TEST IMMUNOENZYMATYCZNY DO WYKRYWANIA I ILOŚCIOWEGO OZNACZANIA PRZECIWCIAŁ KLASY

Transkrypt

1 PLATELIA TOXO IgG TMB 96 TESTÓW TEST IMMUNOENZYMATYCZNY DO WYKRYWANIA I ILOŚCIOWEGO OZNACZANIA PRZECIWCIAŁ KLASY IgG PRZECIWKO TOXOPLASMA GONDII W LUDZKIEJ SUROWICY LUB OSOCZU Do diagnostyki in vitro Wszystkie produkowane i wprowadzane do sprzedaży odczynniki są przygotowywane zgodnie z systemem jakości, poczynając od materiałów wyjściowych, aż do ostatecznego produktu komercyjnego. Odczynniki każdej serii podlegają oznaczeniu kontrolnemu, i są dopuszczane do użytkowania, jeśli spełniają wymagane kryteria. Odpowiednie protokoły produkcji i kontroli jakości każdej serii są przechowywane w firmie 1

2 SPIS TREŚCI 1 - ZASTOSOWANIE ZNACZENIE KLINICZNE ZASADA TESTU SKŁAD ZESTAWU ZALECENIA DLA UŻYTKOWNIKA INNE NIEZBĘDNE MATERIAŁY I SPRZĘT PRZYGOTOWANIE I PRZECHOWYWANIE ODCZYNNIKÓW POBIERANIE, OPRACOWYWANIE I PRZECHOWYWANIE MATERIAŁU DO BADAŃ PROCEDURA OBLICZENIE I INTERPRETACJA WYNIKÓW CHARAKTERYSTYKA I OGRANICZENIA TESTU LITERATURA

3 1 - ZASTOSOWANIE Test Platelia Toxo IgG TMB służy do wykrywania i ilościowego oznaczania przeciwciał IgG przeciwko Toxoplasma gondii in vitro w ludzkiej surowicy lub osoczu. 2 - ZNACZENIE KLINICZNE T. gondii jest pierwotniakiem wywołującym zakażenia u licznych gatunków ssaków i ptaków. Toksoplazmoza występująca u ludzi i zwierząt przeważnie przebiega bezobjawowo. Częstość występowania zakażeń w danej populacji, wykrywanych metodami serologicznymi, waha się w różnych krajach i zależy od wieku badanych. Toksoplazmoza ciężarnych może powodować poważne zaburzenia rozwoju płodu (zwłaszcza uszkodzenie funkcji mózgu), a czasami prowadzić do obumarcia płodu. Wykrycie przeciwciał IgG przeciw T. gondii u kobiet przed zapłodnieniem pozwala uzyskać pewność ochrony płodu przed zakażeniem wrodzonym, w przypadku wystąpienia toksoplazmozy w czasie ciąży. Skłonność do występowania toksoplazmozy o ostrym przebiegu występuje u chorych z nabytym zespołem niedoboru odporności (AIDS) oraz u innych osób z immunosupresją. Zakażenia te są najczęściej spowodowane reaktywacją cyst pierwotniaka, obecnych w organizmie chorego przed zakażeniem wirusem HIV. Diagnostyka zakażenia T. gondii może być skomplikowana, a izolacja pasożyta jest rzadka. Serologiczne potwierdzenie występowania przeciwciał przeciwko T. gondii świadczy o kontakcie z pasożytem i jest powszechnie akceptowane w celu określenia statusu immunologicznego pacjenta i podatności na zakażenie. Wykrywanie poszczególnych izotypów pomaga określić czas zakażenia T. gondii i zastosowanie odpowiedniego leczenia w przypadku niedawnej infekcji lub propozycję profilaktyki, obejmującej zalecenia higieniczno-dietetyczne dla kobiet w ciąży lub chemioprofilaktykę pacjentów z upośledzoną odpornością. 3 - ZASADA TESTU PLATELIA Toxo IgG TMB jest pośrednim testem immunoenzymatycznym, w którym z fazą stałą związany jest antygen T.gondii, uzyskany z ultrasonatu trofozoitów, wzbogacony białkami błonowymi. Koniugat stanowią monoklonalne przeciwciała przeciwko ludzkim łańcuchom gamma, znakowane peroksydazą. Etap pierwszy Rozcieńczenie próbek i inkubacja z antygenem T.gondii, związanym z fazą stałą. Podczas inkubacji przez 1 godzinę w temp. 37 C, obecne w próbce przeciwciała przeciwko T.gondii wiążą się z antygenem. Po inkubacji, nie swoiste immunoglobuliny i inne białka surowicy zostają usunięte podczas płukania. Etap drugi Naniesienie do studzienek koniugatu: monoklonalnych przeciwciał przeciwko ludzkim łańcuchom gamma, znakowanych peroksydazą. Podczas inkubacji przez 1 godzinę w temp. 37 C, znakowane przeciwciała zwiążą się kompleksem przeciwciało IgG anty- T.gondii antygen T.gondii, związanym z fazą stałą. Po inkubacji, nie związane znakowane przeciwciała są usuwane podczas płukania. Etap trzeci Wykrycie kompleksu (T.gondii Ag, przeciwciało IgG anty T.gondii, koniugat anty-t.gondii IgG) następuje po dodaniu roztworu zawierającego substrat dla peroksydazy i chromogen wywołujący reakcję barwną. 3

4 Etap czwarty Po półgodzinnej inkubacji w temp. pokojowej (18-30 C) i dodaniu 1 N kwasu siarkowego następuje zatrzymanie reakcji enzymatycznej. Uzyskana przy długości fali 450/620 nm wartość OD, jest proporcjonalna do ilości przeciwciał IgA przeciwko T.gondii w badanej próbce Wynik konwertowany jest na IU/ml wykreślając krzywą wzorcową. Surowice kalibracyjne (R4a, R4b, R4c) zostały wykalibrowane wg surowicy standardowej WHO (TOXM 185). 4 - SKŁAD ZESTAWU Wszystkie odczynniki są przeznaczone wyłącznie do diagnostyki in vitro. Oznaczenie Charakterystyka odczynnika Opakowanie R1 Mikropłytka Mikropłytka: 12 pasków po 8 studzienek opłaszczonych antygenami T.gondii (szczep RH). 1 płytka R2 Stężony bufor do płukania Bufor do płukania (10 x): Bufor TRIS-NaCl (ph 7.4), 1% Tween 20 Konserwant: 0.01% thimerosal R3 Kalibrator 0 Kalibrator 0: Ludzka surowica, ujemna pod względem przeciwciał anty-t.gondii, oraz ujemna pod względem antygenu powierzchniowego wirusa hepatitis B (HBs- Ag) i przeciwciał anty-hiv1, anty-hiv2 i anty-hcv. Konserwant: < 0.01% thimerosal R4a Kalibrator 6 Kalibrator 6 IU/ml: Bufor TRIS-NaCl (ph 8 ± 0.2), ludzka surowica, dodatnia pod względem przeciwciał IgG anty-t.gondii, oraz ujemna pod względem antygenu powierzchniowego wirusa hepatitis B (HBs- Ag) i przeciwciał anty-hiv1, anty-hiv2 i anty-hcv, albumina bydlęca, glicerol, E102 i E122 Konserwant: < 0.01% thimerosal i < 0.5% Proclin 300 R4b Kalibrator 60 Kalibrator 60 IU/ml: Bufor TRIS-NaCl (ph 8 ± 0.2), ludzka surowica, dodatnia pod względem przeciwciał IgG anty-t.gondii oraz ujemna pod względem antygenu powierzchniowego wirusa hepatitis B (HBs-Ag) i przeciwciał anty-hiv1, anty-hiv2 i anty-hcv, albumina bydlęca, glicerol, E102 i E122 Konserwant: < 0.01% thimerosal i < 0.5% Proclin 300 R4c Kalibrator 240 Kalibrator 240 IU/ml: Bufor TRIS-NaCl (ph 8 ± 0.2), ludzka surowica, dodatnia pod względem przeciwciał IgG anty-t.gondii, oraz ujemna pod względem antygenu powierzchniowego wirusa hepatitis B (HBs- Ag) i przeciwciał anty-hiv1, anty-hiv2 i anty-hcv, albumina bydlęca, glicerol, E102 i E122 Konserwant: < 0.01% thimerosal i < 0.5% Proclin 300 R6 Koniugat (50x) Koniugat: Mysie przeciwciała monoklonalne przeciwko ludzkim IgG, znakowane peroksydazą chrzanu (50x). 1 fiolka 100 ml 1 fiolka 1 ml 1 fiolka 1 ml 1 fiolka 1 ml 1 fiolka 1 ml 1 fiolka 0. 6 ml 4

5 R7 Rozcieńczalnik Rozcieńczalnik próbek i koniugatu: Bufor TRIS-NaCl R8 R9 R10 Bufor do substratu TMB Chromogen: Roztwór TMB Roztwór zatrzymujący (ph 7.7 ± 0.15), albumina bydlęca, 0.1% Tween 20, czerwień fenolowa Konserwant: < 0.01% thimerosal. Bufor do substratu: Roztwór kwasu cytrynowego i octanu sodu (ph 4.0), zawierający 0.015% H 2 O 2 i 4% DMSO Chromogen: Roztwór zawierający czterometylobenzydynę (TMB) Roztwór zatrzymujący: 1 N kwas siarkowy Folia adhezyjna 2 fiolki 80 ml 1 fiolka 60 ml 1 fiolka 5 ml 1 fiolka 28 ml 4 szt. 5 - ZALECENIA DLA UŻYTKOWNIKA Środki ostrożności Uzyskanie prawidłowego wyniku zależy od przestrzegania zasad Dobrej Praktyki Laboratoryjnej: Nie używać odczynników po upływie terminu przydatności. Podczas jednego oznaczenia używać wyłącznie odczynników o tym samym numerze serii. Uwaga: Podczas danego oznaczenia można wymiennie używać następujących odczynników, lecz w jednym teście powinny być one z tej samej serii: roztwór płuczący (R2, oznaczony 10x na niebiesko), bufor do substratu (R8, oznaczony TMB buf. na niebiesko), chromogen (R9, oznaczony TMB sol. na zielono) oraz roztwór zatrzymujący (R10, oznaczony 1N na czerwono). Odczynników tych można używać również w innych testach Bio-Rad; informacji udzieli serwis techniczny. Przed użyciem przenieść odczynniki w celu stabilizacji na 30 minut do temp. pokojowej. Unikać zanieczyszczenia podczas rekonstytucji odczynników. Nie wykonywać testu w obecności kurzu ani reaktywnych par związków zasadowych, kwasów i aldehydów, które mogą wpływać na aktywność enzymatyczną koniugatu. Używać szkła dokładnie umytego i przepłukanego wodą destylowaną lub, co jest wskazane, materiałów jednorazowych. Nie dopuszczać do wysuszenia mikropłytki pomiędzy etapem płukania a dodawaniem kolejnego odczynnika. Reakcja enzymatyczna jest bardzo wrażliwa na działanie metali i jonów metali. Należy unikać kontaktu elementów metalowych z roztworami zawierającymi koniugat lub substrat. Roztwór substratu (bufor do substratu + chromogen) powinien być bezbarwny. Wystąpienie niebieskiej barwy kilka minut po rekonstytucji świadczy o nie przydatności roztworu do użycia. Roztwór należy przygotowywać w jednorazowym plastikowym pojemniku przy pomocy jednorazowych pipet lub końcówek lub używając 5

6 szkła płukanego 1N kwasem solnym, wodą destylowaną i wysuszonego. Roztwór należy przechowywać w ciemności. Do każdej badanej próbki zmieniać końcówkę pipety. Płukanie studzienek jest istotnym etapem oznaczenia; należy przestrzegać przewidzianych cykli płukania oraz zwracać uwagę, czy studzienki są prawidłowo napełniane i całkowicie opróżniane. Nieprawidłowe płukanie jest przyczyną fałszywych wyników. Nigdy nie używać tego samego pojemnika na koniugat i roztwór substratu. Sprawdzać, czy pipety i sprzęt są prawidłowo nastawione oraz, czy aparatura prawidłowo pracuje. Nie zmieniać opisanej procedury. Higiena i bezpieczeństwo pracy Wszystkie odczynniki są przeznaczone wyłącznie do diagnostyki in vitro. Podczas pracy z odczynnikami należy używać rękawiczek jednorazowych. Nie pipetować ustami. Ludzkie surowice używane do przygotowania odczynników były ujemne pod względem antygenu powierzchniowego wirusa hepatitis B (HBs Ag), przeciwciał przeciwko wirusowi hepatitis C (anty-hcv) oraz przeciwciał anty-hiv 1 i anty-hiv 2. Ponieważ nie ma metod absolutnie wykluczających obecność czynników zakaźnych, odczynniki pochodzące z materiału ludzkiego powinny być traktowane jako materiał potencjalnie zakaźny. Materiały mające kontakt z próbkami lub odczynnikami pochodzenia ludzkiego, w tym także zużyty roztwór płuczący, należy traktować jako skażone i dekontaminować przed wyrzuceniem. Unikać rozlania próbek i odczynników je zawierających. Rozlany odczynnik należy zmyć 10% roztworem podchlorynu. W przypadku rozlania kwasu należy go najpierw zneutralizować dwuwęglanem sodu, potem zmyć powierzchnię roztworem podchlorynu i wysuszyć bibułą. Materiał używany do czyszczenia wyrzucić do pojemnika na zanieczyszczone odpady. Próbki, materiały i produkty zanieczyszczone materiałem biologicznym dekontaminować przed wyrzuceniem. - przez moczenie w podchlorynie sodu o stężeniu końcowym 5% przez 30 minut, - lub autoklawowanie w temp. 121 C przez co najmniej 2 godziny Autoklawowanie przez co najmniej godzinę w temp. 121 C jest najlepszą metodą inaktywacji wirusów HIV i wirusów zapalenia wątroby. UWAGA: NIE AUTOKLAWOWAĆ ROZTWORÓW ZAWIERAJĄCYCH PODCHLORYN SODU. UWAGA: Niektóre odczynniki zawierają: *ProClin 300 < 0.5%: PRODUKT DRAŻNIĄCY R43 Substancja drażniąca dla skóry. S28/37 W przypadku kontaktu ze skórą, szybko przemyć dużą ilością wody z mydłem. Pracować w odpowiednich rękawiczkach 6

7 Xi - drażniący Ze związkami chemicznymi należy postępować zgodnie z zasadami Dobrej Praktyki Laboratoryjnej. Unikać kontaktu skóry i błon śluzowych z buforem do substratu, chromogenem i roztworem zatrzymującym, ze względu na możliwość zatrucia, podrażnienia lub poparzenia. Karta charakterystyki substancji jest dostępna na życzenie. 6 - INNE NIEZBĘDNE MATERIAŁY I SPRZĘT Worteks Czytnik mikropłytek z filtrami 450 i 620 nm (*) Łaźnia wodna lub inkubator mikropłytek nastawiony na 37 ± 1 C (*) Pojemnik na materiał zakaźny i zanieczyszczone odpady Podchloryn sodu (wybielacz) i dwuwęglan sodu Jałowa woda destylowana lub dejonizowana Cylindry miarowe na 25 ml, 50 ml, 100 ml i 1000 ml Rękawiczki lateksowe jednorazowe Okulary ochronne Bibuła Pipety lub multipipety automatyczne lub półautomatyczne, regulowane lub o stałej pojemności, pobierające od 10 µl do 1000 µl, oraz 1, 2 i 10 ml. Płuczka mikropłytek: manualna, półautomatyczna lub automatyczna (*) Próbówki jednorazowe (*) Dział Techniczny firmy udziela informacji na temat zalecanych aparatów 7 - PRZYGOTOWANIE I PRZECHOWYWANIE ODCZYNNIKÓW Zestaw należy przechowywać w temp C zgodnie z datą ważności, podaną na opakowaniu. Uwaga: Odczynniki są gotowe do użycia po osiągnięciu temp. pokojowej ( C). 1) Odczynniki gotowe do użycia Odczynnik 1 (R1): Mikropłytka Każda płytka zawierająca 12 pasków jest zapakowana oddzielnie w foliową torebkę. Należy ją przeciąć na wysokości cm ponad linią i wyjąć potrzebną liczbę pasków. Pozostałe paski szczelnie zamknąć i przechowywać w temp C. Po otwarciu oryginalnego opakowania studzienki mikropłytek zachowują zdolność reakcyjną przez 1 miesiąc w temp C, przechowywane w szczelnie zamkniętej torebce. Odczynnik 3 (R3), Odczynnik 4a (R4a), Odczynnik 4b (R4b), Odczynnik 4c (R4c), Odczynnik 10 (R10): Odczynniki przechowywane w temp C są trwałe, również po otwarciu, zgodnie z datą ważności. 7

8 2) Odczynniki do rekonstytucji Odczynnik 2 (R2): Roztwór płuczący 10x stężony Rozcieńczyć wodą destylowaną 1:10, wymieszać. Do manualnego płukania 12 pasków potrzeba 350 ml rozcieńczonego roztworu płuczącego (R2d). Rozcieńczony roztwór do płukania można przechowywać 2 tygodnie w temp C. Roztwór stężony można przechowywać w temp C. Roztwór koniugatu: odczynnik 6 (R6) + odczynnik 7 (R7) Aby otrzymać roboczy roztwór koniugatu (R6d) na jedną mikropłytkę, należy rozcieńczyć 0.5 ml koniugatu stężonego 50x w 25 ml rozcieńczalnika (R7). Dobrze wymieszać. Otrzymaną objętość podzielić przez 10, aby otrzymać ilość koniugatu roboczego (R6d) potrzebną na 1 pasek zawierający 8 studzienek. Rozcieńczony koniugat należy zużyć w czasie 60 minut od przygotowania. Roztwór substratu: odczynnik 8 (R8) + odczynnik 9 (R9) Rozcieńczyć chromogen (R9) w stosunku 1:11 w buforze do substratu (R8) (np. 1 ml R ml R8). Odczynnik jest stabilny przez 6 godzin w temp. pokojowej ( C), w ciemności. 8 POBIERANIE, OPRACOWYWANIE I PRZECHOWYWANIE MATERIAŁU DO BADAŃ 1. Zalecanym rodzajem próbek jest surowica lub osocze, pobrane na antykoagulant (EDTA, cytrynian, heparyna). 2. Postępowanie z próbkami: Próbki krwi należy pobrać zgodnie z rutynową procedurą, z wkłucia dożylnego. Próbki krwi przed odwirowaniem pozostawić do powstania skrzepu. Próbówki z próbkami przez cały czas powinny być zamknięte. Po odwirowaniu oddzielić surowicę lub osocze od skrzepu i przenieść do szczelnie zamykanej próbówki. Jeśli test będzie wykonany w ciągu 7 dni, próbki można przechować w temp C. Jeśli test będzie wykonany później lub próbki będą transportowane, należy je zamrozić w temp. -20 C lub niższej. Unikać częstego rozmrażania i ponownego zamrażania próbek. Próbki można zamrozić i rozmrozić najwyżej 3 razy. Po rozmrożeniu próbki należy dokładnie wymieszać przed oznaczeniem. 3. Na oznaczenie nie wywiera wpływu obecność w surowicy 90 g/l albuminy, 100 mg/l bilirubiny, poziom lipemii odpowiadający 36 g/l trójglicerydów, ani hemoliza wynosząca do 10 g/l hemoglobiny. 4. Nie ogrzewać próbek. 9 - PROCEDURA Należy postępować dokładnie wg opisanej procedury. Do każdej serii oznaczeń włączyć surowice kalibracyjne, co zapewni walidację testu. 8

9 Przestrzegać zasad Dobrej praktyki Laboratoryjnej. 1. Zanotować rozkład nanoszenia próbek i kalibratorów. 2. Przygotować rozcieńczony roztwór płuczący (R2d) (patrz rozdział 7). 3. Wyjąć potrzebną liczbę pasków (R1), pozostałe zamknąć ponownie w oryginalnym opakowaniu. 4. Przepłukać jeden raz mikropłytkę rozcieńczonym roztworem (R2d). Osuszyć odwróconą mikropłytkę na bibule. 5. Rozcieńczyć badane próbki oraz kalibratory 0, 6, 60, 240 (R3, R4a, R4b i R4c) w stosunku 1:101, dodając 10 µl próbki lub kalibratora do 1 ml rozcieńczalnika (R7). Po rozcieńczeniu wymieszać próbki na worteksie. 6. Podczas manualnego wykonania testu, nanieść do studzienek po 200 µl rozcieńczonych kalibratorów oraz rozcieńczonych badanych próbek w następujący sposób: Studzienka 1A: 200 µl kalibratora 0 IU/ml (R3) w rozcieńczeniu 1/101 Studzienka 1B: 200 µl kalibratora 6 IU/ml (R4a) w rozcieńczeniu 1/101 Studzienka 1C: 200 µl kalibratora 60 IU/ml (R4b) w rozcieńczeniu 1/101 Studzienka 1D: 200 µl kalibratora 240 IU/ml (R4c) w rozcieńczeniu 1/101 Studzienka 1E, 1F, 1G, itd.: 200 µl próbki w rozcieńczeniu 1/ Zakryć szczelnie mikropłytkę folią adhezyjną. Inkubować w łaźni wodnej z termostatem lub w inkubatorze mikropłytek przez 1 godzinę ± 5 minut w temp. 37 C ± 1 C. 8. Przygotować roboczy roztwór koniugatu (R6d) na 15 minut przed końcem pierwszej inkubacji. Na 1 mikropłytkę należy rozcieńczyć 0.5 ml koniugatu stężonego 50x (R6) w 25 ml rozcieńczalnika (R7). Dobrze wymieszać. (patrz rozdział 7). 9. Zdjąć folię adhezyjną. Zaaspirować zawartość studzienek (do pojemnika z podchlorynem sodu). Wykonać 3 cykle płukania roboczym buforem płuczącym (R2d) i osuszyć mikropłytkę na bibule. 10. Natychmiast do wszystkich studzienek nanieść po 200 µl roboczego roztworu koniugatu (R6d). Roztwór wstrząsnąć delikatnie przed użyciem. 11. Zakryć szczelnie mikropłytkę folią adhezyjną. Inkubować w łaźni wodnej z termostatem lub w inkubatorze mikropłytek przez 1 godzinę ± 5 minut w temp. 37 C ± 1 C. 12. Zdjąć folię. Zaaspirować zawartość studzienek (do pojemnika z podchlorynem sodu). Wykonać 4 cykle płukania jak powyżej i osuszyć odwróconą mikropłytkę na bibule. 13. Natychmiast i szybko nanieść do wszystkich studzienek po 200 µl wymieszanego roztworu substratu (R8 + R9). Pozostawić reakcję w ciemności na 30 ± 5 minut w temp. pokojowej (18-30 C). Nie zakrywać folią adhezyjną. 14. Zatrzymać reakcję enzymatyczną przez dodanie do każdej studzienki 100 µl roztworu R10, w tej samej kolejności, w której dodawany był roztwór substratu. 15. Wytrzeć spód mikropłytki i w ciągu 30 minut od zatrzymania reakcji zmierzyć gęstość optyczną każdej studzienki w czytniku mikropłytek, przy długości fali 450/620 nm. Przed odczytem chronić płytkę od światła. 16. Przed opisem wyników sprawdzić zgodność kolejności odczytu z ustalonym na początku rozkładem studzienek oraz zgodność pomiędzy odczytem spektrofotometrycznym a wizualnym. 9

10 10 - OBLICZENIE I INTERPRETACJA WYNIKÓW 1) Kalibracja Występowanie i poziom przeciwciał IgG przeciwko T.gondii w badanej próbce określa porównanie gęstości optycznej (OD) próbki z wartością OD standardów. Zawarte w zestawie surowice kalibracyjne o stężeniach przeciwciał 6, 60, 240 UI/ml, zostały wykalibrowane wg Standardu WHO (TOX M 185). Obserwowane pewne rozbieżności wartości uzyskiwanych dla danej surowicy oznaczanej różnymi testami, wynikają z różnych proporcji rozpuszczalnych antygenów błonowych T.gondii, zastosowanych w poszczególnych testach. 2) Kontrola jakości Podczas każdego oznaczenia należy włączyć wszystkie surowice kalibracyjne. Aby wyniki testu były ważne, muszą być spełnione odpowiednie kryteria: Wartości gęstości optycznej: - OD R OD R4c Współczynnik: OD R4a / OD R3 2 Jeśli nie spełnione są kryteria kontroli jakości, test należy powtórzyć. 3) Krzywa wzorcowa a) Wykreślenie krzywej wzorcowej W metodzie manualnej, na papierze w linie należy zaznaczyć wartości OD uzyskane dla kalibratorów (R3, R4a, R4b i R4c) na osi pionowej (y). Na osi poziomej (x) odłożyć odpowiadające tym wartościom stężenia przeciwciał, podane w IU/ml. Przeprowadzić krzywą przez 4 punkty. b) Obliczenie stężenia przeciwciał w IU/ml Jeśli odczytana wartość OD badanej próbki mieści się między wartościami OD R4a i OD R4c, należy znaleźć odpowiadający jej punkt na osi y, i przeprowadzić od niego poziomą linię w kierunku krzywej. Od punktu przecięcia z krzywą, wykreślić pionową linię w kierunku osi x. Na osi x zostanie w ten sposób zaznaczony punkt, odpowiadający stężeniu przeciwciał w UI/ml w badanej próbce. UWAGA: Jeśli wartość OD próbki rozcieńczonej 1:101 jest wyższa niż OD R4c, należy próbkę oznaczyć ponownie po rozcieńczeniu 1:1010 w R7. Obliczoną wartość poziomu przeciwciał należy wtedy pomnożyć przez 10 czynnik rozcieńczenia. 4) Interpretacja wyników Wykrycie przeciwciał IgG przeciwko T.gondii w teście Platelia Toxo IgG TMB pozwala określić status immunologiczny pacjenta. Miano < 6 IU/ml Nie znamienny poziom przeciwciał = brak odporności. 6 IU/ml miano 9 IU/ml Nie znamienny poziom przeciwciał w tej metodzie = badanie pojedynczej próbki nie pozwala na określenie statusu immunologicznego. Wg aktualnych zaleceń francuskich, należy oznaczyć kolejną próbkę dwiema metodami. 10

11 9 IU/ml < miano 240 IU/ml Poziom przeciwciał znamienny = długotrwała odporność lub wczesny etap serokonwersji. Miano > 240 IU/ml Wysoki poziom przeciwciał = niedawna serokonwersja lub przetrwały wysoki poziom odporności, obserwowany u niektórych osób. Ograniczenia metody Diagnozę niedawnego zakażenia pierwotniakiem można postawić dopiero po połączeniu danych klinicznych i wyników testu serologicznego. Wynik uzyskany dla jednej próbki nie wystarcza do potwierdzenia niedawnego zakażenia. Dopiero znamienny wzrost poziomu przeciwciał IgG anty-t.gondii w dwóch próbkach pobranych w odstępie co najmniej trzech tygodni, oznaczanych jednocześnie, pozwala diagnozować świeże zakażenie, powinien jednak być interpretowany jako świadectwo niedawno nabytego zakażenia. W przypadku osób podejrzanych o zakażenie T.gondii, można również oznaczyć przeciwciała w klasie IgM, które pojawiają się wcześniej niż przeciwciała IgG. 5) Najczęstsze problemy Wyniki nieważne lub nie interpretowalne najczęściej są spowodowane przez: Nie odpowiednie płukanie mikropłytki. Zanieczyszczenie próbek ujemnych próbką o wysokim poziomie przeciwciał. Zanieczyszczenie roztworu substratu czynnikiem utleniającym (wybielacz, jony metali). Zanieczyszczenie roztworu zatrzymującego reakcję. 6) Przykład obliczenia Uwaga: Podane wartości służą jako przykład i nie należy podstawiać ich w miejsce uzyskanych wyników. Wyniki Studzienka OD (450/620 nm) Poziom przeciwciał (IU/ml) R3 (ujemna) R4a R4b R4c Próbka 1 (rozcieńczenie 1:101) Ujemna Próbka 2 (rozcieńczenie 1:101) IU/ml Próbka 3 (rozcieńczenie 1:101) IU/ml Próbka 4 (rozcieńczenie 1:101) IU/ml Próbka 5 (rozcieńczenie 1:101) IU/ml *Dla rozcieńczenia 1/1010, końcowe stężenie = IU/ml x 10 Walidacja testu - Wartości gęstości optycznej - Współczynnik. OD R OD R4a / OD R3 2. OD R4c

12 11 - CHARAKTERYSTYKA I OGRANICZENIA TESTU Ocenę właściwości testu prowadzono oznaczając próbki pobrane do suchych próbówek, do próbówek z separatorem surowicy, próbówek zawierających aktywator skrzepu lub próbówek z różnymi antykoagulantami (EDTA, heparyna, cytrynian). 1. Właściwości testu Przedstawione poniżej dane uzyskano, badając świeże próbki surowicy, pobrane od kobiet w ciąży, pacjentów z immunosupresją oraz zdrowych dawców krwi, a także oznaczając zamrożone próbki surowicy, uprzednio oznaczone jako dodatnie lub ujemne. Badania porównawcze W teście Platelia Toxo IgG TMB i w innym, komercyjnym teście EIA oznaczono równolegle ogółem 787 próbek, pochodzących od losowo wybranych kobiet w ciąży. Do wyjaśnienia niezgodności stosowano metodę bezpośredniej aglutynacji. Podczas obliczeń do określenia względnej swoistości, czułości i zgodności testu pominięto wyniki wątpliwe, uzyskane dla 23 próbek. Platelia Toxo IgG TMB Wynik Ujemny Dodatni Ogółem Inny test EIA Ujemny Dodatni Ogółem Wyniki badań (ośrodek 1) Względna swoistość 488 / % (99.0% %) Względna czułość 271 / % (95.6% %) Względna zgodność 759 / % (98.8% %) Swoistość Swoistość testu Platelia Toxo IgG TMB badano w 2 niezależnych ośrodkach. Testowano surowice uprzednio oznaczone komercyjnymi testami w technice EIA. Do wyjaśnienia niezgodności stosowano metodę bezpośredniej aglutynacji. Podczas obliczeń do określenia swoistości testu nie uwzględniono wyników wątpliwych. - ośrodek 1: 99.8% (403 / 404) - ośrodek 2: 100% (488 / 488) ogółem: 99.9% (891 / 892) Czułość Czułość testu Platelia Toxo IgG TMB badano w 2 niezależnych ośrodkach. Używano surowice uprzednio oznaczone komercyjnymi testami w technice EIA. Do wyjaśnienia niezgodności stosowano metodę bezpośredniej aglutynacji. Podczas obliczeń do określenia czułości testu nie uwzględniono wyników wątpliwych. 12

13 - ośrodek 1: 100% (196 / 196) - ośrodek 2: 98.2% (271 / 276) ogółem: 98.9% (467 / 472) W teście Platelia Toxo IgG TMB oznaczano także panele serokonwersji (ośrodek 1 i 2) oraz panele: 84 próbki surowicy od 33 kobiet w ciąży (ośrodek 1) 48 próbek surowicy od 14 kobiet w ciąży (ośrodek 2) uprzednio oznaczone w innym komercyjnym teście EIA. Do wyjaśnienia niezgodności stosowano metodę bezpośredniej aglutynacji. W ośrodku 1, w teście Platelia Toxo IgG TMB dla 5 próbek uzyskano wynik dodatni wcześniej, niż stosując inny test EIA. W ośrodku 2, w 6 przypadkach uzyskano wcześniej wyniki dodatnie za pomocą testu EIA, innego niż używany w ośrodku 1, w porównaniu z testem Platelia Toxo IgG TMB. Częstość występowania Występowanie w populacji przeciwciał IgG przeciwko T.gondii może różnić się ekstremalnie w zależności od kraju. We Francji, w okolicach Paryża wyniki dodatnie uzyskano dla 67.6% zdrowych dawców krwi: 2. Precyzja Powtarzalność wewnątrz-testowa 4 próbki (1 ujemna i 3 dodatnie) oznaczano 30 razy w tym samym teście: 13

14 Próbki Próbka ujemna Próbka dodatnia 1 Próbka dodatnia 2 Miano IU/ml Próbka dodatnia 3 Średnia Odchylenie Standardowe Współczynnik Zmienności Powtarzalność pomiędzy-testowa 1 ujemną i 3 dodatnie próbki oznaczało dwóch techników w triplikacie przez 5 dni: Próbki Próbka ujemna Próbka dodatnia 1 Próbka dodatnia 2 Miano IU/ml Próbka dodatnia 3 Średnia Odchylenie Standardowe Współczynnik Zmienności Reakcje krzyżowe Oznaczano 141 próbek, dodatnich po względem markerów mogących dawać potencjalne reakcje krzyżowe. Swoistość oceniono na 99.2% (140/141). Dodatni marker dla: Reaktywność Uwagi CMV IgG 5 1 Ujemna po powtórzeniu CMV IgM 5 0 VZV IgM 10 0 VZV IgG 9 0 Świnka IgG 7 0 Świnka IgM 3 0 Różyczka IgG 7 0 Różyczka IgM 7 0 EBV IgG 8 0 EBV IgM

15 Różyczka IgG 5 0 Różyczka IgM 5 0 HSV IgG 5 0 HSV IgM 5 0 HIV 15 0 Szpiczak 8 0 RF 15 0 ANA 10 0 HAMA 3 0 Ogółem LITERATURA 1. ANDERSON S.E. and REMINGTON J.S. :The diagnosis of toxoplasmosis. Southern Med. J. 1975; 68, BELANGER F., DEROUIN F., GRANGEOT-KEROS L., MEYER L. and the HEMOCO and SEROCO Study Groups : Incidence and risk factors of toxoplasmosis in a cohort of Human immunodeficiency virus-infected patients ( ). Clinical Infectious Diseases 1999; 28, BULLOCK S.L., and WALLS, K.W. : Evaluation of some of the parameters of the enzyme-linked immunospecific assay. J. Inf. Dis. (Suppl.) 136: 2, S279-S DAFFOS, FORESTIER F., CAPELLA-PAVLOVSKY M., THULLIEZ P., AUFRANT C., VALENTI D. and COX L. : Prenatal management of 746 pregnancies at risk for congenital toxoplasmosis. New Eng. J. Med. 1988; 318, DECOSTER A., DARCY F., CARON A., VINATIER D., HOUZE DE L AULNOIS D., VITTU G., NIEL G., HEYER F., LECOLIER B., DELCROIX M., MONNIER J.C., DUHAMEL M. and CAPRON A. : Anti-P30 IgA antibodies as prenatal markers of congenital Toxoplasma infection. 1992; 87, DEROUIN F., LEPORT C., PUEYO S., MORLAT P., LETRILLART B., CHENE G., ECOBICHON J.L., LUFT B., AUBERTIN J., HAFNER R., VILDE J.L., SALAMON R. and ANRS 005/ACTG 154 Trial Group Predictive value of Toxoplasma gondii antibody titres on the occurrence of toxoplasmic encephalitis in HIV-infected patients.aids 1996; 10, DESMONTS G., COUVREUR J., THULLIEZ Ph., SAINT JOIGNY G. and COLIN J. : Sérodiagnostic de la Toxoplasmose, des méthodes simples, pour des questions précises. Le concours médical 1985; , DUBEY J.P. and BEATTIE C.P. : Toxoplasmosis of animal and man. CRC Press (1988) 9. JENUM P.A., STRAY-PEDERSEN B., MELBY K.K., KAPPERUD G., WHITELAW A., ESKILD A. and ENG J. : Incidence of Toxoplasma gondii infection in pregnant women in Norway and pregnancy outcome for infected women. J. Clin. Microbiol. 1998; 36, JENUM P.A. and STRAY-PEDERSEN B. : Development of specific immunoglobulins G, M, and A following Toxoplasma gondii infection in pregnant women in Norway and pregnancy outcome for infected women. J. Clin. Microbiol. 1998; 36,

16 11. JENUM P.A., STRAY-PEDERSEN B. and GUNDERSEN A.G. : Improved Diagnosis of primary Toxoplasma gondii infection in early pregnancy by determination of anti- Toxoplasma immunoglobulin G avidity. J. Clin. Microbiol ; 35, LAPPALAINEN M., KOSKELA P., KOSKINIEMI M., AMMALA P., HILESMAA V., TERAMO K., RAIVIO K.O., REMINGTON J.S., HEDMAN K.: Toxoplasmosis acquired during pregnancy: improved serodiagnosis based on avidity of IgG. J. Infect. Dis. 1993; 41, LECOLIER B. and PUCHEU : Usefulness of IgG avidity analysis for the diagnosis of toxoplasmosis. Path. Biol. 1993; 42, LEBECH M., JOYNSON D.H.M., SEITZ H.M. THULLIEZ P., GILBERT R.E., DUTTON G.N., OVLISEN B. and PETERSEN E., : Classification system and case definition of Toxoplasma gondii infection in immunocompetent pregnant women and their congenitally infected offspring. Eur. J. Microbiol. Infect. Dis. 1996; 15, LUFT B.J. and REMINGTON J.S. : Toxoplasmic encephalitis. Clinical Infectious Diseases 1992; 15, NAESSENS A., HEUNINCKX W., FOULON W. and LAUWERS S. : Evaluation of seven commercially available enzyme immunoassays for immunoglobulin G and M antibody detection of Toxoplasma gondii. Immunol. Infect. Dis. 1993; 3, PETITHORY J.C., REITER-OWONA I., BERTHELOT F., MILGRAM M., DE LOYE J. and PETERSEN E. : Performance of European laboratories testing serum samples for Toxoplasma gondii. Eur. J. Microbiol. Infect. Dis. 1996; 15, REMINGTON J.S. and DESMONTS G. : Toxoplasmosis in infectious disease of the fetus and newborn infant. JS Remington and JO Klein, eds. WB Saunders Co., Philadelphia 1976; SABIN A.B., and FELDMAN H.A. : Dyes as microchemical indicators of a new immunity phenomenon affecting a protozoan parasite (Toxoplasma), Science 1948; 108: SANTORO F., AFCHAIN D., PIERCE J.R., CESBRON J.Y., OVLAQUE G. and CAPRON A. : Serodiagnosis of Toxoplasma infection using a purified parasite protein P30. Clin. Exp. Immunol. 1885; 62, SHARMA S.D., MULLENAX J., ARAUJO F.G., ERLICH H.A. and REMINGTON J.S. : Western Blot analysis of the antigens of Toxoplasma gondii recognized by human IgM and IgG antibodies. J. Immunol. 1983; 131: SULHANIAN A., NUGUES C., GARIN J.F., PELLOUX H., LONGUET P., SLIZEWICZ B. and DEROUIN F. : Serodiagnosis of toxoplasmosis in patients with acquired or reactivating toxoplasmosis and analysis of the specific IgA antibody response by ELISA, agglutination and immunoblotting. Immunol. Infect. Dis. 1993; 3, SULZER A.J. and HALL EC. : Indirect fluorescent antibody tests for parasitic diseases : IV Statistical study of variation in the indirect fluorescent antibody (IFA) test for toxoplasmosis. Amer. J. Epidemiol. 1967; 86: WILSON M., REMINGTON J.S., CLAVET C., VARNEY G., PRESS C., WARE D. and the FDA TOXOPLASMOSIS AD HOC WORKING group : Evaluation of six commercial kits for detection of human immunoglobulin M. antibodies to Toxoplasma gondii. J. Clin. Microbiol. 1997; 35, WONG S.Y. and REMINGTON J.S. : Biology of Toxoplasma gondii. AIDS 1993; 7,

17 STRESZCZENIE PROCEDURY WYKONANIA TESTU 1. Ustaw inkubator na 37 ± 1 0 C. 2. Rozcieńcz chromogen R9 1:11 w buforze do substratu R8 (roztwór do reakcji enzymatycznej). 3. Rozcieńcz wodą destylowaną 1:10 roztwór płuczący R2 10x (R2d). 4. Przepłucz jeden raz paski rozcieńczonym roztworem płuczącym (R2d). 5. Rozcieńcz badane próbki oraz kontrole w R7 stosunku 1: Nanieść 200 µl rozcieńczonych kontroli i badanych próbek w sugerowany sposób: A R3 S5 B R4a S6 C R4a S7 D R4b S8 E S1 S9 F S2 S10 G S3 S11 H S4 S12 7. Inkubacja przez godzinę w temp. 37 C ± 1 C. 8. Przygotuj roztwór roboczy koniugatu (R6b + R6a). 9. Zaaspirować zawartość studzienek i przepłukać 3 razy roztworem do płukania (R2d). 10. Do wszystkich studzienek nanieść po 200 µl roboczego roztworu koniugatu. 11. Inkubacja przez godzinę w temp. 37 C ± 1 C. 12. Zaaspirować zawartość studzienek i przepłukać 4 razy roztworem do płukania (R2d). 13. Do wszystkich studzienek nanieść po 200 µl roztworu do reakcji enzymatycznej (R8 + R9). 14. Inkubacja w ciemności, przez 30 minut, w temperaturze pokojowej ( C ). 15. Dodać do każdej studzienki po 100 µl roztworu zatrzymującego reakcję (R10). 16. Zmierzyć absorbancję w czytniku mikropłytek, przy długości fali 450/620 nm. 17

18 CE marking (European directive 98/79/CE on in vitro diagnostic medical devices) Znak CE (Dyrektywa Parlamentu Europejskiego i Rady nr 98/79/CE o wyrobach diagnozy medycznej in vitro) For in vitro diagnostic use Wyrób do diagnostyki in vitro Catalogue number Numer katalogowy Manufacturer Wytwórca Authorised Representative Autoryzowany przedstawiciel Batch code Kod partii Expiry date YYYY/MM/DD Użyć przed RRRR/MM/DD Storage temperature limitation Przestrzegać zakresu temperatur Consult Instruction for use Sprawdź w instrukcji obsługi Bio-Rad 3, Bd Raymond Poincaré Marnes-la-Coquette France Tél. : 33 (0) Fax.: 33 (0) /2006 nr