1 płytka płytek

Transkrypt

1 Syphilis Total Ab 1 płytka płytek ZESTAWY DO JAKOŚCIOWEGO WYKRYWANIA PRZECIWCIAŁ TREPONEMA PALLIDUM W SUROWICY LUB OSOCZU KRWI LUDZKIEJ Z ZASTOSOWANIEM TECHNIKI ENZYMATYCZNEGO TESTU IMMUNOLOGICZNEGO /11

2 SPIS TREŚCI 1. PRZEZNACZENIE PODSUMOWANIE I OBJAŚNIENIE TESTU PODSTAWY PROCEDURY ODCZYNNIKI OSTRZEŻENIA I ŚRODKI OSTROŻNOŚCI PRÓBKI PROCEDURA OGRANICZENIE TESTU CHARAKTERYSTYKA DZIAŁANIA BIBLIOGRAFIA [PL] 2

3 1. PRZEZNACZENIE Zestawy przeznaczone są do stosowania przez pracowników prawidłowo przeszkolonych i wykwalifikowanych w zakresie jakościowego wykrywania przeciwciał Treponema pallidum w surowicy lub osoczu krwi ludzkiej. Produkt można stosować do wykonywania badań przesiewowych u dawców krwi i do wspomagania diagnozowania pacjentów z podejrzeniem zarażenia kiłą. 2. PODSUMOWANIE I OBJAŚNIENIE TESTU Kiła jest przewlekłą chorobą zakaźną, mającą wyraźne postaci: pierwotna, wtórna, późna (trzeciorzędowa) i czwartorzędowa. Postaci te mają odmienne objawy kliniczne, zazwyczaj są to początkowe owrzodzenia, znane jako wykwity pierwotne, następnie powstaje osutka, a w końcu pojawiają się długie okresy uśpienia choroby. Nieleczone zakażenia mogą ostatecznie powodować zaburzenia układu krążenia i kiłę układu nerwowego. Zakażenie powodują krętkitreponema pallidum; choroba jest zazwyczaj przenoszona drogą płciową, chociaż zdarzają się również przypadki zakażenia poprzez przetoczenie zakażonej krwi. Odnotowano również przypadki zakażeń wewnątrzmacicznych. Udowodniono, że w zasadzie nie można hodować tych drobnoustrojów na sztucznej pożywce i rozpoznanie zakażenia zazwyczaj zależy od obecności we krwi przeciwciał, które pojawiają się tuż po zakażeniu i mogą się utrzymywać przez wiele lat. Testy kiłowe dzielą się na cztery kategorie: bezpośrednie badanie mikroskopowe, testy przeciwciał krętkowych, testy na obecność przeciwciał niekrętkowych i bezpośrednie testy na obecność antygenu. Ze względu na długi okres uśpienia i nieswoisty charakter testów na obecność przeciwciał niekrętkowych, coraz popularniejsze stają się w badaniach przesiewowych metody wykrywające swoiste przeciwciała krętkowe w próbkach krwi. Jednym z takich testów jest Syphilis Total Ab. 3. PODSTAWY PROCEDURY Test Syphilis Total Ab wykorzystuje trzy rekombinowane antygeny do oznaczania w testach kanapkowych. Antygeny te wykrywają swoiste dla T. pallidum przeciwciała IgG, IgM i IgA, umożliwiając tym samym stosowanie tego testu do wykrywania przeciwciał we wszystkich stadiach zakażenia. Zagłębienia pokrywane są mieszanką rekombinowanych antygenów T. pallidum 15Kd, 17Kd i 47Kd. Swoiste przeciwciała w próbkach surowicy lub osocza łącza się z tymi antygenami i z tymi samymi antygenami skoniugowanymi z peroksydazą chrzanową po dodaniu koniugatu do zagłębienia, w którym próbka jest inkubowana. Po usunięciu nieprzereagowanego materiału przez przemywanie, obecność znacznika związanego enzymu, wskazującego na obecność w próbce swoistych przeciwciał, objawia się przez zmianę koloru w mieszaninie substratu/chromogenu. Intensywność zabarwienia jest porównywana do zagłębień kontrolnych, aby ustalić obecność lub brak określonych przeciwciał. [PL] 3

4 R1 R2 R3 R4 R6 4. ODCZYNNIKI Oznaczenia na etykiecie 4.1. Opis Microplate Concentrated Washing Solution (20X) Negative control Positive control Conjugate Opis Mikropłytka 12 pasków z 8 zagłębieniami pokrytych rekombinowanymi antygenami (rag) T. pallidum Specyficzny numer ID = 97 Stężony roztwór do płukania (20X) Bufor Tris NaCl ph 7,4 Środek konserwujący: ProClin 300 (0,04%) Ujemna surowica kontrolna Bufor Tris, zawierający BSA (surowicza albumina wołowa) Środek konserwujący: ProClin 300 (0,1%) Dodatnia surowica kontrolna (ludzka) Ludzka surowica zawierająca przeciwciała przeciwko T.pallidum ujemne dla HIV1/2, HBs Ag, HCV i rozcieńczone w buforze Tris zawierającym BSA (albuminę surowicy bydlęcej) Środek konserwujący: ProClin 300 (0,1%) Koniugat rag T.pallidum /peroksydaza Środek konserwujący: ProClin 300 (0,05%) Liczba/ Przygotowanie płytka 70 ml Do rozcieńczenia 2,1 ml 1,6 ml 8 ml Liczba/ Przygotowanie płytek 235 ml Do rozcieńczenia 2,1 ml 1,6 ml 30 ml R8 Substrate buffer Bufor substratu Roztwór kwasu cytrynowego i octanu sodu ph 4,0; zawierający H 2 O 2 (0,015%) i DMSO (4%) 60 ml Do odtworzenia 60 ml Do odtworzenia R9 Chromogen: TMB solution (11X) Chromogen: Roztwór TMB (różowy) Roztwór zawierający 3,3 -, 5,5 - tetrametylobenzydynę (TMB) 5 ml Do rozcieńczenia 5 ml Do rozcieńczenia R10 Stopping solution Roztwór przerywający reakcję Roztwór kwasu siarkowego (H 2 SO 4 1N) 28 ml 28 ml 4.2. Przechowywanie i postępowanie z produktem Zestaw należy przechowywać w temperaturze +2 8 C. Każdy element zestawu przechowywany w temperaturze +2 8 C może być stosowany aż do daty ważności wskazanej na opakowaniu (chyba że określono inaczej). Po otwarciu i przy braku skażenia odczynniki R3, R4, R6, R8, R9 i R10 przechowywane w temperaturze +2 8 C mogą być stosowane aż do daty ważności wskazanej na etykiecie. [PL] 4

5 Identyfikacja R1 R2 R8+R9 Przechowywanie w odpowiednich warunkach Po otwarciu torebki zamkniętej próżniowo paski z mikrozagłębieniami przechowywane przy temperaturze +2 8 C mogą być stosowane przez 1 miesiąc w oryginalnej, starannie zamkniętej ponownie torebce. Rozcieńczony roztwór do płukania może być przechowywany przez 2 tygodnie w temperaturze C. Stężony roztwór do płukania (R2) może być przechowywany w temperaturze C. Po odtworzeniu odczynniki przechowywane w ciemności mogą być używane w ciągu 6 godzin w temperaturze pokojowej (18 30 C). 5. OSTRZEŻENIA I ŚRODKI OSTROŻNOŚCI Do diagnostyki in vitro. Produkt przeznaczony wyłącznie do stosowania przez personel medyczny Instrukcje BHP: Ten zestaw przeznaczony jest wyłącznie do stosowania przez wykwalifikowany personel przeszkolony w zakresie procedur laboratoryjnych i zaznajomiony z wynikającymi z nich potencjalnymi zagrożeniami. Należy stosować odzież ochronną, rękawiczki, ochronę oczu i twarzy oraz posługiwać się zestawem zgodnie z zasadami dobrej praktyki laboratoryjnej. Zestaw testowy zawiera składniki krwi ludzkiej. Materiały pochodzenia ludzkiego stosowane do przygotowania odczynników zostały przetestowane i stwierdzono, że są niereaktywne względem antygenu powierzchniowego wirusowego zapalenia wątroby typu B (HBs Ag), przeciwciał przeciwko ludzkim wirusom niedoboru odporności (HIV-1 i HIV-2) i przeciwciał przeciwko wirusowi zapalenia wątroby typu C (HCV). Żadna znana metoda przeprowadzania testu nie gwarantuje braku obecności czynników zakaźnych. Z tego powodu z materiałem pochodzenia ludzkiego, odczynnikami i próbkami pobranymi od pacjentów należy postępować jak z materiałem potencjalnie zakaźnym, stosując uniwersalne środki ostrożności związane z patogenami krwiopochodnymi zdefiniowane przez przepisy lokalne, regionalne i krajowe. Skażenie biologiczne: Rozlany materiał pochodzenia ludzkiego należy traktować jako materiał potencjalnie zakaźny. Rozlany materiał niezawierający kwasu należy niezwłocznie usunąć i odkazić skażony obszar, materiały oraz wszelkie skażone powierzchnie lub wyposażenie za pomocą odpowiedniego chemicznego środka dezynfekującego skutecznie eliminującego potencjalne zagrożenie biologiczne związane z daną próbką (zwykle w tym celu należy użyć roztworu 1:10 wybielacza, 70 80% roztworu etanolu lub izopropanolu, jodoforu [np. 0,5% Wescodyne Plus itd.] i wytrzeć do sucha). Rozlany materiał zawierający kwas należy usunąć (zetrzeć) w odpowiedni sposób lub zneutralizować, a skażony obszar przemyć wodą i wytrzeć do sucha. Materiał użyty do zebrania rozlanego materiału należy zutylizować jako odpad potencjalnie niebezpieczny. Następnie należy odkazić skażony obszar za pomocą chemicznego środka dezynfekującego. UWAGA: Nie umieszczać roztworów zawierających wybielacz w autoklawie! Wszystkie próbki i materiał użyty do przeprowadzenia testu utylizować jak materiał potencjalnie zakaźny. Wszelkie odpady laboratoryjne, chemiczne i odpady stwarzające zagrożenie biologiczne należy przenosić i utylizować zgodnie z wszystkimi przepisami lokalnymi, regionalnymi i krajowymi. Zalecenia dotyczące zagrożeń i środków ostrożności związanych z substancjami chemicznymi znajdującymi się w tym zestawie testowym można znaleźć na piktogramach zamieszczonych na etykietach oraz w informacjach zamieszczonych na końcu niniejszej instrukcji obsługi. Karta charakterystyki substancji jest dostępna na stronie [PL] 5

6 5.2. Środki ostrożności związane z procedurą Przygotowanie Wiarygodność wyników jest zależna od prawidłowego wdrożenia następujących zasad dobrej praktyki laboratoryjnej: Nie używać przeterminowanych odczynników. Podczas danej serii testów nie mieszać ani nie łączyć odczynników pochodzących z różnych serii. Przed przystąpieniem do użytkowania należy zaczekać 30 minut, aby odczynniki ustabilizowały się w temperaturze pokojowej (18 30 C). Nazwa testu oraz specyficzny numer identyfikacyjny testu są zapisane na ramce każdej mikropłytki. Ten specyficzny numer identyfikacyjny jest podany także na każdym pasku. Syphilis Total Ab: Specyficzny numer ID = 97 Przed użyciem należy zweryfikować specyficzny numer identyfikacyjny. Jeśli numer identyfikacyjny jest niedostępny lub różni się od numeru odpowiadającemu oznaczeniu przeznaczonemu do testowania, to paska nie należy używać. UWAGA: W przypadku roztworu do płukania (R2, identyfikacja na etykiecie: 20X, w kolorze zielonym), buforu substratu peroksydazy (R8, identyfikacja na etykiecie: bufor TMB, w kolorze niebieskim), chromogenu (R9, identyfikacja na etykiecie: TMB 11X, w kolorze fioletowym) i roztworu przerywającego reakcję (R10, identyfikacja na etykiecie: 1N, w kolorze czerwonym) możliwe jest użycie odczynników innych niż te zawarte w zestawie, pod warunkiem, że ten sam odczynnik jest stosowany w ramach danego przebiegu testu. Te odczynniki mogą być stosowane z niektórymi innymi produktami naszej firmy. Szczegółowy informacji udziela nasz serwis techniczny. Ostrożnie przygotować odczynniki, unikając zanieczyszczenia. Używać szklanych naczyń, dokładnie umytych i opłukanych wodą dejonizowaną lub, o ile to możliwe, jednorazowego materiału. Nie pozwolić na wyschnięcie mikropłytki między zakończeniem operacji płukania a dystrybucją odczynników. Reakcja enzymatyczna jest bardzo wrażliwa na jony metali. Nie należy pozwolić na kontakt metalowego elementu z różnymi roztworami koniugatów lub substratów. Roztwór wywoławczy (bufor substratu + chromogen) musi być zabarwiony w kolorze różowym. Zmiana różowego koloru w ciągu kilku minut po rozpuszczeniu oznacza, że użycie odczynnika jest niemożliwe i należy go wymienić. Roztwór wywoławczy należy przygotować w czystej plastikowej tacy do jednorazowego użytku lub w zbiorniku szklanym umytym przy użyciu 1N HCl i dokładnie wypłukanym wodą destylowaną, a następnie osuszonym. Ten odczynnik należy przechowywać w ciemności. Nigdy nie używać tego samego zbiornika do dystrybucji koniugatu i roztworu wywoławczego Proces Nie wprowadzać zmian w procedurze oznaczania. Nie wykonywać testu przy obecności reaktywnych oparów (oparów kwasowych, zasadowych, aldehydowych) lub pyłu, który mógłby zmienić aktywność enzymatyczną koniugatu. Do każdej próbki należy użyć nowej końcówki do dystrybucji. Odpowiednie płukanie zagłębień jest krytycznym krokiem tej procedury: wykonać zalecaną liczbę cykli płukania i upewnić się, że każde z zagłębień jest całkowicie napełniane, a następnie całkowicie opróżniane. Niewłaściwe płukanie może prowadzić do niedokładnych wyników. Należy ściśle przestrzegać opisanych procedur płukania, aby uzyskać maksymalną wydajność testu. W przypadku niektórych przyrządów może być konieczne zoptymalizowanie procedury płukania (zwiększenie liczby cykli kroków lub objętości buforu płuczącego dla każdego cyklu) w celu uzyskania akceptowalnego poziomu OD dla próbki ujemnej. Informacje na temat adaptacji i procedur specjalnych można uzyskać w naszej firmie. 6. PRÓBKI Próbkę krwi pobrać zgodnie z obowiązującymi zasadami. Testy przeprowadzić na nierozcieńczonej surowicy lub osoczu (pobranych na EDTA, cytrynianie sodu, heparynie sodowej lub ACD) [PL] 6

7 Próbki zawierające cząstki stałe należy przed testem oczyścić przez wirowanie. Próbki należy przechowywać w temperaturze C, jeśli test ma być wykonany w ciągu 7 dni lub przechowywać w temperaturze -20 C przez dłuższy czas. Nie wykonywać cykli zamrażania/rozmrażania więcej niż 5 razy. Można stosować próbki, które zostały poddane obróbce cieplnej w temperaturze 56 C przez pół godziny. Próbki zawierające do 120 g/l albuminy, 200 mg/l bilirubiny, 33 g/l trioleiny albo 2 g/l hemoglobiny nie wpływają na wyniki. Nie jest jednak zalecane używanie skażonych hiperlipemicznie lub hiperhemolizowanych próbek surowicy bądź osocza. Przed przystąpieniem do wykonywania testu próbki powinny być rozmrożone i dobrze wymieszane. Jeśli próbki będą transportowane, należy zapakować je zgodnie z obowiązującymi regulacjami dotyczącymi transportu czynników etiologicznych i najlepiej transportować w stanie zamrożonym. 7. PROCEDURA 7.1. Wymagane materiały, które nie wchodzą w skład zestawu Woda destylowana. Podchloryn sodu (domowy wybielacz) i wodorowęglan sodu. Bibuła chłonna. Rękawiczki jednorazowe. Okulary ochronne. Jednorazowe probówki. Automatyczne lub półautomatyczne, regulowane lub wstępnie ustawione pipety lub pipety wielokanałowe do pomiaru i dozowania 50 µl, 1 ml i 10 ml. Cylindry miarowe o pojemności 100 ml i 1 l. Automatyczny, półautomatyczny lub ręczny system mycia mikropłytek (*). Inkubator do mikropłytek ustawiony termostatycznie na 37 C ± 1 C (*). Pojemnik na odpady niebezpieczne. Czytnik mikropłytek z filtrami 450 nm, 490 nm i nm (*). (*) Udzielamy szczegółowych informacji na temat sprzętu zalecanego przez nasz dział techniczny Przygotowanie odczynników Odczynniki gotowe do zastosowania Odczynnik 1 (R1): Mikropłytka Każda ramka zawierająca 12 pasków jest owinięta szczelnie zamkniętą torebką foliową. Przeciąć torebkę nożyczkami lub skalpelem 0,5 do 1 cm nad zgrzewem. Otworzyć torebkę i wyjąć ramkę. Ramkę z niewykorzystanymi paskami odłożyć z powrotem do torebki. Dokładnie zamknąć torebkę i umieścić w temperaturze +2 8 C. Odczynnik 3 (R3): Ujemna surowica kontrolna Odczynnik 4 (R4): Dodatnia surowica kontrolna Odczynnik 6 (R6): Koniugat Zhomogenizować przez odwracanie przed użyciem. Odczynnik 10 (R10): Roztwór przerywający reakcję Odczynniki do odtworzenia Odczynnik 2 (R2): Stężony roztwór do płukania (20X) Rozcieńczyć w stosunku 1:20 w wodzie destylowanej, aby uzyskać gotowy do użycia roztwór do przepłukiwania. Przygotować 800 ml dla jednej płytki zawierającej 12 pasków. [PL] 7

8 Odczynnik 8 (R8) + odczynnik 9 (R9): Roztwór wywoławczy enzymu Rozcieńczyć chromogen (R9) w buforze substratu w stosunku 1:11 (np. 1 ml odczynnika R ml odczynnika R8) przy założeniu, że 10 ml jest wymagane i wystarczające do przetworzenia 12 pasków. Wstrząsnąć, aby uzyskać zhomogenizowaną postać Procedura oznaczania Ściśle przestrzegać procedury. Użyć ujemnych i dodatnich surowic kontrolnych dla każdego testu w celu zweryfikowania jakości testu. Stosować zasady dobrej praktyki laboratoryjnej: 1) Dokładnie opracować plan dystrybucji i identyfikacji próbek. 2) Przygotować rozcieńczony roztwór do płukania R2 3) Wyjąć ramkę i wymaganą liczbę pasków (R1) z opakowania ochronnego. Niewykorzystane paski odłożyć z powrotem do opakowania. Zamknąć opakowanie i umieścić je w temperaturze +2 8 C. 4) Dystrybuować do zagłębienia w następującej kolejności (zalecana dystrybucja na płytce): 50 µl ujemnego wskaźnika (R3) do zagłębień A1, B1 i C1; 50 µl dodatniego wskaźnika (R4) do zagłębień D1 i E1; 50 µl nierozcieńczonej próbki do każdego zagłębienia, F1, G1, itd. 50 µl koniugatu (R6) do każdego zagłębienia. W zależności od stosowanego systemu możliwa jest zmiana pozycji wskaźników lub kolejności dystrybucji. Homogenizować mieszaninę reakcyjną, stosując co najmniej trzy aspiracje lub wytrząsać w wytrząsarce mikropłytek przez 5 sekund. UWAGA: Dystrybucja próbki i wskaźników może być na tym etapie manipulacji kontrolowana wzrokowo, ponieważ występuje różnica zabarwienia między pustym zagłębieniem i zagłębieniem z próbką. Dozować koniugat w ciągu 5 minut po dystrybucji próbki. Istnieje wyraźna różnica zabarwienia między pustym zagłębieniem a zagłębieniem zawierającym czerwony roztwór koniugatu (R6) (patrz 7.7) 5) Jeśli to możliwe, nakryć płytkę folią samoprzylepną. 6) Poddać mikropłytkę inkubacji w przez 30 do 35 minut w temperaturze 37 C ± 1 C. 7) W razie potrzeby zdjąć folię samoprzylepną. Zassać zawartość wszystkich zagłębień do pojemnika na odpady ciekłe i dodać do każdego zagłębienia co najmniej 370 µl roztworu do płukania. Zassać ponownie i powtórzyć płukanie co najmniej 4 razy (łącznie 5 cykli). Pozostała objętość musi być mniejsza niż 10 µl (w razie potrzeby osuszyć paski, odwracając je na chłonnej bibule). W przypadku stosowania myjki automatycznej postępować zgodnie z tą samą procedurą. UWAGA: W ciągu 20 minut przejść do kroku płukania. 8) Przygotować roztwór wywoławczy (odczynnik R8 + R9). 9) Szybko dozować do każdego zagłębienia 50 µl roztworu wywoławczego (R8+R9), przygotowanego bezpośrednio przed użyciem. Pozwolić na przeprowadzenie reakcji w ciemności przez 25 do 35 minut w temperaturze pokojowej (18 30 C). W czasie tej inkubacji nie używać folii samoprzylepnej. UWAGA: Na tym etapie można kontrolować wzrokowo dystrybucję roztworu wywoławczego, który jest różowy. Istnieje wyraźna różnica zabarwienia między pustym zagłębieniem a zagłębieniem zawierającym różowy roztwór substratu. (patrz 7.7). 10) Dodać 50 µl roztworu przerywającego reakcję (R10) w tej samej kolejności i w tym samym rytmie, co przy dodawaniu roztworu substratu. Zhomogenizować mieszaninę reakcyjną. UWAGA: Na tym etapie manipulacji można kontrolować wzrokowo dystrybucję bezbarwnego roztworu przerywającego reakcję. Kolor substratu, różowy (w przypadku próbek ujemnych) lub niebieski (w przypadku próbek dodatnich), blaknie w zagłębieniach, które stają się bezbarwne [PL] 8

9 (w przypadku próbek ujemnych) lub żółte (w przypadku próbek dodatnich) po dodaniu roztworu przerywającego reakcję. 11) Ostrożnie wytrzeć spód płytki. Zaczekać co najmniej 4 minuty roztworu przerywającego reakcję i w ciągu 30 minut od zatrzymania reakcji odczytać gęstość optyczną przy 450/ nm, używając czytnika płytek. 12) Sprawdzić zgodność odczytów spektrofotometrycznych i wizualnych oraz dystrybucji płytek i próbek oraz planu identyfikacyjnego Kontrola jakości Użyć wskaźnika ujemnego (R3) oraz dodatniego (R4) dla każdego przebiegu w celu zweryfikowania wyników testów. (Patrz 7.5) Kryteria walidacji testu Test jest zweryfikowany, jeśli są spełnione poniższe warunki: 1) W przypadku wskaźnika ujemnego R3: OD R3 0,080 Jeśli wartość kontrolna jest wyższa niż ta wartość, nie należy jej brać pod uwagę i przeprowadzić obliczenia używając dwóch pozostałych ujemnych wartości kontrolnych. 2) W przypadku wskaźnika dodatniego R4: OD R4 0, Obliczanie/interpretacja wyników Wartość graniczną określa się przy użyciu wskaźnika ujemnego R3: Obliczyć średnią wartość absorbancji mierzoną dla wskaźnika ujemnego R3 i obliczyć wartości odcięcia (COV) w następujący sposób: COV = średnia wartość OD R3 + 0,100 Próbki z OD mniejszym niż COV są uważane za ujemne dla Syphilis Total Ab. Wyniki tuż poniżej wartości odcięcia (COV -10% <OD < COV) powinny być jednak interpretowane z ostrożnością. Jeśli zezwalają na to systemy i procedury laboratoryjne, zaleca się ponowne przetestowanie duplikatu odpowiednich próbek. Próbki o OD wyższym niż lub równym COV są uważane za dodatnie dla Syphilis Total Ab; przed wykonaniem ostatecznej interpretacji należy ponownie przetestować duplikaty. Ponownie przetestowane próbki, które dają wynik powyżej COV w co najmniej jednym duplikacie są uważane za dodatnie i powinny być poddane dalszej weryfikacji. Próbki, których wynik jest poniżej odcięcia dla obydwóch duplikatów, są uważane za ujemne. W przypadku bardzo niskiej gęstości optycznej testowanych próbek (ujemna wartość OD) i kontrolowania obecności odczynników oraz próbek wyniki mogą być interpretowane jako ujemne. Zaleca się potwierdzenie dodatnich próbek, postępując zgodnie z obowiązującymi krajowymi zaleceniami i algorytmami Spektrofotometryczna weryfikacja próbki i pipetowanie koniugatu (opcjonalnie) Próbki i kontrole Obecność próbek i kontroli w zagłębieniach można zweryfikować przez automatyczny odczyt przy 450/620 nm. Zagłębienie z dodaną próbką będzie mieć gęstość optyczną (OD) od 0,050 do 1,100. Koniugat Koniugat ma kolor czerwony. [PL] 9

10 Obecność koniugatu w zagłębieniach można kontrolować przez automatyczny odczyt przy 450/620 nm. Zagłębienie z próbką i koniugatem będzie mieć OD 1,200. Weryfikacja pipetowania roztworu wywoławczego Możliwe jest zweryfikowanie obecności różowego roztworu wywoławczego w zagłębieniu przez automatyczny odczyt przy 492 nm. Zagłębienie z roztworem wywoławczym musi mieć gęstość optyczną >0,100 (mniejsza wartość OD oznacza nieodpowiednie dozowanie roztworu wywoływacza). 8. OGRANICZENIE TESTU Jak w przypadku wszystkich testów serologicznych w kierunku kiły, w celu przedstawienia całościowej diagnozy klinicznej należy użyć interpretacji wyników uzyskanych w ramach testu Syphilis Total Ab EIA w połączeniu z objawami klinicznymi pacjenta, historią choroby i innymi wynikami badań laboratoryjnych. Nie ma jednego testu lub ostatecznego standardu odniesienia dla każdego stadium choroby. Diagnostyka kiły opiera się zatem głównie na badaniach serologicznych, wymagających wyników z metod bezkrętkowych i krętkowych. Żaden test diagnostyczny nie zapewnia absolutnej pewności, że próbka nie zawiera niskiego poziomu przeciwciał przeciwko T. pallidium, takich jak obecne w bardzo wczesnym stadium infekcji. Dlatego też ujemny wynik uzyskany w dowolnym momencie nie wyklucza możliwości narażenia na zakażenie kiłą. Wszelkie techniki ELISA mogą zwracać wyniki fałszywie dodatnie. Zaleca się sprawdzanie swoistości reakcji dowolnej próbki, która wielokrotnie dawała wynik dodatni, według kryteriów interpretacji zestawu Syphilis Total Ab, stosując odpowiednią metodę: Test hemoglutynacji Treponema pallidum. Wszystkie wyniki krętkowe mają tendencję do pozostawania reaktywnymi po zakażeniu krętkami, dlatego nie powinny być wykorzystywane do oceny odpowiedzi na leczenie. Ze względu na utrzymującą się reaktywność, na ogół przez całe życie pacjenta, testy w kierunku krętków nie mają żadnej wartości w ustalaniu nawrotów lub ponownego zakażenia pacjenta, który miał wynik reaktywny. W takim wypadku zaleca się zastosowanie innej metody oznaczania: Syphilis IgM EIA, RPR i TPHA. Spektrofotometryczna metoda weryfikacji próbek, koniugatu, osadu roztworu wywoławczego nie umożliwia zweryfikowania dokładności dozowanej objętości próbek i koniugatu. Ta metoda pokazuje jedynie obecność próbki i koniugatu. Współczynnik błędów przy stosowaniu tej metody jest ściśle związany z dokładnością używanego systemu (skumulowany współczynnik zmienności powyżej 10% dla dozowania i odczytywania znacznie obniża jakość tego etapu). 9. CHARAKTERYSTYKA DZIAŁANIA 9.1. Dokładność pomiaru Powtarzalność i dokładność pośrednia zostały ustalone przy użyciu próbek z różnymi stężeniami przeciwciał kiły. Próbki testowano 30 razy w tej samej serii testów w celu określenia powtarzalności. Próbki były również badane w dwóch duplikatach w ciągu 20 dni, po dwa testy dziennie. Obliczano średnie współczynniki, standardowe odchylenia (SD) i współczynniki zmienności (CV). [PL] 10

11 Powtarzalność: Próbki N Średni współczynnik Odchylenie standardowe CV % Niski ujemny 30 0,14 0,014 9,5% Wysoki ujemny 30 0,68 0,051 7,5% Niski dodatni Syphilis ab 30 1,90 0,070 3,7% Dodatni Syphilis ab 30 3,76 0,130 3,5% CV uzyskane z pozytywnych próbek są poniżej 10%. Dokładność pośrednia Próbki N Średni współczynnik Oznaczenie wewnętrzne Oznaczenie pośrednie / Operator Dzień pośredni Powtarzalność całkowita SD CV % SD CV % SD CV % SD CV % Niski ujemny 80 0,15 0,035 22,5% 0,023 14,7% 0,017 10,9% 0,045 29,0% Wysoki ujemny 80 0,74 0,038 5,1% 0,074 10,0% 0,006 0,8% 0,084 11,2% Niski dodatni Syphilis ab Dodatni Syphilis ab 80 2,30 0,112 4,9% 0,312 13,5% 0,099 4,3% 0,346 15,0% 80 4,13 0,180 4,3% 0,543 13,1% 0,195 4,7% 0,604 14,6% CV uzyskane z próbek dodatnich są poniżej lub równe 15% Działanie kliniczne Działanie kliniczne oznaczania w teście Syphilis Total Ab ustalono testując próbki z badań prospektywnych i retrospektywnych: Badanie prospektywne: próbek od losowo dobranych dawców krwi; próbek od pacjentów, u których podejrzewano kiłę Badanie retrospektywne: - Wynik dodatni u 350 pacjentów z chorobami przenoszonymi drogą płciową. Badania przeprowadzono w dwóch punktach krwiodawstwa, w centrum chorób przenoszonych drogą płciową i w ośrodku Bio-Rad Swoistość diagnostyczna Badanie przeprowadzono na próbkach surowicy i osocza EDTA, zebranych na dwóch bankach krwi od przypadkowych dawców we Francji. Badanie swoistości przeprowadzono również na próbkach pobranych od pacjentów. Wszystkie wyniki porównano z wynikami uzyskanymi z innych testów w kierunku kiły z oznaczeniem CE. [PL] 11

12 Tabela 1: Swoistość testu (IR = początkowa reaktywny; RR = powtarzalnie reaktywny) Populacja Ośrodek Typ próbki Dawcy krwi #1 + #2 Łączna liczba próbek Początkow o reaktywne (IR) Powtarzaln ie reaktywne (RR) Swoistość RR (%) Surowica SST * 3125/3125 Osocze EDTA K * 2066/2066 Razem * Pacjenci #3 Surowica % 5191/ ,72% 350/351 95% CI (%) 99,93% 100% 98,42 100% *Powtarzalnie reaktywne próbki dające wynik dodatni z innymi EIA z oznaczeniem CEOznaczanie w kierunku kiły zostały wykluczone z obliczeń swoistości diagnostycznej Czułość diagnostyczna Badanie retrospektywne: Badanie przeprowadzono na 350 zamrożonych próbkach, z których dwie próbki dały wynik ujemny i 348 dało potwierdzony wynik dodatni z oznaczeniem CE w kierunku kiły. Spośród tych 348 próbek dodatnich, 7 próbek pochodziło od pacjentów z wczesnym stadium zakażenia. Wszystkie 348 próbki dały wynik pozytywny przy zastosowaniu testu Bio-Rad Syphilis Total Ab. Badanie prospektywne: Stosując test Syphilis Total Ab firmy Bio-Rad zbadano łącznie 460 świeżych próbek i porównano je z wynikami testów w kierunku kiły z oznaczeniem CE. Uzyskano 348 wyników ujemnych zarówno w testach Bio-Rad i referencyjnych (wyniki dwóch próbek zostały błędnie oznaczone jako fałszywie dodatnie względem testu referencyjnego EIA) W obydwóch badaniach testowych stwierdzono 109 wyników dodatnich. Trzy próbki wykazywały sprzeczne wyniki (po powtórnym przetestowaniu testem Bio-Rad): W teście Bio-Rad 1 próbka dała wynik dodatni i wysoce ujemny w testach referencyjnych. Ta próbka z niskim wskaźnikiem kiły była na granicy wartości odcięcia dla obu testów EIA: 1 próbka z wynikiem dodatnim w testach referencyjnych, z wynikiem ujemnym w teście Bio- Rad (od 1 pacjenta bez objawów) 1 próbka z wynikiem dodatnim z testów referencyjnych, z wynikiem ujemnym IR i dodatnim z ponowionego testu Bio-Rad. Badania retrospektywne i prospektywne: Ogólna czułość diagnostyczna jest równa 99,56% (457/459) z przedziałem ufności na poziomie 95% [98,44% z 99,95%]. Czułość kliniczna: Zbadano również czułość kliniczną w 3 panelach komercyjnych i 1 panelu serokonwersji. Test Syphilis Total Ab firmy Bio-Rad porównano z testami w kierunku kiły z oznaczeniem CE. Wykrywanie każdej próbki paneli jest równoważne między testem Bio-Rad oraz testami referencyjnymi w kierunku kiły Czułość analityczna Czułość analityczna została oceniona według 2 norm NIBSC i obliczana według wartości odcięcia za pomocą regresji: 1. Granica wykrywalności dla IgG/IgM była oceniana na 3 seriach testu Syphilis Total Ab i oszacowana na 0,53 miu/ml z 95% CI [0,10 miu/ml 1,30 miu/ml] przy użyciu normy WHO dla IgM/IgG (kod NIBSC: 05/132). 2. Granica wykrywalności dla IgG była oceniana na 1 serii testu Syphilis Total Ab i oszacowana na 0,11 miu/ml z 95% CI [0,02 miu/ml 0,27 miu/ml] przy użyciu normy WHO dla IgG (kod NIBSC: 05/122). [PL] 12

13 9.4. Swoistość analityczna / badanie reaktywności krzyżowej W teście Syphilis Total Ab zbadano łącznie 125 potencjalnie zakłócających próbek zawierających przeciwciała patogenów, które mogą prowadzić do chorób zakaźnych (Lyme, toksoplazmoza, EBV, Leptospiroza, SLE (toczeń), przeciwciała wirusowego zapalenia wątroby typu A, przeciwciała wirusowego zapalenia wątroby typu B, przeciwciała wirusowego zapalenia wątroby typu C, HTLV I/II i HIV) lub próbki od pacjentów z grupy ryzyka (kobiety w ciąży i kobiety wieloródki) bądź próbki od pacjentów z zaburzeniami układu odpornościowego (czynnika reumatoidalnego). Wśród zbadanych 125 próbek 1 próbka dała wynik powtarzalnie dodatni w teście Syphilis Total Ab; próbka ta została zweryfikowana jako prawdziwa w badaniach z użyciem innych testów EIA z oznaczeniem CE i testów potwierdzających. Swoistość zaobserwowana na tej populacji wynosi 100% (124/124), z 95% przedziałem ufności [97,1% 100,0%] Efekt haka Istnienie ewentualnego wpływu haka przebadano testując 6 próbek z wynikiem dodatnim w kierunku kiły, z wysokimi mianami w różnych rozcieńczeniach. Równoważność wyników obserwowanych w nierozcieńczonej i rozcieńczonej próbce wskazuje na brak efektu haka na badanych próbkach. 10. BIBLIOGRAFIA 1. Levinson SS. The Nature of Heterophilic Antibodies and Their Role in Immunoassay Interference. J. Clin. Immunoassay 15: , Norris S.J. Plypeptides of Treponema pallidum: Progress toward understanding their structural, functional and immunological role. Microbiological Reviews, Setpt Vol Larsen SA, Steiner BM, and Rudolph AH. Laboratory diagnosis and interpretation of tests for syphilis. Clin Microbiol Rev Jan; 8(1): Zrein M, Maure I, Boursier F, Soufflet L. Recombinant antigen-based enzyme immunoassay for screening of Treponema pallidum antibodies in blood bank routine. J Clin Microbol Mar; 33(3): Singh AE and Romanowski. Syphilis: Review with emphasis on clinical, epidemiological, and some biologic features. Clin Microbiol Rev Apr; 12(2): Stability of selected serum proteins after long-term storage in the Janus Serum Bank. Clin Chem Lab Med : International Journal of STD & AIDS 2009; 20: Screening donated Blood for Transfusion-Transmissible infections. World Health Organization M. J. Loeffelholz, and M. J. Binnicker, 'It Is Time to Use Treponema-Specific Antibody Screening Tests for Diagnosis of Syphilis', J Clin Microbiol, 50 (2012), 2-6. [PL] 13

14 [PL] 14

15 [PL] 15

16 [PL] 16

17 [PL] 17

18 Bio-Rad 3, Boulevard Raymond Poincaré Marnes-la-Coquette Francja Tel.: +33 (0) Faks: +33 (0) / [PL] 18