Szczep bakterii Lactobacillus plantarum S, zastosowanie szczepu bakterii Lactobacillus plantarum S oraz preparat do kiszenia pasz objętościowych

Transkrypt

1 PL B1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) (13) B1 Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (21) Numer zgłoszenia: (22) Data zgłoszenia: (51) Int.Cl. C12R 1/25 ( ) C12P 1/04 ( ) C12N 1/20 ( ) A23K 1/00 ( ) A23K 3/00 ( ) (54) Szczep bakterii Lactobacillus plantarum S, zastosowanie szczepu bakterii Lactobacillus plantarum S oraz preparat do kiszenia pasz objętościowych (43) Zgłoszenie ogłoszono: BUP 26/11 (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: WUP 08/13 (73) Uprawniony z patentu: INSTYTUT BIOTECHNOLOGII PRZEMYSŁU ROLNO-SPOŻYWCZEGO IM. PROF. WACŁAWA DĄBROWSKIEGO, Warszawa, PL (72) Twórca(y) wynalazku: KRYSTYNA ZIELIŃSKA, Warszawa, PL KRYSTYNA STECKA, Warszawa, PL ANTONI MIECZNIKOWSKI, Warszawa, PL AGATA KAPTUROWSKA, Płock, PL MARTA KUPRYŚ, Biała Podlaska, PL (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Karyna Kuciak-Próchniak

2 2 PL B1 Opis wynalazku Przedmiotem wynalazku jest szczep bakterii Lactobacillus plantarum S, jego zastosowanie oraz preparat do kiszenia skażonych pasz objętościowych. Ochratoksyna A (OTA) jest syntetyzowana przez pleśnie z rodzajów: Aspergillus sp. i Penicillium sp., które często rozwijają się na płodach rolnych. OTA została zaklasyfikowana przez International Agency for Research on Cancer do czynników rakotwórczych kategorii 2 B. Prowadzone w różnych latach badania monitoringowe dotyczące obecności OTA w paszach i żywności, wskazują na istnienie poważnych zagrożeń dla zwierząt i ludzi, zwłaszcza w latach ciepłych i wilgotnych, sprzyjających rozwojowi grzybów pleśniowych. Z opisów patentowych WO 91/13555 i WO 92/05706 znane są metody wiązania mikotoksyn w paszach i przewodzie pokarmowym zwierząt przez związki mineralne. Zastosowanie tych adsorbentów wiąże również wodę i rozpuszczone w niej ważne dla organizmu składniki pokarmowe i witaminy. Znane obecnie chemiczne i fizyczne metody dekontaminacji skażonych OTA partii pasz są technicznie niemożliwe do zastosowania bezpośrednio w gospodarstwach rolnych, lub nie są dopuszczone do stosowania w krajach UE. Dlatego istnieje zapotrzebowanie na biologiczne metody dekontaminacji skażonych pasz polegające na zastosowaniu wybranych szczepów bakterii i/lub drożdży. W opisie patentowym US 2004/ Al wymieniono szczepy mikroorganizmów zdolne do detoksyfikacji ochratoksyn, przez enzymatyczne odszczepienie grupy fenyloalaniny. Te szczepy zostały wyselekcjonowane z następujących rodzajów bakterii: Shingomonas, Stenotrophomonas, Ochrabactrum, Ralstonia i/lub Eubacterium oraz drożdży: Trichosporon, Cryptococcus i Rhodotorula. Poszukiwanie nowych szczepów bakterii fermentacji mlekowej naturalnie bytujących w środowisku, nie modyfikowanych genetycznie, które mogą być wykorzystane do poprawy bezpieczeństwa kiszonych pasz, a w następstwie żywności, jest przedmiotem stale podejmowanych badań. Zdolności te są ściśle związane z określonym szczepem i nie mogą być identyfikowane z danym gatunkiem czy rodzajem bakterii fermentacji mlekowej. Wśród tej grupy mikroorganizmów znane są nieliczne szczepy bakterii, które w różnym stopniu charakteryzują się zdolnością do obniżania zawartości OTA w środowisku modelowym. Brak jest natomiast wyników ich praktycznego zastosowania, zwłaszcza w warunkach produkcyjnych gospodarstw rolnych, do dekontaminacji pasz skażonych OTA. Ze względu na brak możliwości zabezpieczenia płodów rolnych przed skażeniem pleśniami toksynotwórczymi poszukiwane są proste biologiczne sposoby likwidacji lub ograniczania zawartości OTA, przez wybrane szczepy bakterii z rodzaju Lactobacillus sp. o statusie GRAS, które mogą być stosowane jako kultury starterowe w procesie kiszenia pasz. Celem wynalazku było wyselekcjonowanie szczepu bakterii fermentacji mlekowej, charakteryzującego się zdolnością do rozwoju w środowisku skażonym ochratoksyną A i obniżania jej zawartości o co najmniej 80%, a ponadto jego zastosowanie do kiszenia skażonych pasz objętościowych. Szczep według wynalazku wyizolowano z poddanych samorzutnej fermentacji roślin kukurydzy, a następnie selekcjonowano w celu uzyskania zdolności do rozwoju i syntezy kwasów organicznych w podłożach zawierających ochratoksynę A o stężeniach od 50 do 100 ppb. Został on zaklasyfikowany do gatunku Lactobacillus plantarum. Przedmiotem wynalazku jest szczep bakterii, który określono jako Lactobacillus plantarum S i zdeponowano w Międzynarodowej Kolekcji Kultur Drobnoustrojów Przemysłowych Instytutu Biotechnologii Przemysłu Rolno-Spożywczego pod numerem KKP 2021 p. Drugim przedmiotem wynalazku jest zastosowanie szczepu Lactobacillus plantarum S KKP 2021 p do kiszenia pasz objętościowych, z przeznaczeniem do dekontaminacji pasz objętościowych skażonych ochratoksyną A, pleśniami, jak również bakteriami patogennymi z rodzaju Salmonella sp. oraz gatunków: Escherichia coli i Clostridium perfringens. Trzecim przedmiotem wynalazku jest granulowany preparat do kiszenia pasz objętościowych, który zawiera wysuszoną na nośnikach, biomasę bakterii Lactobacillus plantarum S KKP 2021 p o liczbie bakterii 9-10 log j.t.k/g preparatu, przy czym w skład nośników wchodzi wyciąg z aloesu który stanowi 0,2-0,8% suchej masy preparatu. Szczep Lactobacillus plantarum S KKP 2021 p charakteryzuje się następującymi cechami: morfologicznymi - tworzy kolonie koloru białego do kremowego o kształcie dysków o wielkości 0,5-0,7 mm. Komórki bakterii mają postać krótkich pałeczek występujących pojedynczo, parami lub w łańcuszkach o wielkości 0,9-1,2 pm., nie wytwarzają przetrwalników, są Gram dodatnie.

3 PL B1 3 fizjologicznymi i biochemicznymi - optymalną temperaturą wzrostu wynoszącą 30 C. Nowy szczep podobnie jak wszystkie z tego gatunku jest względnie heterofermentatywny, mikroaerofilny, nie tworzy katalazy, nie redukuje azotanów do azotynów, jest zdolny do fermentacji następujących cukrów: sacharozy, galaktozy, glukozy, fruktozy, arabinozy, maltozy, mannozy, eskuliny, laktozy, celobiozy, gencjobiozy, melibiozy, rafinozy, rybozy, ksylozy, sorbitolu i trehalozy. Na podstawie wyników analizy genetycznej, sekwencji zasad odcinka 16S rdna i porównania ich z sekwencjami bakteryjnych odcinków 16S rdna, zdeponowanymi w bazie GenBank potwierdzono w 98%, określoną cechami biochemicznymi, afiliację taksonomiczną szczepu do gatunku Lactobacillus plantarum. Poniżej przedstawiono kolejność zasad odcinka 16 S rdna szczepu Lactobacillus plantarum S KKP 2021 p. Nowy szczep charakteryzuje się zdolnością do rozwoju i syntezy kwasu mlekowego w podłożu zawierającym ochratoksynę A oraz usuwania jej ze środowiska w co najmniej 80%, jak również hamowaniem rozwoju pleśni. Ponadto nieoczekiwanie okazało się, że nowy szczep wykazuje jednocześnie bardzo wysoką aktywność antybakteryjną w stosunku do bakterii chorobotwórczych z rodzaju Salmonella sp., gatunku Escherichia coli oraz z gatunku Clostridium perfringens, które są często obecne w płodach rolnych, uprawianych na gruntach nawożonych organicznie, a zwłaszcza płynnymi nawozamizami organicznymi.

4 4 PL B1 W warunkach modelowych, w czasie hodowli nowego szczepu Lactobacillus plantarum S w podłożu MRS, w temperaturze 30 C, przez 72 h, zawartość ochratoksyny A obniżyła się o 87,2%, w stosunku do jej zawartości początkowej (rys. 1). Aktywność antybakteryjną szczepu Lactobacillus plantarum S KKP 2021 p, w stosunku do szczepów chorobotwórczych: Salmonella sp. i Escherichia coli, wyizolowanych z przewodu pokarmowego chorych zwierząt, oznaczono metodą Pileta (Pilet i in., J. Food Prot., 58, ). Po upływie 24 h hodowli badanego szczepu wprowadzono 10 μι supernatantu na powierzchnię podłoża agarowego o średnicy 10 cm, zawierającego bakterie Salmonella sp. Iub Escherichia coli i po kolejnych 24 h mierzono średnicę strefy zahamowania ich wzrostu. W warunkach doświadczenia metabolity wytwarzane przez szczep Lactobacillus plantarum S hamowały wzrost testowych bakterii chorobotwórczych w zakresie od 90 do100 procent. W czasie siedmiu dni inkubacji oceniono przeżywalność kultur bakterii Salmonella sp i Escherichia coli. Jako materiał do badań używano kultury bakterii hodowane przez 24 h. Kultury bakterii Salmonella sp. i Escherichia coli charakteryzyzujące się odpowiednio mianem: 6,5 i 6,0 log j.t.k./ml, zostały połączone z kulturą bakterii Lactobacillus plantarum S o mianie 9,0 log j.t.k./ml, w stosunku objętościowym 1:1. Po upływie sześciu dni inkubacji nowy szczep Lactobacillus plantarum S w pełni zahamował rozwój bakterii Salmonella sp. a po upływie siedmiu dni inkubacji rozwój bakterii Escherichia coli (rys. 2).

5 PL B1 5 Wynalazek ilustrują poniższe przykłady wykonania. P r z y k ł a d I Hodowlę biomasy bakterii Lactobacillus plantarum S KKP 2021 p prowadzono w fermentorach o pojemności 150 I, w temperaturze 30 C, przy ph 5,7, regulowanym wodą amoniakalną. Zawartość składników podłoża hodowlanego w g/l wody wynosiła: glukozy - 20, ekstraktu drożdżowego - 10, namoku kukurydzianego - 5, fosforanu dwuamonowego - 0,2, siarczanu amonowego - 0,35, siarczanu manganowego - 0,01. Czas hodowli bakterii wynosił 24 h. Biomasę bakterii o zawartości suchej masy około 30%, otrzymaną po odwirowaniu podłoża hodowlanego, przy szybkości obrotów wirówki 14000/min mieszano z nośnikami: sacharozą, glukozą, laktozą, rozpuszczalną skrobią ziemniaczaną oraz emulgatorem (lecytyną) i biostymulatorem (wyciągiem z aloesu). Następnie suszono w suszarni fluidyzacyjnej, w temperaturze do 40 C. Wysuszony preparat bakterii zawierał około 94% suchej masy, w tym: 90% cukrów, 0,2% wysuszonego wyciągu z aloesu i 3,8% wysuszonej biomasy bakterii charakteryzował się liczbą bakterii 9,0 log j.t.k./g (jednostek tworzących kolonie na gram preparatu). P r z y k ł a d Il W doświadczalnym gospodarstwie rolnym sporządzano dwa rodzaje kiszonek: z runi łąkowej oraz roślin kukurydzy, o wilgotności około 40%, skażonych ochratoksyną A, pleśniami i bakteriami patogennymi. W celu wykonania kiszonek doświadczalnych preparat według wynalazku (otrzymany w przykładzie I), w dawce 10 g/t skoszonej zielonki, aplikowano w formie oprysku wodnego. Po upływie sześciu tygodni i zakończeniu procesu kiszenia, pobierano próbki kiszonek bez i z dodatkiem preparatu i badano efekty działania bakterii Lactobacillus plantarum S na obniżenie zawartości: ochratoksyny A, liczby pleśni i bakterii patogennych w zakiszonych paszach. W kiszonkach doświadczalnych z dodatkiem preparatu zawartość ochratoksyny A w roślinach kukurydzy obniżyła się z wartości 30,6 ppb. do 4,5 ppb. to znaczy o 85,3%, w runi łąkowej z wartości 25,5 ppb do poziomu 3,2 ppb. czyli o 87,4%. W kiszonkach wytworzonych bez dodatku preparatu zawartość ochratoksyny A obniżyła się, zależnie od początkowego stężenia i rodzaju kiszonych roślin, o 6,7 do 7,5% (tab. 1).

6 6 PL B1 T a b e l a 1 Wpływ preparatu na obniżenie zawartości ochratoksyny A w procesie kiszenia pasz objętościowych. Rodzaj paszy i/lub kiszonki o zawartości s.m. około 40% Zawartość ochratoksyny A, ppb. Pozostała zawartość, % Ruń łąkowa - zielonka 25,5 100,0 Ruń łąkowa - kiszonka A 23,8 93,3 Ruń łąkowa - kiszonka B 3,2 12,6 Rośliny kukurydzy - zielonka 30,6 100,0 Rośliny kukurydzy-kiszonka A 28,3 92,5 Rośliny kukurydzy - kiszonka B 4,5 14,7 A - kiszonki bez dodatku preparatu B - kiszonki z dodatkiem preparatu Jednocześnie badano czystość mikrobiologiczną kiszonek wytworzonych bez i z dodatkiem preparatu, określono ich skażenie mikrobiologiczne bakteriami z rodzaju Salmonella sp., gatunków: Escherichia coli i Clostridium perfringens oraz pleśniami. Wyniki dotyczące wpływu preparatu na poprawę stanu higieny kiszonek przedstawiono w tab. 2. Rodzaj kiszonki z: runi łąkowej -A runi łąkowej -B roślin kukurydzy -A T a b e l a 2 Skażenie mikrobiologiczne kiszonych pasz objętościowych bez i z dodatkiem preparatu Salmonella sp. Liczba bakterii patogennych i pleśni kiszonkach, log j.t.k./g Escherichia coli Bakterie grupy coli Clostridium perfringens Pleśnie 2,60 3,30 2,50 3,70 5,60 Brak Brak Brak 1,00 1,30 2,30 2,70 3,30 2,30 5,20 roślin kukurydzy -A Brak Brak 1,00 0,50 1,00 A - kiszonki bez dodatku preparatu B - kiszonki z dodatkiem preparatu W kiszonkach z runi łąkowej z dodatkiem preparatu bakterie chorobotwórcze z rodzaju Salmonella sp. i gatunku Escherichia coli jak również bakterie z grupy coli zostały wyeliminowane w 100%. W kiszonkach z roślin kukurydzy z dodatkiem preparatu nie stwierdzono obecności Salmonella sp. i Escherichia coli, a bakterie z grupy coli stanowiły tylko 30% ich liczby zawartej w kiszonce bez preparatu. Liczba bakterii Clostridium perfringens była w kiszonkach z dodatkiem preparatu niższa odpowiednio o 73 i 78%, natomiast liczba pleśni niższa o 77% w kiszonkach z runi łąkowej i w 80% w kiszonkach z roślin kukurydzy, w porównaniu do kiszonek bez dodatku preparatu Lactobacillus plantarum S. Skażone pleśniami, ochratoksyną A i mikroorganizmami patogennymi pasze, po procesie fermentacji mlekowej z udziałem bakterii nowego szczepu Lactobacillus plantarum S mogą być, jako w pełni bezpieczne, wykorzystane do żywienia zwierząt hodowlanych.

7 PL B1 7 Zastrzeżenia patentowe 1. Szczep bakterii Lactobacillus plantarum S zdeponowany w Międzynarodowej Kolekcji Kultur Drobnoustrojów Przemysłowych Instytutu Biotechnologii Przemysłu Rolno Spożywczego w Warszawie pod numerem KKP 2021 p. 2. Zastosowanie szczepu bakterii Lactobacillus plantarum S KKP 2021 p do kiszenia pasz objętościowych, z przeznaczeniem do dekontaminacji pasz objętościowych skażonych ochratoksyną A, pleśniami, jak również bakteriami patogennymi z rodzaju: Salmonella sp. oraz gatunków: Escherichia coli i Clostridium perfringens. 3. Preparat do kiszenia pasz objętościowych w postaci granulatu, składający się z wysuszonej biomasy bakterii i nośników, znamienny tym, że zawiera szczep Lactobacillus plantarum S KKP 2021 p o liczbie bakterii 9-10 log j.t.k/g, przy czym w skład nośników wchodzi wyciąg z aloesu, który stanowi 0,2-0,8% suchej masy preparatu.

8 8 PL B1 Departament Wydawnictw UP RP Cena 2,46 zł (w tym 23% VAT)