/11 1. ZASTOSOWANIE

Transkrypt

1 PLATELIA CMV IgG 1 płytka TEST IMMUNOENZYMATYCZNY DO ILOŚCIOWEGO WYKRYWANIA PRZECIWCIAŁ KLASY IgG PRZECIWKO WIRUSOWI CYTOMEGALII W LUDZKIEJ SUROWICY LUB OSOCZU /11 1. ZASTOSOWANIE Platelia CMV IgG jest pośrednim testem immunoenzymatycznym ELISA do ilościowego oznaczania przeciwciał IgG anty-cmv w ludzkiej surowicy lub osoczu. 2. ZNACZENIE KLINICZNE Ludzki cytomegalowirus (CMV) jest wirusem powszechnie występującym we wszystkich regionach geograficznych na świecie oraz we wszystkich grupach socjoekonomicznych. CMV należy do rodziny Hespervirus i jest przenoszony poprzez płyny ustrojowe w czasie bliskich kontaktów międzyludzkich (w moczu, ślinie, mleku matki, krwi, łzach, spermie i wydzielinie pochwy). Po zakażeniu CMV może przez lata pozostawać w stanie uśpienia w ciele zakażonych osób, a następnie reaktywuje się powodując nawracające infekcje z ryzykiem przeniesienia na inne osoby. Infekcja pierwotna zachodzi różnymi drogami i w różnych okresach życia (infekcje wrodzone, infekcje poporodowe). Po okresie uśpienia, może nastąpić infekcja wtórna w wyniku powtórnej infekcji wirusem egzogennym lub reaktywacji uśpionego wirusa. Od 50 do 85% populacji zostaje zakażone przed osiągnięciem wieku dorosłego, ale wiele zakażeń ma charakter bezobjawowy, jedynie 2% pacjentów wykazuje atypowe objawy, takie jak gorączka, osłabienie, bóle mięśni i stawów. Jednakże, infekcja CMV może mieć poważny przebieg u kobiet w ciąży, noworodków i nosicieli pozbawionych obrony immunologicznej. W czasie ciąży u od 1 do 3% kobiet dochodzi do zakażenia CMV, a przeniesienia zakażenia na płód drogą dyfuzji przez łożysko występuje u 40-50% pacjentów. 95% infekcji płodu jest bezobjawowych, ale u 5% komplikacje są bardzo poważne: hepatosplenomegalia, małogłowie, wodogłowie, wcześniactwo, opóźnienie psychoruchowe oraz śmierć płodu. W 10% infekcji bezobjawowych u noworodków dochodzi do późnych powikłań, takich jak częściowa lub całkowita utrata słuchu lub wzroku. W przypadku pacjentów pozbawionych obrony immunologicznej (AIDS, biorcy organów, choroby limfoproliferacyjne lub nowotwór) z rozsianymi i/lub wewnętrznymi infekcjami związane są poważne komplikacje: splenomegalia, zapalenie naczyniówki i siatkówki, zapalenie wątroby, zapalenie mięśnia sercowego, zapalenie mózgu. Infekcja u w takich przypadkach może mieć skutek śmiertelny. Kilka tygodni po zakażeniu CMV, reakcja układu immunologicznego prowadzi do powstania swoistych przeciwciał klasy IgM oraz po kolejnych kilku dniach, swoistych przeciwciał klasy IgG. Diagnostyka serologiczna zakażenia CMV polega na stwierdzeniu serokonwersji lub znaczącego wzrost miana przeciwciał IgG. Wykrycie swoistych przeciwciał IgG anty- CMV pomaga w diagnozie infekcji pierwotnej oraz określeniu statusu immunologicznego pacjentów. 3. ZASADA TESTU Platelia CMV IgG jest pośrednim testem immunoenzymatycznym ELISA do wykrywania i oznaczania miana przeciwciał klasy IgG anty-cmv w ludzkiej surowicy lub osoczu. Do opłaszczenia mikropłytki stosowany jest zinaktywowany antygen CMV. Jako koniugat używane jest znakowane peroksydazą, poliklonalne przeciwciało swoiste dla ludzkich łańcuchów gamma (anty-igg). Wykonanie oznaczenia obejmuje następujące etapy: Etap 1 Próbki od pacjentów i kalibratory są rozcieńczane w stosunku 1/21, a następnie przenoszone do studzienek mikropłytki. W czasie 1 godziny inkubacji w 37 C, przeciwciała IgG CMV obecne w próbce wiążą się z antygenem CMV na ściankach studzienek mikropłytki. Po inkubacji niezwiązane nieswoiste przeciwciała oraz inne białka surowicy są usuwane przez wymywanie. Etap 2 Koniugat (znakowane peroksydazą, poliklonalne przeciwciało swoiste dla ludzkich łańcuchów gamma) jest dodawany do studzienek mikropłytki. W czasie 1 godziny inkubacji w 37 C, znakowane przeciwciało wiąże się z IgG surowicy związanym przez antygen CMV. Niezwiązany koniugat jest usuwany przez wymywanie na końcu inkubacji. 1

2 Etap 3 Obecność kompleksów immunologicznych (antygen CMV, przeciwciała IgG CMV, koniugat anty-igg) jest wykazywana przez dodanie do każdej studzienki roztworu substratu dla enzymu. Etap 4 Po inkubacji w temperaturze pokojowej ( C), reakcja enzymatyczna jest zatrzymywana przez dodanie 1N roztworu kwasu siarkowego. Wartość gęstości optycznej odczytana przy pomocy spektrofotometru ustawionego na 450/620 nm jest proporcjonalna do ilości przeciwciał IgG CMV obecnych w próbce. 4. SKŁAD ZESTAWU Odczynniki wystarczają na wykonanie 96 oznaczeń. Wszystkie odczynniki zestawu służą wyłącznie do diagnostyki in vitro. Etykieta Postać odczynnika Prezentacja R1 Mikropłytka Mikropłytka (gotowa do użytku) 12 pasków z 8 odłamywanymi studzienkami opłaszczonymi nieaktywnym antygenem CMV R2 Stężony roztwór do płukania (20x) Stężony roztwór do płukania (20x) Bufor TRIS-NaCl (ph 7,4), 2% Tween 20 Konserwant: 0,04% ProClin 300 R3 Kalibrator 0 Kalibrator 0 Ujemna w kierunku IgG anty-cmv, HBsAg, anty-hiv1, anty- HIV2 i anty-hcv surowica ludzka R4a Kalibrator 0,4 Kalibrator 0,4 AU/ml Surowica ludzka reaktywna dla przeciwciał IgG CMV i nierektywna w kierunku antygenu HBs, anty-hiv1, anty-hiv2 i anty-hcv R4b Kalibrator 1 Kalibrator 1 AU/ml Surowica ludzka reaktywna dla przeciwciał IgG CMV i nierektywna w kierunku antygenu HBs, anty-hiv1, anty-hiv2 i anty-hcv R4c Kalibrator 4 Kalibrator 4 AU/ml Surowica ludzka reaktywna dla przeciwciał IgG CMV i nierektywna w kierunku antygenu HBs, anty-hiv1, anty-hiv2 i anty-hcv R4d Kalibrator 10 Kalibrator 10 AU/ml Surowica ludzka reaktywna dla przeciwciał IgG CMV i nierektywna w kierunku antygenu HBs, anty-hiv1, anty-hiv2 i anty-hcv R6 Koniugat (51x) Koniugat (51 x) Kozie poliklonalne przeciwciało przeciw ludzkim łańcuchom gamma znakowane peroksydazą chrzanu Konserwant: 0,16% ProClin 300 R7 Rozcieńczalnik Rozcieńczalnik do próbek i koniugatu (gotowy do użytku) Tris-NaCl (ph 7,7), albumina bydlęca, glicerol, 0,1% Tween 20, czerwień fenolowa R9 Chromogen TMB Chromogen (gotowy do użytku) 3,3,5,5 czterometylobenzydyna (< 0,1%), H 2 O 2 (<1%) 1 mikropłytka 70 ml 0,75 ml 0,75 ml 0,75 ml 0,75 ml 0,75 ml 0,7 ml 80 ml 28 ml R10 Roztwór zatrzymujący reakcję Roztwór zatrzymujący reakcję (gotowy do użytku) Roztwór 1N kwasu siarkowego 28 ml Informacje dotyczące warunków przechowywania i daty ważności znajdują się na opakowaniu. 2

3 5. ZALECENIA DLA UŻYTKOWNIKA Wiarygodność wyników zależy od przestrzegania zasad Dobrej Praktyki Laboratoryjnej: Nie używać przeterminowanych odczynników. Podczas jednego oznaczenia używać wyłącznie odczynników o tym samym numerze serii. UWAGA: W przypadku roztworu do płukania (R2, etykieta: 20x koloru zielonego), chromogenu (R9, etykieta: TMB koloru turkusowego) oraz roztworu zatrzymującego reakcję (R10, etykieta: 1N koloru czerwonego), możliwe jest użycie innych serii niż zawarte w zestawie, pod warunkiem, że odczynniki te są identyczne i w danym badaniu używana jest ta sama seria. UWAGA: Dodatkowo w przypadku roztworu do płukania (R2, etykieta: 20x koloru zielonego), możliwe jest zmieszanie z dwoma innymi roztworami znajdującymi się w różnych zestawach odczynników Bio-Rad (R2, etykiety: 10x koloru niebieskiego lub 10x koloru pomarańczowego) przy prawidłowym ich rozcieńczeniu, pod warunkiem, że w danym badaniu używana jest tylko jedna mieszanina. Przed użyciem należy odczekać 30 minut, aby pozwolić odczynnikom osiągnąć temperaturę pokojową ( C). Ostrożnie rozcieńczyć lub rozpuścić odczynniki nie dopuszczając do zanieczyszczenia. Nie przeprowadzać testu w obecności reaktywnych oparów (kwasów, zasad i aldehydów) lub kurzu, które mogą wpłynąć na aktywność enzymatyczną koniugatu. Używać dokładnie umytych naczyń szklanych po przepłukaniu ich wodą dejonizowaną lub, jeśli to możliwe, naczyń jednorazowego użytku. Mycie mikropłytki jest bardzo ważnym etapem procedury: należy przeprowadzić zalecaną liczbę cykli mycia i upewnić się, że studzienki zostaną całkowicie wypełnione, a następnie całkowicie opróżnione. Nieprawidłowe mycie może być powodem błędnych wyników. Nie dopuszczać do wyschnięcia mikropłytek po zakończeniu mycia i przed wprowadzeniem odczynników. Nigdy nie używać tego samego pojemnika na koniugat i roztwór substratu, wywołujący reakcję barwną. Reakcja enzymatyczna jest bardzo wrażliwa na obecność metalu lub jonów metali. Z tego powodu nie można pozwolić na kontakt żadnego metalowego elementu z różnymi roztworami zawierającymi koniugat lub chromogen. Roztwór chromogenu (R9) powinien być bezbarwny. Pojawienie się niebieskiego koloru oznacza, że odczynnik nie nadaje się do użycia i należy go wymienić. Do każdej próbki należy używać nowej końcówki pipety. Należy skontrolować pipety i inny sprzęt pod względem dokładności i prawidłowego działania. BEZPIECZEŃSTWO I HIGIENA PRACY Materiał pochodzenia ludzkiego użyty do przygotowania odczynników został przebadany i wykazał brak reaktywności w kierunku antygenu powierzchniowego wirusa zapalenia wątroby typu B (HBs Ag), przeciwciał przeciw wirusowi zapalenia wątroby typu C (anty-hcv) oraz wirusom ludzkiego niedoboru odporności (anty-hiv1 i anty-hiv2). Ponieważ nie ma metod absolutnie wykluczających obecność czynników zakaźnych, odczynniki pochodzące z materiału ludzkiego powinny być traktowane jako materiał potencjalnie zakaźny: Każdy materiał, łącznie z roztworami do płukania, który wejdzie w bezpośredni kontakt z próbkami i odczynnikami zawierającymi materiał pochodzenia ludzkiego, należy traktować jako potencjalnie zakaźny. Podczas pracy z próbkami i odczynnikami należy używać rękawiczek jednorazowych. Nie pipetować ustami. Unikać rozlewania próbek lub roztworów zawierających próbki. Miejsca, w których nastąpiło rozlanie należy przepłukać wybielaczem rozcieńczonym do 10%. W przypadku rozlania kwasu, należy go najpierw zneutralizować wodorowęglanem sodu, a następnie przemyć miejsce rozlania wybielaczem rozcieńczonym do 10% i osuszyć papierem chłonnym. Materiał użyty do czyszczenia należy wyrzucić do pojemnika ze skażonymi odpadami. Próbki pacjentów, odczynniki zawierające materiał pochodzenia ludzkiego oraz skażony materiał i produkty należy wyrzucać dopiero po ich odkażeniu: - przez zanurzenie w wybielaczu w stężeniu 5% podchlorynu sodu na 30 minut - lub przez sterylizacje w autoklawie w 121 C przez co najmniej 2 godziny. UWAGA: Nie wprowadzać do autoklawu roztworów zawierających podchloryn sodu Unikać kontaktu ze skórą i błoną śluzową wszelkich odczynników, również tych uważanych za bezpieczne. Chemiczne i biologiczne pozostałości należy traktować i utylizować zgodnie z dobrymi praktykami laboratoryjnymi. Wszystkie odczynniki w zestawie są przeznaczone wyłącznie do diagnostycznego użytku in vitro. W celu zapoznania się z zaleceniami dotyczącymi zagrożeń i środków ostrożności związanych z niektórymi substancjami chemicznymi zawartymi w niniejszym zestawie należy skorzystać z piktogramów wskazujących rodzaj zagrożenia znajdujących się na etykietach i w informacjach zamieszczonych na końcu instrukcji obsługi. Karta charakterystyki jest dostępna na stronie internetowej 3

4 6. PRÓBKI 1. Zalecanymi typami próbek są surowica i osocze (EDTA, heparyna lub cytrynian). 2. Podczas przetwarzania, przechowywania i pracy z próbkami krwi należy stosować się do poniższych zaleceń: Próbki krwi należy pobrać zgodnie z rutynową procedurą, z wkłucia dożylnego. Próbki surowicy pozostawić do powstania skrzepu przed odwirowaniem. Próbówki z próbkami przez cały czas powinny być zamknięte. Po odwirowaniu jak najszybciej oddzielić surowicę lub osocze od czerwonych krwinek i przenieść do szczelnie zamykanej próbówki. Jeśli test będzie wykonany w ciągu 7 dni, próbki można przechować w temp C. Jeśli test będzie wykonany później, lub próbki będą transportowane, należy je zamrozić w temp. -20 C lub niższej. Nie należy używać próbek, które zostały rozmrożone więcej niż pięć razy. Wcześniej zamrożone próbki powinny być po rozmrożeniu dokładnie zmieszane (vortex) przed przystąpieniem do oznaczenia. 3. Próbki zawierające 90 g/l albuminy lub 100 mg/l wolnej bilirubiny, próbki lipemiczne zawierające ekwiwalent 36 g/l oleiny (trójglicerydu) oraz hemolizowane próbki zawierające do 10 g/l hemoglobiny nie mają wpływu na wyniki. 4. Nie należy podgrzewać próbek. 7. PROCEDURA OZNACZENIA 7.1 Wymagane materiały, które nie znajdują się w zestawie Worteks. Czytnik mikropłytek wyposażony w filtry 450 nm i 620 nm (*). Inkubator mikropłytek ustawiony termostatycznie na 37±1 C (*). Automatyczna, półautomatyczna lub ręczna płuczka mikropłytek (*). Jałowa woda destylowana lub dejonizowana. Rękawiczki jednorazowego użytku. Gogle lub okulary ochronne. Papier chłonny. Automatyczne lub półautomatyczne pipety lub multipipety regulowane lub ze stałym ustawieniem do odmierzania i wprowadzania od 10 µl do 1000 µl, oraz 1 ml, 2 ml i 10 ml. Cylindry z podziałką pojemności 25 ml, 50 ml, 100 ml i 1000 ml. Podchloryn sodu (wybielacz) i wodorowęglan sodu. Pojemnik na odpady niebezpieczne dla człowieka i środowiska. Fiolki jednorazowego użytku. (*) Szczegółowe informacje na temat zalecanego sprzętu można uzyskać kontaktując się z działem technicznym naszej firmy. 7.2 Rozcieńczanie odczynników R1: Przed otwarciem pozostawić torebkę na 30 minut w temperaturze pokojowej ( C). Wyciągnąć ramkę, niewykorzystane paski natychmiast schować z powrotem do torebki i sprawdzić obecność środka osuszającego. Dokładnie zamknąć ponownie torebkę i przechowywać w temperaturze +2-8 C. R2: Rozpuścić roztwór do płukania R2 w stosunku 1/20 w wodzie destylowanej: na przykład 50 ml R2 i 950 ml wody destylowanej w celu otrzymania gotowego do użytku roztworu do płukania. Przygotować 350 ml rozcieńczonego roztworu do płukania dla jednej płytki z 12 paskami w przypadku mycia manualnego. R3, R4a, R4b, R4c, R4d: Rozcieńczyć w rozcieńczalniku (R7) w stosunku 1/21 (przykład: 300 µl R µl kalibratora). R6+R7: Koniugat (R6) jest koncentratem 51x i przed użyciem musi być poddany homogenizacji. Rozcieńczyć w rozcieńczalniku (R7) w stosunku 1/51. Dla jednej płytki rozcieńczyć 0,5 ml koniugatu (R6) w 25 ml rozcieńczalnika (R7). Podzielić objętości przez 10, aby otrzymać objętość potrzebną dla jednego paska. 7.3 Przechowywanie i okres przydatności otwartych i/lub rozcieńczonych odczynników Pod warunkiem przechowywania przed otwarciem w temperaturze +2-8 C, każdy składnik może zostać użyty do upływu daty przydatności umieszczonej na zewnętrznej etykiecie zestawu. R1: Po otwarciu paski pozostaną stabilne do 8 tygodni, jeśli przechowywane będą w temperaturze +2-8 C w tej samej dokładnie zamkniętej torebce (sprawdzić obecność środka osuszającego). R2: Po rozcieńczeniu roztwór do płukania może być przechowywany do 2 tygodni w temperaturze C. Po otwarciu skoncentrowany roztwór do płukania przechowywany w temperaturze C przy braku zanieczyszczeń pozostanie stabilny do upływu daty przydatności oznaczonej na etykiecie. R3, R4a, R4b, R4c, R4d, R6, R7: Po otwarciu i przy braku zanieczyszczeń odczynniki przechowywane w temperaturze +2-8 C pozostaną stabilne do 8 tygodni. R6+R7: Po rozcieńczeniu roboczy roztwór koniugatu pozostanie stabilny przez 8 godzin w temperaturze pokojowej ( C) lub przez 24 godziny w temperaturze +2-8 C. R9: Po otwarciu i przy braku zanieczyszczeń odczynnik przechowywany w temperaturze +2-8 C pozostanie stabilny do 8 tygodni. 4

5 R10: Po otwarciu i przy braku zanieczyszczeń odczynnik przechowywany w temperaturze +2-8 C pozostanie stabilny do upływu daty przydatności oznaczonej na etykiecie. 7.4 Procedura Należy bezwzględnie przestrzegać procedury oznaczenia i zasad Dobrej Praktyki Laboratoryjnej. Przed użyciem należy pozwolić odczynnikom osiągnąć temperaturę pokojową ( C). Użycie odłamywanych studzienek wymaga szczególnej uwagi podczas pracy z nimi. Podczas każdego cyklu należy użyć wszystkich kalibratorów w celu weryfikacji wyników testu. 1. Dokładnie ustalić plan wprowadzania i identyfikacji kalibratorów i próbek pacjenta. 2. Przygotować rozcieńczony roztwór do czyszczenia (R2) [patrz: punkt 7.2]. 3. Wyjąć ramkę i paski (R1) z opakowania [patrz: punkt 7.2]. 4. W oznakowanych probówkach rozcieńczyć kalibratory R3, R4a, R4b, R4c i R4d oraz próbki pacjentów (S1, S2 ) w rozcieńczalniku (R7) w stosunku 1/21: 300 µl rozcieńczalnika (R7) i 15 µl próbki [patrz: punkt 7.2]. Wymieszać rozcieńczone próbki. 5. Nanieść rozcieńczone kalibratory i próbki po 200 l do każdego dołka, ściśle wg podanego schematu: A R3 S4 S12 B R4a S5 C R4b S6 D R4c S7 E R4d S8 F S1 S9 G S2 S10 H S3 S11 6. Przykryć mikropłytkę folią adhezyjną i mocno docisnąć do płytki w celu zapewnienia szczelności. Natychmiast przystąpić do inkubacji mikropłytki w łaźni wodnej kontrolowanej termostatem lub w suchym inkubatorze przez 1 godzinę 5 minut w temperaturze 37 C 1 C. 7. Przed zakończeniem pierwszego okresu inkubacji przygotować roboczy roztwór koniugatu (R6+R7) [patrz: punkt 7.2]. 8. Po zakończeniu inkubacji zdjąć folię. Zaaspirować zawartość wszystkich studzienek do pojemnika na odpady zakaźne (zawierającego podchloryn sodu). Przemyć mikropłytkę 4 razy 350 µl roztworu do płukania (R2). Odwrócić mikropłytkę i delikatnie ostukać na papierze chłonnym w celu usunięcia pozostałej ilości płynu. 9. Natychmiast dodać 200 µl roboczego roztworu koniugatu (R6+R7) do wszystkich studzienek. Przed użyciem roztworu należy nim delikatnie wstrząsnąć. 10. Przykryć mikropłytkę folią adhezyjną i mocno docisnąć do płytki w celu zapewnienia szczelności. Natychmiast przystąpić do inkubacji mikropłytki w łaźni wodnej kontrolowanej termostatem lub w suchym inkubatorze przez 1 godzinę 5 minut w temperaturze 37 C 1 C. 11. Po zakończeniu inkubacji zdjąć folię. Zaaspirować zawartość wszystkich studzienek do pojemnika na odpady zakaźne (zawierającego podchloryn sodu). Przemyć mikropłytkę 4 razy 350 µl roztworu do czyszczenia (R2). Odwrócić mikropłytkę i delikatnie ostukać na papierze chłonnym w celu usunięcia pozostałej ilości płynu. 12. Szybko dodać 200 µl roztworu chromogenu (R9) do każdej studzienki z dala od światła. Pozwolić reakcji przebiegać w ciemności przez 30 ± 5 minut w temperaturze pokojowej ( C). W czasie tej inkubacji nie używać folii adhezyjnej. 13. Zatrzymać reakcję enzymatyczną przez dodanie 100 µl roztworu zatrzymującego reakcję (R10) do każdej studzienki. Zastosować tę samą sekwencję i szybkość wprowadzania jak w przypadku roztworu preparatu enzymatycznego. 14. Ostrożnie przetrzeć dolną stronę płytki. Odczytać gęstość optyczną przy 450/620 nm korzystając z czytnika płytki w ciągu 30 minut po zatrzymaniu reakcji. Przed dokonaniem odczytu paski muszą znajdować się ciągle z dala od światła. 15. Przed wydaniem wyników należy sprawdzić zgodność odczytu z planem dystrybucji płytki i próbek. 8 INTERPRETACJA WYNIKÓW 8.1 Wykreślanie standardowej krzywej Nie istnieje międzynarodowy standard dla oznaczeń przeciwciał anty-cmv IgG. Test Platelia CMV IgG jest standaryzowany wobec Proposed International Standard Preparation WHO Obecność i stężenie przeciwciał IgG anty-cmv w próbce są ustalane przez porównanie gęstości optycznej (OD) próbki ze stężeniem w jednostkach arbitralnych na mililitr (AU/ml) kalibratorów standardowej krzywej. Standardową krzywą (gęstość optyczna = funkcja (AU/ml)] należy wykreślić zaznaczając odczyty OD kalibratorów R3, R4a, R4b, R4c i R4d w osi pionowej (OY), i podając stężenie w AU/ml w osi poziomej (OX). Dla każdej badanej próbki należy obliczyć stężenie przeciwciał anty-cmv IgG poprzez odczyt wartości z osi OX dla uzyskanego odczytu OD. 5

6 8.2 Kontrola jakości Dla każdej mikropłytki i każdego cyklu należy uwzględnić wszystkie kalibratory i przeanalizować uzyskane wyniki. W celu weryfikacji testu należy spełnić następujące kryteria: Wartości gęstości optycznej: OD R4a 0,150 OD R4b 0,300 OD R4d > OD R4c Stosunki gęstości optycznej: OD R4a / OD R3 3,50 OD R4b / OD R4a 1,50 OD R4c / OD R4b 1,50 Jeśli te kryteria kontroli jakości nie zostaną spełnione, należy powtórzyć test. 8.3 Interpretacja wyników Stężenie przeciwciał anty-cmv (Jednostki arbitralne/ml) Wynik Interpretacja Stężenie < 0,25 UA/ml Ujemny 0,25 UA/ml Stężenie < 0,5 UA/ml Niejednoznaczny Negatywny lub niejednoznaczny wynik wskazuje na brak nabytej odporności, ale nie może wykluczyć niedawnej infekcji. Jeśli podejrzewana jest niedawna infekcja, należy zbadać drugą próbkę około dwóch tygodni później. Stężenie 0,5 UA/ml Dodatni Pozytywny wynik zazwyczaj wskazuje na infekcję w przeszłości. Jednak nie można wykluczyć niedawnej infekcji, zwłaszcza, jeśli obecne są przeciwciała anty-cmv IgM. Jeśli podejrzewana jest niedawna infekcja, przydatne w potwierdzeniu diagnozy może być przeprowadzenie innych testów serologicznych, takich jak pomiar awidności przeciwciał IgG. Większą różnorodność stężeń można zaobserwować powyżej wartości 4 AU/ml. Próbki o stężeniach większych od wyższego kalibratora standardowej krzywej mogą być rozcieńczone w rozcieńczalniku R7 w celu uzyskania wyniku w zakresie linearności testu. W takim wypadku, końcowe stężenie uzyskuje się mnożąc wynik pomiaru przez stosunek rozcieńczania. 8.4 Rozwiązywanie problemów Wyniki nie spełniające kryteriów walidacji i niepowtarzalne reakcje są często powodowane przez: Niedokładne przemycie mikropłytek. Zanieczyszczenie negatywnych próbek surowicą lub osoczem o wysokim stężeniu przeciwciał. Zanieczyszczenie roztworu preparatu enzymatycznego chemicznymi odczynnikami utleniającymi (wybielacz, jony metalu...). Zanieczyszczenie roztworu zatrzymującego reakcję. 9 CHARAKTERYSTYKA TESTU Charakterystyka testu Platelia CMV IgG została oceniona w 2 ośrodkach przy użyciu w sumie 1096 próbek od kobiet w ciąży i dawców krwi. 9.1 Prewalencja Występowanie przeciwciał anty-cmv IgG zostało oznaczone przy pomocy produktu Platelia CMV IgG na panelu 300 próbek od kobiet w ciąży pochodzących z obszaru Paryża (Francja). 145 próbek dało pozytywny wynik na obecność przeciwciał anty-cmv IgG. Prewalencja oznaczona przy pomocy testu Platelia CMV IgG została określona na 48,3% (145/300). 6

7 9.2 Swoistość Względna swoistość została określona na panelu 490 próbek z dwóch ośrodków znajdujących się we Francji o następującym podziale: 61 próbek surowicy od dawców krwi 429 próbek surowicy od kobiet w ciąży Wyniki zostały porównane z tymi uzyskanymi przy pomocy innego komercyjnie dostępnego testu EIA uznanego za źródło odniesienia. Badana populacja / ośrodek Ośrodek 1 Ośrodek 2 Kobiety w ciąży Dawcy krwi Kobiety w ciąży Liczba próbek surowicy Ujemny Niejednoznaczny Dodatni Swoistość Suma [IC 95%] = 95% przedział ufności. 100,0% (81/81) [96,3%- 100,0%] 100,0% (61/61) [95,2%- 100,0%] 100.0% (348/348) [99,1%- 100,0%] 100,0% (490/490) [99,4%- 100,0%] 9.3 Czułość Względna czułość została określona na panelu 606 próbek z dwóch ośrodków znajdujących się we Francji o następującym podziale: 136 próbek surowicy od dawców krwi 470 próbek surowicy od kobiet w ciąży Wyniki zostały porównane z tymi uzyskanymi przy pomocy innego komercyjnie dostępnego testu EIA uznanego za źródło odniesienia. Badana populacja / ośrodek Ośrodek 1 Ośrodek 2 Kobiety w ciąży Dawcy krwi Kobiety w ciąży Liczba próbek surowicy Ujemny Niejednoznaczny * Dodatni Czułość Suma * Wyniki niejednoznaczne zostały uznane za negatywne przy obliczaniu czułości. [IC 95%] = 95% przedział ufności. 98,4% (121/123) [94,2%-99,8%] 97,1% (132/136) [92,6%-99,2%] 98,8% (343/347) [97,1%-99,7%] 98,4% (596/606) [97,0%-99,2%] 9.4 Reaktywność krzyżowa Panel 103 próbek zawierający 77 próbek o wyniku pozytywnym dla toksoplazmozy, różyczki, EBV, HSV, VZV, świnki, odry i HIV oraz 26 próbek o wyniku pozytywnym dla czynnika reumatoidalnego, autoprzeciwciał i przeciwciał heterofilnych został przebadany z użyciem testu Platelia CMV IgG oraz innego komercyjnie dostępnego testu EIA w celu zbadania obecności przeciwciał anty-cmv IgG. Wśród tych próbek 37 uzyskało wynik negatywny i zgodny z zestawem EIA użytym dla porównania, potwierdzając brak potencjalnych reakcji krzyżowych. 7

8 9.5 Precyzja Powtarzalność wewnątrz-testowa (powtarzalność): W celu oceny powtarzalności w ramach jednego testu przetestowano jedną próbkę o wyniku negatywnym i trzy próbki o wyniku pozytywnym 30 razy w ciągu tego samego cyklu. Dla każdej próbki o wyniku pozytywnym określone zostało stężenie (AU/ml). Wyniki dla próbki o wyniku negatywnym zostały wyrażone w postaci indeksu. Poniższa tabela zawiera średnie stężenie i stosunek, standardowe odchylenie (SD) oraz współczynnik zmienności (%CV) każdej z czterech próbek: Powtarzalność N=30 Próbka ujemna Próbka słabo Próbka Próbka wysoko Indeks (OD pr. / OD R4a) Stężenie (AU/ml) Średnia 0,11 1,87 3,53 4,78 SD 0,01 0,10 0,18 0,30 %CV 6,6% 5,1% 5,1% 6,3% Powtarzalność między-testowa (odtwarzalność): W celu oceny powtarzalności pomiędzy testami przetestowano cztery próbki (jedną próbkę o wyniku negatywnym i trzy próbki o wyniku pozytywnym) 20 razy w dwóch cyklach dziennie przez okres 20 dni. Dla każdej próbki o wyniku pozytywnym określone zostało stężenie (AU/ml). Wyniki dla próbki o wyniku negatywnym zostały wyrażone w postaci indeksu. Poniższa tabela zawiera średnie stężenie i stosunek, standardowe odchylenie (SD) oraz współczynnik zmienności (%CV) każdej z czterech próbek: Odtwarzalność N=80 Próbka ujemna Próbka słabo Próbka Próbka wysoko Indeks (OD pr. / OD R4a) Stężenie (AU/ml) Średnia 0,10 1,44 3,10 4,22 SD 0,02 0,19 0,40 0,76 %CV 16,0% 13,4% 13,0% 18,0% 9.6 Liniowość Zakres liniowości testu Platelia CMV IgG został zdefiniowany na 0-4 AU/ml po przeprowadzeniu badań na 5 rozcieńczonych próbkach o wynikach pozytywnych. 10 OGRANICZENIA PROCEDURY Diagnostyka zakażenia CMV może być prowadzona wyłącznie na podstawie jednoczesnej analizy danych klinicznych i biologicznych. Wynik pojedynczego oznaczenia miana przeciwciał anty-cmv IgG nie stanowi dostatecznego dowodu, aby postawić rozpoznanie niedawnego zakażenia cytomegalowirusem. 11 KONTROLA JAKOŚCI PRODUCENTA Wszystkie produkowane i wprowadzane do sprzedaży odczynniki są przygotowywane zgodnie z naszym systemem jakości, poczynając od materiałów wyjściowych, aż do ostatecznego produktu komercyjnego. Odczynniki każdej serii podlegają oznaczeniu kontrolnemu, i są dopuszczane do użytkowania, jeśli spełniają wymagane kryteria. Odpowiednie protokoły produkcji i kontroli jakości każdej serii są przechowywane w firmie. 12 LITERATURA 1. Alford C.A., Stagno S., Pass R.F., Britt W.J Congenital and perinatal cytomegalovirus infection. Rev. Infect. Dis. 12: S745-S Demmler G.J Summary of a workshop on surveillance for congenital cytomegalovirus disease. Rev. Infect. Dis. 13: Fowler K.B., Stagno S., Pass R.F., Britt W.J., Boll T.J., Alford C.A The outcome of congenital and cytomegalovirus in relation to maternal antibody status. N. Engl. J. Med. 326: Gaytant M.A., Rours I.G., Steegers E.A., Galama J.M., Semmekrot B.A Congenital cytomegalovirus infection after recurrent infection: case reports and review of the literature. Europ. J. Pediatr. 162:

9 5. Grangeot-Keros L., Mayaux M.J., Lebon P., and al Value of cytomegalovirus (CMV) IgG avidity index for the diagnosis of primary CMV infection in pregnant women. J. Infect. Dis. 175: Lazzarotto T., Guerra B., Spezzacatena P., Varani S., Gabrielli L., Pradelli P., Rumpianesi F., Banzi C., Bovicelli L., Landini M.P Prenatal diagnosis of congenital cytomegalovirus infection. J. Clin. Microbiol. 36: Macé M., Sissoef L., Rudent A., Grangeot-Keros L A serological testing algorithm for the diagnosis of primary CMV infection in pregnant women. Prenat. Diagn. 28: Munro S.C., Hall B., Whybin L.R., Leader L., Robertson P., Maine G.T., Rawlinson W.D Diagnosis of and screening for cytomegalovirus infection in pregnant women. J. Clin. Microbiol. 43: Revello M.L., Gerna G Diagnosis and management of human cytomegalovirus infection in the mother, fetus and newborn infant. Clin. Microbiol. Rev. 15: Stagno S., Pass R.F., Dworsky M.E., and al Congenital cytomegalovirus infection: the relative importance of primary and recurrent maternal infections. N. Engl. J. Med. 306:

10 10

11 Bio-Rad 3, boulevard Raymond Poincare Marnes-la-Coquette - France Tel. : +33 (0) /11 Fax : +33 (0)