 Reakcje krzyżowe Z użyciem testu Platelia Lyme IgM przebadano 338 próbek, których charakter stwarza potencjalnie ryzyko wystąpienia reakcji niespecyficznych. Wyniki oznaczeń podano w poniższej tabeli: Panel Liczba próbek Niejednoznaczne (1) Dodatnie % reakcji krzyżowych Kiła % (2) CMV % (2) EBV % (3) Leptospiroza % (3) Malaria % (3) Przeciwciała przeciwjądrowe (ANA) % Przeciwciała heterofline (HAMA) % Czynnik reumatoidalny % HSV % Tozoplazmoza % (2) Różyczka % Odra % Świnka % HIV % VZV % RAZEM % (1) Wyniki niejednoznaczne wykluczono z obliczeń reaktywności krzyżowej. (2) Różnica nieistotna w porównaniu do wartości oczekiwanych w rejonach endemicznych (Test Fisher a, p>0.05). (3) Różnica istotna w porównaniu do wartości oczekiwanych w rejonach endemicznych (Test Fisher a, p<0.05). 16 surowic uznanych za dodatnie w teście Platelia Lyme IgM, zostało przebadanych w komercyjnym teście EIA wykorzystywanym w Europie (oznakowanym znakiem CE), oraz metodą western-blot. Wyniki oznaczeń podano w poniższej tabeli: Próbka EIA Western blot (1) Próbka EIA Western blot (1) Kiła Ujemny Ujemny Leptospiroza Dodatni Dodatni CMV Ujemny Ujemny Malaria Niejednoznaczny NT EBV Dodatni Dodatni Malaria Dodatni NT EBV Dodatni Ujemny Malaria Niejednoznaczny NT EBV Dodatni Ujemny Malaria Dodatni NT EBV Dodatni NT Malaria Ujemny NT EBV Dodatni Niejednoznaczny Malaria Ujemny NT Leptospiroza Ujemny Dodatni Toksoplazmoza Dodatni Ujemny (1) NT: nie oznaczono z powodu zbyt małej objętości próbki. 9

10 10 OGRANICZENIA PROCEDURY Rozpoznanie zakażenia wywołanego przez Borrelia burgdorferi można postawić wyłącznie na podstawie kombinacji danych klinicznych i biologicznych. Wynik pojedynczego oznaczenia w kierunku przeciwciał klasy IgG przeciwko Borrelia burgdorferi nie stanowi wystarczającego dowodu do postawienia rozpoznania zakażenia wywołanego przez Borrelia burgdorferi sensu lato. Jeżeli wynik badania serologicznego jest dodatni lub niejednoznaczny, zaleca się przebadanie próbki za pomocą metody potwierdzającej takiej jak Western-Blot (9). Istnieją doniesienia, iż zwłaszcza w przypadku pacjentów z malarią, zakażonych wirusem EBV, lub krętkami innych z rodzajów (leptospiry, itp.) możliwe jest uzyskanie wyników fałszywie dodatnich w testach wykrywających przeciwciała przeciw Borrelia burgdorferi. Interpretując wyniki takich testów należy mieć na uwadze powyższą możliwość. 11 KONTROLA JAKOŚCI PRODUCENTA Wszystkie odczynniki są przygotowywane zgodnie z naszym systemem jakości, począwszy od materiału wyjściowego aż do ostatecznego produktu komercyjnego. Każda seria ostatecznego produktu podlega oznaczeniu kontrolnemu i jest dopuszczona do użytku, jeśli spełnia wymagane kryteria. Bio-Rad posiada protokoły produkcji i kontroli jakości każdej serii odczynników. 12 LITERATURA 1. Aguero-Rosenfeld, M. E., Wang, G., Schwartz, I., Wormser, G Burgdorfer, W., Barbour, A. G., Hayes, S. F., Benach, J. L., Grunwaldt, E., Davis, J.P Lyme disease a tickborne spirochetosis? Science. 216: Center for Disease Control and Prevention Lyme disease United States, Morb. Mortal. Wkly. Rep. 53: Hubalek, Z., Halouzka, J Distribution of Borrelia burgdorferi sensu lato genomic groups in Europe, a review. Eur. J. Epidemiol. 13: Reed, K. D Laboratory testing for Lyme disease: possibilities and practicalities. J. Clin. Microbiol. 40: Stanek, G., Strle, F Lyme borreliosis. Lancet. 362: Wang, G., Van Dam, A. P., Spanjaard, L., Dankert, J Molecular typing of Borrelia burgdorferi sensu lato: taxonomic, epidemiological, and clinical implications. Clin. Microbiol. Rev. 12: Rudenko, N., Golovchenko, M., Grubhoffer, L Updates on Borrelia burgdorferi sensu lato complex with respect to public health. Ticks Tick Borne Dis. 2(3): Wilske, B Diagnosis of Lyme borreliosis in Europe. Vector Borne Zoonotic Dis. 3:

11 11

12 Bio-Rad 3, boulevard Raymond Poincaré Marnes-la-Coquette France Tel. : +33 (0) /11 Fax : +33 (0)