PL B1. ZACHODNIOPOMORSKI UNIWERSYTET TECHNOLOGICZNY W SZCZECINIE, Szczecin, PL BUP 08/12. EDYTA BALEJKO, Mierzyn, PL

Transkrypt

1 PL B1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) (13) B1 Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (21) Numer zgłoszenia: (22) Data zgłoszenia: (51) Int.Cl. C12N 1/20 ( ) C12R 1/225 ( ) A61P 1/02 ( ) A61K 9/50 ( ) A61K 8/99 ( ) (54) Zastosowanie metabolitów bakterii probiotycznej Lactobacillus rhamnosus GG (L.GG) zamkniętej w mikrokapsułkach hydrożelowych do zapobiegania chorobom przyzębia (43) Zgłoszenie ogłoszono: BUP 08/12 (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: WUP 07/14 (73) Uprawniony z patentu: ZACHODNIOPOMORSKI UNIWERSYTET TECHNOLOGICZNY W SZCZECINIE, Szczecin, PL (72) Twórca(y) wynalazku: EDYTA BALEJKO, Mierzyn, PL (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Renata Zawadzka

2 2 PL B1 Opis wynalazku Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie metabolitów bakterii probiotycznej Lactobacillus rhamnosus GG (L.GG) zamkniętej w mikrokapsułkach hydrożelowych do zapobiegania chorobom przyzębia, poprzez hamowanie wzrostu bakterii powodujących te choroby. Środowisko jamy ustnej jest mikrobiologicznie zróżnicowane. Stwarza doskonałe warunki dla rozwoju bakterii tlenowych oraz beztlenowych, będących komponentami płytki bakteryjnej, która jest podstawowym czynnikiem etiologicznym w próchnicy i chorobach przyzębia. W leczeniu chorób przyzębia, nierozwiązanym problemem jest przewlekłe zapalenie wywołane rozwojem flory beztlenowej. W trakcie trwania schorzenia często dochodzi do poważnych uszkodzeń tkanek, wysięków, obrzęku, krwawienia dziąseł lub utraty zębów. Czynniki przeciwbakteryjne znajdujące się w ślinie nie dają znaczącej ochrony przed drobnoustrojami wywołującymi choroby przyzębia, ponieważ bakterie umiejscawiają się w podlegającej mineralizacji matrycy płytki i trudno dostępnych kieszonkach dziąsłowych. Eliminacja płytki bakteryjnej, może spowodować usunięcie przyczyny powstałych stanów zapalnych. Jak dotąd nie ma uniwersalnej metody leczenia choroby przyzębia, która zapewniłaby wysoką skuteczność. W etiopatologii chorób przyzębia stwierdzono istotną rolę bakterii Porphyromonas gingivalis, Actinobacillus actinomycetemcomitans, Actinomyces odontolyticus, Actinomyces naeslundii, Actinomyces israelii, Neisseria, Haemophilus influenzae. Największe znaczenie w patogenezie chorób przyzębia mają trzy szczepy: Porphyromonas gingivalis, Prevotella intermedia i Actinobacillus actinomycetemcomitans. Jest to tak zwana wielka trójka. Stwierdzono, że przynajmniej jeden z tych trzech gatunków występuje w 99% ognisk chorobowych. Nazwane zostały wskaźnikiem zagrożenia postępującej choroby przyzębia, powodując także agresywne postaci choroby. Leczenie ostrych stanów zapalnych polega na stosowaniu antybiotyków kierunkowych, czyli dobranych zgodnie z antybiogramem. Trudności wciąż sprawia leczenie przewlekłych zakażeń, umiejscowionych głęboko w tkankach, wywołanych zmienną florą bakteryjną, najpierw tlenową, następnie beztlenową, często z nałożonymi zaburzeniami miejscowej i uogólnionej odporności. Wobec braku efektów stosowania antybiotykoterapii, sięga się do innych metod postępowania, takich jak stosowanie autoszczepionek, bakteriocyn, wreszcie wykorzystania zjawiska antagonizmu pomiędzy bakteriami zastosowanymi w preparatach lub dodawanymi do żywności. Istotą rozwiązania według wynalazku jest zastosowanie metabolitów bakterii probiotycznej Lactobacillus rhamnosus GG (L.GG) zamkniętej w mikrokapsułkach hydrożelowych do zapobiegania chorobom przyzębia. Wykorzystuje się wyłącznie metabolity bakterii L.GG a nie całe komórki bakteryjne, gdyż nie zachodzi wówczas niebezpieczeństwo wystąpienia ewentualnych niepożądanych skutków działania samej bakterii. Mikrokapsułki hydrożelowe zawierające L.GG mogą być stosowane w żelach stomatologicznych lub umieszczane bezpośrednio w kieszonkach dziąsłowych. Rozwiązanie według wynalazku eliminuje konieczność używania antybiotyków, których stosowanie często ma skutki uboczne. Stosowanie bakterii L.GG umieszczonych w mikrokapsułkach pozwala na łatwe umieszczanie i usuwanie ich z przestrzeni dziąsłowej. Pałeczki kwasu mlekowego Lactobacillus rhamnosus GG, nie tworzą biofilmu na zewnątrz membran kapsuł, co eliminuje ewentualne niebezpieczeństwo rozsiewu bakterii i spowodowania zakażenia u chorych z niedoborami immunologicznymi. Ponadto mikrokapsułki chronią bakterie przed komórkami żernymi. Ważną zaletą jest też możliwość uzyskania większego stężenia L.GG w zapalnie zmienionych tkankach. Rozwiązanie według wynalazku przedstawione jest w przykładach wykonania. P r z y k ł a d I Przygotowano zawiesinę bakterii. Zakupiony w brytyjskiej kolekcji ATCC liofilizat szczepu Lactobacillus rhamnosus GG ATCC , namnożono, dodając 1 ml płynnego podłoża M.R.S. Następnie przesiano do kilku probówek o pojemności 2 ml, zawierających także płynne podłoże M.R.S. Probówki inkubowano w cieplarce w temp. 36,6 C przez 24 h. Po tym czasie zaobserwowano wyraźne zmętnienie podłoża, wskazujące na intensywny wzrost bakterii. Kolejno przesiano pałeczki kwasu mlekowego na podłoża stałe M.R.S. W celu wzrostu i namnożenia bakterii, płytki Petriego wstawiono na kolejne 24 h do cieplarki o temp. 36,6 C. Następnie hodowle bakterii zmyto 0,9% NaCl. Uzyskano zawiesinę pałeczek kwasu mlekowego w roztworze soli fizjologicznej. Gęstość uzyskanej zawiesiny L.GG wynosiła 7 w skali McFarland Techniką wytrącenia polimeru z roztworu, na skutek wkraplania substancji powodujących żelowanie układu, otrzymano mikrokapsułki żelowe używając alginianu sodu, żelującego w obecności kationów wapnia. Następnie poddano mikrokapsułki liofilizacji, która umożliwiła dłuższe przechowywanie

3 PL B1 3 immobilizowanych bakterii. W podłożach stałych, selektywnych, umożliwiających wzrost wybranych szczepów bakterii patogennych, wycięto steryinym korkoborem cztery równe otwory, które wypełniono wcześniej przygotowanym podłożem MRS z dodatkiem mikrokapsułek. Płytki zawierające mikrokapsułki z Lactobacillus rhamnosus GG inkubowano w celu nasycenia metabolitami L.GG podłoży selektywnych dla bakterii patogennych. Następnie, na powierzchni płytek, rozprowadzono odpowiednie rozcieńczenia bakterii Neisseria ssp. Efekt antagonistycznego działania L.GG zmierzono w milimetrach od centrum każdego z wykonanych otworów, a średnie wartości stref zahamowania wzrostu bakterii wyliczono z pomiarów dokonanych na każdej pojedynczej płytce Petriego. Wyniki pomiarów przedstawiono w tabeli 1. T a b e l a ,4 2 16,3 3 15,0 4 14,2 5 17,6 6 15,0 7 17,1 8 14,6 9 17, ,0 P r z y k ł a d 2 Rozwiązanie jak w przykładzie 1, z tym badania prowadzono dla bakterii Haemophilus influenzae. Wyniki pomiarów przedstawiono w tabeli 2. T a b e l a ,6 2 18,7 3 14,9 4 13,0 5 15,6 6 16,3 7 16,3 8 18,0 9 12, ,5 P r z y k ł a d 3 Rozwiązanie jak w przykładzie 1, z tym badania prowadzono dla bakterii Actinomyces odontolyticus. Wyniki pomiarów przedstawiono w tabeli 3.

4 4 PL B1 T a b e l a ,0 2 15,6 3 15,5 4 15,9 5 15,4 6 15,3 7 13,0 8 14,4 9 16, ,9 P r z y k ł a d 4 Rozwiązanie jak w przykładzie 1, z tym badania prowadzono dla bakterii Actinobacillus actinomycetemcomitans. Wyniki pomiarów przedstawiono w tabeli 4. T a b e l a ,6 2 16,6 3 16,6 4 13,6 5 17,7 6 11,5 7 15,0 8 17,5 9 15, ,0 P r z y k ł a d 5 Rozwiązanie jak w przykładzie 1, z tym badania prowadzono dla bakterii Actinobacillus Naeslundii. Wyniki pomiarów przedstawiono w tabeli 5. T a b e l a ,4 2 14,2 3 15,3 4 16,4 5 15,6 6 14,6

5 PL B ,0 cd. tabeli ,4 9 13, ,0 P r z y k ł a d 6 Rozwiązanie jak w przykładzie 1, z tym badania prowadzono dla bakterii Porphyromonas gingivalis. Wyniki pomiarów przedstawiono w tabeli 6. T a b e l a , , , , , , , , , ,00 P r z y k ł a d 7 Rozwiązanie jak w przykładzie 1, z tym badania prowadzono dla bakterii Actinomyces israelii. Wyniki pomiarów przedstawiono w tabeli 7. T a b e l a ,2 2 11,6 3 16,0 4 14,5 5 17,0 6 17,5 7 15,0 8 17,1 9 15, ,0 Zastrzeżenie patentowe Zastosowanie metabolitów bakterii probiotycznej Lactobacillus rhamnosus GG (L.GG) zamkniętej w mikrokapsułkach hydrożelowych do zapobiegania chorobom przyzębia.

6 6 PL B1 Departament Wydawnictw UPRP Cena 2,46 zł (w tym 23% VAT)