PL B1. PROLAB Spółka z o.o.,kraków,pl BUP 12/02. Piotr Heczko,Kraków,PL Magdalena Strus,Kraków,PL

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) OPIS PATENTOY (19) PL (11) (13) B1 (21) Numer zgłoszenia: (51) Int.Cl. C12N 1/20 ( ) C12R 1/225 ( ) Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (22) Data zgłoszenia: (54) Nowy szczep bakterii Lactobacillus rhamnosus (43) Zgłoszenie ogłoszono: BUP 12/02 (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: UP 08/08 (73) Uprawniony z patentu: PROLAB Spółka z o.o.,kraków,pl (72) Twórca(y) wynalazku: Piotr Heczko,Kraków,PL Magdalena Strus,Kraków,PL (74) Pełnomocnik: Alina Magońska (57) 1. Nowy szczep bakterii Lactobacillus rhamnosus oznaczony jako Lactobacillus rhamnosus PL1 i zdeponowany pod numerem PCM Nowy szczep bakterii Lactobacillus rhamnosus PL1 PCM 2572 według zastrz. 1, znamienny tym, że ma zdolność do wytwarzania substancji pozakomórkowej, w skład której wchodzi glukoza w ilości 42,4% i galaktoza w ilości 57,6%. PL B1

2 2 PL B1 Opis wynalazku Przedmiotem wynalazku jest nowy szczep bakterii Lactobacillus rhamnosus. Znany jest z europejskiego opisu patentowego EP szczep z gatunku Lactobacillus rhamnosus zwany szczepem GG, zdeponowany w ATCC pod numerem Szczep ten wykazuje się dobrym przyleganiem do śluzu w jelicie cienkim i można go stosować w połączeniu z nośnikiem do produktów żywnościowych. Znany jest też z polskiego opisu patentowego nr nowy szczep bakterii kwasu mlekowego wybrany z grupy składającej się ze szczepów Bifidobacterium breve, Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium longum oraz kompozycja zawierająca co najmniej jeden szczep wybrany z tej grupy i jadalny nośnik. Bakterie kwasu mlekowego izolowane ze środowiska zewnętrznego człowieka jak i jego naturalnej mikroflory dobrze znoszą kwaśne środowisko ponieważ same bytując w kwaśnym środowisku kwasu mlekowego wytworzyły pewne mechanizmy przystosowawcze. Jednakże enzymy trawienne, sole żółci, a ponadto brak adhezyn umożliwiających im aktywne przywieranie do powierzchni śluzowki ludzkiego przewodu pokarmowego, eliminują wraz z treścią jelitową większość bakterii z rodzaju Lactobacillus. Tylko szczepy posiadające właściwości probiotyczne są w stanie przejść przez naturalne bariery przewodu pokarmowego jak i trwale kolonizować śluzowkę jelita. Dlatego też pożądana jest trwała obecność wybranych bakterii kwasu mlekowego w mikroflorze ludzkiego organizmu. Bakterie z rodzaju Lactobacillus wykorzystywane są do celów medycznych, gdyż odbudowują a następnie utrzymują prawidłowy skład mikroflory człowieka po zadziałaniu na niego niekorzystnych wewnętrznych i zewnętrznych czynników. Bakterie kwasu mlekowego posiadają zdolność do produkowania aktywnych substancji działających antagonistycznie na większość bakterii chorobotwórczych. Celem wynalazku było wyselekcjonowanie ze szczepów bakterii kwasu mlekowego szczepu bakterii o probiotycznych ściśle zdefiniowanych właściwościach. Istotą wynalazku jest nowy szczep bakterii, który określono jako Lactobacillus rhamnosus PL1 i zdeponowano w Instytucie Immunologii i Terapii Doświadczalnej we rocławiu pod numerem PCM Nowy szczep bakterii Lactobacillus rhamnosus PL1 PCM 2572 ma zdolność do wytwarzania substancji pozakomórkowej w skład której wchodzi glukoza w ilości 42,4% i galaktoza w ilości 57,6%. Próbki bakterii pobrano z kału zdrowych noworodków karmionych mlekiem matki. Materiał pobrano na podłoże transportowe i w ciągu 24 godzin wysiewano po wieloboku na stałe standardowe podłoże wzrostowe MRS. Posiane płytki MRS inkubowano przez godz. w temperaturze 37 C w warunkach ściśle beztlenowych. Następnie wybrano szczepy bakterii kwasu mlekowego i z nich wyselekcjonowano szczepy o własnościach probiotycznych. Bakterie według wynalazku wyrastają na podłożu w postaci białych, szarych, a czasami kremowych kolonii z połyskiem. Poniżej przedstawiono charakterystykę szczepu oznaczonego PL1. Cechy biochemiczne (oznaczone za pomocą testu API 50 CHL) Glicerol - Erytritol - D-Arabinoza - L-Arabinoza - Ryboza + D-Ksyloza - L-Ksyloza - Adonitol - Beta-metyloksylozyd - Galaktoza + D-Glukoza + D-Fruktoza + D-Mannoza + L-Sorboza + Ramnoza + Dulcytol - Inozytol - Mannitol + Sorbitol + Alfa-metylo-D-mannozyd -

3 PL B1 3 Alfa-metylo-D-glukozyd + N-acetyloglukozamina + Amigdalina + Arbutyna + Eskulina + Salicyna + Celobioza + Maltoza + Laktoza + Melibioza - Sacharoza - Trehaloza - Inulina - Melecytoza + D-Rafinoza - Amidon - Glikogen - Ksylitol - Beta-gentobioza - D-Turanoza + D-Liksoza - D-Tagatoza + D-Fukoza - L-Fukoza - D-Arabitol - L-Arabitol - Glukonian - 2-Ceto-glukonian - 5-Ceto-glukonian - Na podstawie cech biochemicznych oznaczonych za pomocą zestawu API 50CHL szczep PL1 należy do gatunku Lactobacillus rhamnosus. Poniżej przedstawiono właściwości nowego szczepu Lactobacillus rhamnosus PL1. Określanie właściwości powierzchniowych szczepu Lactobacillus rhamnosus PL1. Test hemaglutynacji. ykonywano je w jednorazowych płytkach mikrotitracyjnych (Sarstaed). Zawiesiny bakterii szczepu Lactobacillus rhamnosus PL1 doprowadzano za pomocą buforowanej soli fizjologicznej (PBS) do gęstości 1x10 9 j.t.k./ml, a następnie 25 µl tej zawiesiny mieszano z 25 µl 1% roztworu czerwonych krwinek ludzkich należących do grup: A1 i 0 z receptorami P. niektórych doświadczeniach wykorzystano również taninowane i nie taninowane 3% krwinki świnki morskiej. Krwinki wraz z badanymi bakteriami inkubowano przez 2 godziny w temperaturze 4 C. Hemaglutynacja była obserwowana makroskopowo, a jej nasilenie oceniano za pomocą skali półilościowej (- do +++) (Beuth i wsp., 1988). yniki przestawiono w tabeli 1. Badania hydrofobowości powierzchni. celu określenia hydrofobowych właściwości powierzchni szczepu Lactobacillus rhamnosus PL1 posłużono się dwoma odczynami: pierwszym z nich był test agregacji w soli (SAT = salt-aggregation test) według Jonssona i wsp. (1984), zaś drugim - odczyn bakteryjnej interakcji z ksylenem według Rosenberga (1980). Test agregacji w soli (SAT). Test agregacji w soli (SAT) - wykonano w następujący sposób: 18 godziną, płynną hodowlę badanego szczepu Lactobacillus rhamnosus PL1 przemywano 0,02 mol/l buforem fosforanowym o ph 6,8, a otrzymaną zawiesinę ponownie rozcieńczono tym samym buforem do gęstości 5x10 9 j.t.k./ml. Na szkiełkach podstawowych mieszano następnie powyższą zawiesinę bakterii ze wzrastającymi stężeniami siarczanu amonu (0,02, 0,05, 0,5, 1,0, 2,0, 4,0 mol/l). Końcowe, najniższe stężenie siarczanu anionu powodujące agregację Lactobacillus rhamnosus podawano jako wartość SAT. Uważa się, że szczepy wykazujące wartość SAT < 0,9 mol/i posiadają najwyższą hydrofobowość, podczas gdy szczepy o wartości SAT > 1,5 mol/l najniższą. yniki przedstawiono w tabeli 1.

4 4 PL B1 Test bakteryjnego powinowactwa do ksylenu. Test powinowactwa szczepów z rodzaju Lactobacillus rhamnosus do ksylenu wykonano według metody Rosenberga (1980). tym celu 18-godzinną, płynną hodowlę Lactobacillus rhamnosus PL1 odwirowywano (1500 obrotów na minutę przez 15 minut), a następnie przemywano dwukrotnie w PBS. Tak przygotowane komórki bakteryjne zawieszano w 1,2 ml buforu o następującym składzie: 22,2 g K 2 HPO 4 x 3 H 2 O, 7,26 g K 2 HPO 4, 1,8 g mocznika, 0,2 g MgSO 4 w 1000 ml H 2 O, o ph 7.1. Zawiesinie tej mierzono absorbancję za pomocą densytometru przy długości fali 540 nm. Następnie dodawano 0,2 ml ksylenu i tak otrzymaną mieszaninę energicznie wytrząsano przez 30 sekund i odstawiano. Po upływie 30 min, gdy mieszanina ponownie rozdzielała się na dwie fazy dokonywano końcowego pomiaru absorpcji fazy wodnej za pomocą densytometru przy tej samej długości fali. Uzyskane wyniki dla każdego porównano wykazując różnice w absorbancji przed i po dodaniu ksylenu. Spadek absorpcji fazy wodnej był miarą hydrofobowości powierzchni bakterii. yniki przedstawiono w tabeli 1. Oporność bakterii szczepu Lactobacillus rhamnosus PL1 na ph soku żołądkowego. Aby oznaczyć stopień oporności szczepu Lactobacillus rhamnosus PL1 na ph soku żołądkowego posłużono się metodą Clarka (1993), którą zmodyfikowano w ten sposób, że zamiast stężonego kwasu solnego zastosowano sztuczny sok żołądkowy o stałym ph wynoszącym 2,5 według następującego przepisu: 2,0 g NaCl, 3,2 g pepsyny w 7 ml 36% HCl o ph 1,2 rozpuszczono w 1000 ml wody destylowanej. Tak przygotowany, jałowy, sztuczny sok żołądkowy rozlewano po 10 ml do jałowych probówek, a następnie do każdej kolejno dolewano po 100 µl wcześniej wyhodowanego szczepów Lactobacillus rhamnosus PL1 o znanej gęstości. Mieszaninę inkubowano przez 20 minut w 37 C w warunkach ściśle beztlenowych i kolejno rozcieńczano w soli fizjologicznej w celu określenia otrzymanej gęstości końcowej. Spadek gęstości badanego szczepu po inkubacji z sztucznym sokiem żołądkowym był miarą wrażliwości na niskie ph soku żołądkowego i trawienie przez pepsynę. Oporność szczepu Lactobacillus rhamnosus PL1 na sole żółci. celu oznaczenia oporności szczepu Lactobacillus rhamnosus PL1 na sole żółci posłużono się metodą Dashkevicz i Feighner (1989), która polegała na tym, że do agaru MRS dodawano wskaźnika - purpury bromokrezolowej w ilości 0,17 g/l oraz soli żółci - OXGAL firmy Difco, w pięciu kolejnych stężeniach tj: 1 g/l, 2 g/l, 5 g/l, 10 g/l i 20 g/l. Na tak przygotowane, stałe podłoże MRS posiewano hodowlę szczepu Lactobacillus rhamnosus PL1, które następnie inkubowano w standardowych warunkach przez 24 godziny. Po zakończonej inkubacji kolonie Lactobacillus rhamnosus oporne na dane stężenie soli nabierały koloru jasno żółtego. Na podstawie otrzymanych wyników można stwierdzić, że badany szczep Lactobacillus rhamnosus PL1 wykazał dużą oporność zarówno na sole żółci, jak i na niskie ph sztucznego soku żołądkowego, co może świadczyć o jego doskonałym przystosowaniu się do niesprzyjających warunków panujących w ludzkim przewodzie pokarmowym. łaściwości powierzchniowe szczepu Lactobacillus rhamnosus PL1 zostały zebrane w poniższej tabeli. T a b e l a 1 łaściwość ynik Hemaglutynacja krwinek ludzkich Al - Hemaglutynacja krwinek ludzkich O/P ++ Hemaglutynacja krwinek świnki morskiej 3% - Hemaglutynacja krwinek świnki morskiej 3% taninowanych ++ Agregacja w soli Autoaglutynacja Test z ksylenem - Produkcja śluzu +++ Adherencja do linii CaCo2 +++ Mikroskopia elektronowa Obecność dużej ilości substancji pozakomórkowej trakcie wykonywania testów i badań szczepu Lactobacillus rhamnosus PL1 nieoczekiwanie zaobserwowano i stwierdzono obecność substancji pozakomórkowej o charakterze śluzu. Do wyznaczenia jakościowej produkcji śluzu posłużono się metodą Christensena i współpracowników. tym

5 PL B1 5 celu szczep Lactobacillus rhamnosus PL1 hodowano w szklanych probówkach zawierających 10 ml płynnego podłoża MRS przez 18 godzin w warunkach ściśle beztlenowych. Po zakończonej inkubacji, jałową pipetą, bez dotknięcia ścian probówki, odciągano MRS, a następnie, po ściankach probówki, wlewano pipetą 1 ml - 0,1% roztworu safraniny. Przez 60 sekund delikatnie obracano probówką, a następnie odwracano ją do góry dnem, pozostawiając ją przez kilka minut w temperaturze pokojowej. Na ściankach probówki uwidaczniał się, lub też nie, różowy biofilm w zależności od zdolności badanego szczepu do tworzenia śluzu, którego natężenie oceniano w skali od 0 do ynik przedstawiono w tabeli 1. Badanie z wykorzystaniem mikroskopu elektronowego przeprowadzono dla szczepu Lactobacillus rhamnosus PL1, gdyż szczególnie wyróżniał się on swoją aktywnością powierzchniową, wykrytą w poprzednich testach. tym celu szczep Lactobacillus rhamnosus PL1 hodowano na stałym podłożu MRS, a następnie sporządzono z niego zawiesinę o gęstości 2,0 według skali McFarlanda w 1% kwasie fosforowolframowym. Tak przygotowane bakterie nakładano po 1 kropli na wcześniej opłaszczone, miedziane siatki pokryte aktywowanym węglem. Po dokładnym wysuszeniu siatki z przyklejonymi na nich bakteriami oglądano w mikroskopie elektronowym przy 80kV (Mc Groarty, 1994). Badanie mikroskopowe wykazało obecność dużej ilości substancji pozakomórkowej. Substancja pozakomórkowa została poddana analizie chemicznej i wykazano, że odmiennie od wszystkich innych badanych szczepów Lactobacillus, wyizolowanych również ze źródeł ludzkich, szczep Lactobacillus rhamnosus PL1 produkuje na standardowym podłożu MRS substancję pozakomórkową o składzie: glukoza 42,4% i galaktoza 57,6%. Poniżej przedstawiono przykłady ilustrujące wynalazek. P r z y k ł a d I Badanie siły przylegania (adherencji) do komórek ustroju ludzkiego. celu oznaczenia siły przylegania bakterii szczepu Lactobacillus rhamnosus PL1 do komórek ustroju ludzkiego posłużono się ludzką linią komórkową CaCo2 pochodzenia jelitowego. Hodowlę prowadzono przez wielokrotne pasaże, przy zastosowaniu podłoża RPMI z dodatkiem 10% płodowej surowicy cielęcej. Ponadto, podłoże to zawierało 3 mm/ml L-glutaminy oraz antybiotyki: 100 µg/ml -1 streptomycyny i 100 U/ml -1 penicyliny. Hodowle prowadzono w temperaturze 37 C w atmosferze o zwiększonej wilgotności zawierającej 10% CO 2, zmieniając podłoże odżywcze 2 razy w tygodniu. celu przeprowadzenia testu adherencji wysiewano komórki linii tkankowych o gęstości 10 4 /ml do 6- cio- dołkowych plastikowych płytek (Corning). Używano 14-dniowej hodowli komórkowej tworzącej jednolitą warstwę (monolayer). Tak wyrośnięte komórki przemywano dwukrotnie PBS. Badane bakterie szczepu Lactobacillus rhamnosus PL1 inkubowano w standardowych warunkach przez 18 godzin, po czym hodowlę płukano dwukrotnie roztworem fizjologicznym NaCl. Do testu adherencji bakterie doprowadzano do gęstości 10 9 /ml, a następnie bakterie zawieszone w podłożu: bulion MRS i MEM lub RPMI w stosunku 1 : 1 dodawano do dołków zawierających komórki CaCo2. Komórki linii tkankowych wraz z badanym szczepem inkubowano w temperaturze 37 C, w atmosferze wzbogaconej 10% CO 2 przez 30 minut. Po inkubacji komórki przemywano dwukrotnie PBS w celu usunięcia nie przyczepionych bakterii, a następnie utrwalano 3,7% formaldehydem w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Po utrwaleniu komórki ponownie przemywano PBS i barwiono fioletem krystalicznym przez 3 minuty. Preparat oceniano mikroskopowo przy powiększeniu 1000 x. każdym preparacie oglądano 20 pól widzenia. Adherencję określano półilościowo, według skali: - brak przylegania, + pojedyncze komórki bakterii w całym preparacie, ++ pojedyncze komórki bakterii w poszczególnych polach widzenia, liczne w preparacie, +++ liczne komórki bakterii w poszczególnych polach widzenia. yniki przedstawiono w tabeli 1. P r z y k ł a d II Określenie właściwości antagonistycznych szczepu Lactobacillus rhamnosus PL1 Zastosowano metodę badania według (Struś et al. 1998). Szczep Lactobacillus rhamnosus PL1 hodowano w temperaturze 37 C, w warunkach beztlenowych na płytkach z podłożem stałym MRS (OXOID) o objętości 40 ml. Po upływie 18 godzin inkubacji, w płytkach agarowych wycinano korkoborem okrągłe słupki o średnicy 9 mm, które po 3 nakładano na płytki z wcześniej naniesionymi, za pomocą wymazu, bakteriami wskaźnikowymi, po czym umieszczano je na 4 godziny w lodówce w temperaturze 4 C (za wyjątkiem bakterii beztlenowych). Grupę drobnoustrojów wskaźnikowych stanowiły tlenowe i beztlenowe czynniki patogenne ludzkiego przewodu pokarmowego. Do tlenowych bakterii wskaźnikowych, zaliczono Gram-ujemne pałeczki:

6 6 PL B1 Salmonella enteritidis, Shigella sonnei i enteropatogenny szczep Escherichia coli, wywołujące ostre biegunki i inne dolegliwości ze strony przewodu pokarmowego. Ponadto do tlenowych bakterii wskaźnikowych zaliczono również Gram-dodatnie ziarenkowce: Staphylococcus aureus i Enterococcus faecalis, pochodzące z materiału ludzkiego. Beztlenową grupę bakterii wskaźnikowych stanowiły: Campylobacter jejuni, Campylobacter coli, Helicobacter pylori i Clostridium difficile, pochodzące z materiałów klinicznych. Tlenowe bakterie wskaźnikowe hodowano w optymalnych warunkach to znaczy na bulionowym podłożu Mueller- -Hintona (MH) (Difco) przez 24 godziny, w temperaturze 37 C. Po inkubacji, 1 oczko ezy przenoszono do 5 ml czystego bulionu MH i ponownie inkubowano przez 4-8 godzin w temperaturze 37 C w łaźni wodnej. Stężenie wskaźnikowych bakterii tlenowych doprowadzano do gęstości 0,5 według skali Mc Farland'a, rozcieńczając hodowlę solą fizjologiczną. Następnie 0,1 ml takiego inokulum przenoszono na podłoże stałe MH i rozprowadzano je po powierzchni płytki wacikiem. Beztlenowe bakterie wskaźnikowe hodowano na odpowiednich podłożach wzrostowych. Dla Helicobacter i Campylobacter był to agar Brucella (Difco) z dodatkiem krwi ludzkiej (lub końskiej), heminy oraz witaminy K1, a dla Clostridium difficile - Columbia Agar z dodatkiem 5% krwi baraniej firmy bio-merieux. Inkubowano je w warunkach beztlenowych (Clostridium difficile) lub mikroaerofilnych (Helicobacter i Campylobacter) stosując odpowiednie generatory atmosfery firmy bio-merieux przez godziny, a następnie bakterie zawieszano w soli fizjologicznej, starając się doprowadzić gęstość zawiesiny do 3,0 w skali Mc Farland'a. Objętość 0,1 ml tej zawiesiny rozprowadzano na powierzchni płytek z odpowiednimi, powyżej opisanymi agarowymi podłożami wzrostowymi. Dalszą inkubację przeprowadzano w temperaturze 37 C przez godziny w warunkach tlenowych, mikroaerofilnych, lub też beztlenowych w zależności od wymagań bakterii wskaźnikowych. Po inkubacji wokół słupka powstawała strefa zahamowania wzrostu bakterii wskaźnikowych, której średnicę w mm przyjmowano, jako miarę stopnia antagonizmu. yniki badań właściwości antagonistycznych szczepu Lactobacillus rhamnosus PL1 zostały podane w tabeli 2. T a b e l a 2 Szczep wskaźnikowy Średnica strefy zahamowania wzrostu (w mm) Salmonella enteritidis 26 Shigella sonnei 28 Escherichia coli, szczep enteropatogenny 19 Staphylococcus aureus 17 Enterococcus faecalis 12 Campylobacter coli 22 Campylobacter j ej uni 21 Helicobacter pylori 22 Clostridium difficile 21 Szczep Lactobacillus rhamnosus PL1 wykazuje wybitną aktywność hamującą wzrost podstawowych tlenowych czynników etiologicznych zakażeń przewodu pokarmowego: Salmonella, Shigella i Escherichia coli. Ponadto jest aktywny wobec bakterii beztlenowych powodujących przewlekłe stany zapalne żołądka i jelit. Tak jak większość szczepów Lactobacillus stosunkowo słabo działa na ziarenkowce Gram-dodatnie, szczególnie (Enterococcus faecalis) stanowiące normalną florę przewodu pokarmowego. P r z y k ł a d III Oporność na antybiotyki: Ampicylina Klindamycyna Ko-trymoksazol Chloramfenikol Doksycyklina Cefaklor S Cyprofloksacyna

7 PL B1 7 Imipenem Penicylina Erytromycyna Gentamycyna Metycylina ankomycyna O Metronizadol Oporność na ankomycynę jest cechą gatunkową związaną z budową peptydoglikanu, nie przenoszoną przez plazmidy. P r z y k ł a d IV Analiza cukrów w substancji pozakomórkowej. celu zbadania unikalnych właściwości powierzchniowych szczepu Lactobacillus rhamnosus PL1 przeprowadzono analizę cukrów w substancji pozakomórkowej. Preparaty wielocukrów otoczkowych były hydrolizowane za pomocą 10M HCl przez 30 minut w 80 C. Uzyskane monocukry zamieniano w octan alditolu i analizowano za pomocą chromatografii - spektrometrii masowej (GLC-MS) przy użyciu analizatora firmy Hewlett-Packard model 5971A wyposażonego w kolumnę HP-1 (0,2mm x 12mm) i programu temperaturowego od 150 C do 270 C. celu analizy produktów metylacji preparaty wielocukrów metylowano stosując metodę Hamakori, natomiast produkty ekstrahowano za pomocą chloroformu. Metylowane wielocukry hydrolizowano i zamieniono na częściowo metylowane octany additolu, następnie analizowano za pomocą chromatografii - spektrometrii masowej (GLC-MS) w tych samych warunkach co poprzednio. Szczep Lactobacillus rhamnosus PL1 posiada słabe właściwości hemaglutynacyjne, co może świadczyć o jego nikłej chorobotwórczości dla człowieka. Natomiast wykazuje wybitną hydrofobowość powierzchni, związaną z obecnością substancji pozakomórkowej o charakterze śluzu (slime) lub nawet otoczki, umożliwiającą mu przyleganie do komórek jelita ludzkiego, jak wynika z testu in vitro wobec linii CaCo2. Zastrzeżenia patentowe 1. Nowy szczep bakterii Lactobacillus rhamnosus oznaczony jako Lactobacillus rhamnosus PL1 i zdeponowany pod numerem PCM Nowy szczep bakterii Lactobacillus rhamnosus PL1 PCM 2572 według zastrz. 1, znamienny tym, że ma zdolność do wytwarzania substancji pozakomórkowej, w skład której wchodzi glukoza w ilości 42,4% i galaktoza w ilości 57,6%.

8 8 PL B1 Departament ydawnictw UP RP Nakład 50 egz. Cena 2,00 zł.