PL B1. INSTYTUT BIOTECHNOLOGII SUROWIC I SZCZEPIONEK BIOMED SPÓŁKA AKCYJNA, Kraków, PL BUP 25/08

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) (13) B1 Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (21) Numer zgłoszenia: (22) Data zgłoszenia: (51) Int.Cl. A61K 35/74 ( ) C12N 1/20 ( ) C12R 1/225 ( ) C12R 1/25 ( ) A61P 1/00 ( ) A61P 15/02 ( ) (54) Zastosowanie kompozycji szczepów z rodzaju Lactobacillus (43) Zgłoszenie ogłoszono: BUP 25/08 (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: WUP 01/12 (73) Uprawniony z patentu: INSTYTUT BIOTECHNOLOGII SUROWIC I SZCZEPIONEK BIOMED SPÓŁKA AKCYJNA, Kraków, PL (72) Twórca(y) wynalazku: PIOTR B. HECZKO, Kraków, PL MAGDALENA STRUS, Kraków, PL GRZEGORZ STEFAŃSKI, Warszawa, PL KATARZYNA DECHNIK, Kraków, PL (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Alina Magońska PL B1

2 2 PL B1 Opis wynalazku Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie kompozycji szczepów z rodzaju Lactobacillus do wytwarzania preparatu farmaceutycznego Skład mikroflory pochwy jest zróżnicowany w poszczególnych okresach życia kobiety i ściśle uzależniony od aktywności hormonalnej ustroju. Podstawową wiedzę o ekosystemie pochwy przyniosły badania Cruickshanka i Shermana, którzy opisali mikroflorę pochwy u płodu w jamie macicy, noworodków, dziewczynek przed dojrzewaniem oraz kobiet w okresie rozrodczym i po menopauzie. W jamie macicy pochwa płodu jest jałowa, natomiast w pierwszych 2-3 tygodniach po urodzeniu skład ilościowy mikroflory jest zbliżony do składu ilościowego mikroflory pochwy dorosłej kobiety, co wynika ze stymulacji przez estrogeny matki. Przed wystąpieniem pierwszej miesiączki w środowisku pochwy dominują takie bakterie jak S. epidermidis, Bacteroides spp., Peptococcus spp., Porphyromonas spp., G. vaginalis. W okresie reprodukcyjnym środowisko pochwy w głównym stopniu zdominowane jest populacją bakterii z rodzaju Lactobacillus. Dawniej uważano, że rodzaj ten reprezentowany jest tylko przez jeden gatunek, tj. Lactobacilus acidophilus. W ostatnim dziesięcioleciu rozwój nowoczesnych metod molekularnych umożliwił uporządkowanie klasyfikacji większości bakterii, dzięki czemu okazało się, że gatunek Lactobacillus acidophilus nie jest jednorodny i stanowi kompleks kilku innych gatunków, takich jak L. crispatus, L. amylovorus, L. gallinarum, L. acidophilus sensu stricto, L. gasseri, L. johnsoni. Stosując nowoczesne metody molekularne, w tym techniki sekwencjonowania DNA, a także ulepszone procedury hodowli udowodniono, iż gatunkami najczęściej spotykanymi w prawidłowym środowisku pochwy zdrowych kobiet są różne gatunki z kompleksu acidophilus, takie jak L. johnsoni, L. gasseri, L. acidophilus, L. crispatus, a ponadto L. plantarum i L. fermentum. Mechanizmy działania bakterii z rodzaju Lactobacillus w środowisku pochwy nie są jeszcze do końca poznane. Powszechnie uważa się, że: syntetyzują one substancje przeciwdrobnoustrojowe, takie jak kwas mlekowy, octowy, pyroglutaminowy, obniżając tym samym ph środowiska pochwy do wartości 3,7-4,6, produkują krótkie peptydy i/lub białka o bardziej złożonej budowie, podobne do bakteriocyn, które adherują do receptorów na powierzchni wrażliwych bakterii doprowadzając do ich lizy, a w konsekwencji do śmierci bakterii, posiadają zdolność rywalizacji z innymi mikroorganizmami, przede wszystkim chorobotwórczymi, o składniki odżywcze i receptory na nabłonku pochwy, modyfikują toksyny i receptory dla toksyn, wytwarzają nadtlenek wodoru - niektóre gatunki Lactobacillus, produkujące H 2 O 2 dominują w populacjach drobnoustrojów zdrowej pochwy, wywierają różnorodny wpływ immunomodulując układ odpornościowy gospodarza. Dzięki tym wielorakim właściwościom, bakterie z rodzaju Lactobacillus utrzymują pewien stan biologicznej równowagi pochwy, dzięki czemu nie dochodzi do liczbowego przyrostu populacji mikroorganizmów chorobotwórczych bytujących w drogach rodnych kobiet, a przez to zmniejsza się ryzyko wystąpienia waginozy bakteryjnej. W związku z tym, iż w dużej mierze zakażenia dróg moczowo-płciowych u kobiet wynikają z zaburzenia mikroflory pochwy, sposoby zarówno zapobiegania, jak i leczenia są skierowane na przywrócenie zaburzonej równowagi. W 1992 roku przeprowadzono w USA badanie (Hilton E, Isenberg HD, Alperstein P, France K, Borenstein MT. Ingestion of yogurt containing Lactobacillus acidophilus as prophylaxis for candidal vaginitis. Ann Intern Med 1992; 116: ) polegające na codziennym podawaniu jogurtu zawierającego Lactobacillus acidophilus przez 6 miesięcy 35 kobietom z nawrotową kandydozą sromu i pochwy w celu zapobiegania nawrotom choroby. Końcowym punktem badania była kolonizacja pochwy i odbytu przez Candida i Lactobacillus oraz kandydozą. Badanie ukończyło 13 chorych, ale analizę przeprowadzono dla 33. Stwierdzono znamienny spadek liczby zakażeń Candida przez 6 miesięcy u osób skolonizowanych (w odbycie i pochwie) przez Candida. Badanie przeprowadzono na zwykłym jogurcie, który zawierał L. acidophilus, produkujący średnie ilości H 2 O 2. Nie identyfikowano szczepów L. acidophilus wyizolowanych od kobiet. Grupa kobiet też była minimalna. Natomiast wykazano ścisłą zależność pomiędzy obecnością L. acidophilus w odbycie i w pochwie: jeśli nie było L. acidophilus w odbycie, prawdopodobieństwo, że będzie w pochwie wyniosło 15,5%, zaś jeśli był w odbycie, prawdopodobieństwo, że będzie w pochwie 54,8% (P < 0,001). Autorzy stwierdzili, że jelitowy szczep

3 PL B1 3 L. acidophilus kolonizował pochwę, ale przy braku dowodów molekularnych, jest to niemożliwe do udowodnienia. Podobne badanie przeprowadzono w 1996 roku w Izraelu (Shalev E, Battino S, Weiner E, Colodner R, Keness Y. Ingestion of yogurt containing Lactobacillus acidophilus compared with pasteurized yogurt as prophylaxis for recurrent candidal vaginitis and bacterial vaginosis. Arch Fam Med 1996; 5: ) w oparciu o ten sam protokół i przy użyciu jogurtu zawierającego L. acidophilus produkujący H 2 O 2. W tych badaniach nie wykazano profilaktycznego działania na nawroty drożdżycy pochwy (ten sam efekt dawał jogurt z zabitymi bakteriami), lecz na bakteryjną waginozę, równolegle z podwyższeniem liczby kobiet skolonizowanych przez L. acidophilus. Natomiast wykazano współistnienie kolonizacji odbytu i pochwy przez Candida. W 2001 roku przeprowadzono w Finlandii (Kontiokari T, Sundqvist K, Nuutinen M, Pokka T, Koskela M, Uhari M. Randomised trial of cranberry-lingonberry juice and Lactobacillus GG drink for the prevention of urinary tract infections in women. Brit Med J 2001; 322: ) otwarte randomizowane badanie nad możliwością zapobiegania nawrotowym zapaleniom dróg moczowych u kobiet przy zastosowaniu albo soku z żurawiny i brusznicy, albo napoju z Lactobacillus GG. Badanie trwało 12 miesięcy i polegało na obserwacji nawrotów zapalenia u 150 kobiet podzielonych na 3 grupy, u których wcześniej stwierdzono zakażenie dróg moczowych (> 10 5 bakterii/ml moczu). Parametrem końcowym było pojawienie się nawrotu zapalenia. Nie uzyskano efektu działania Lactobacillus GG w porównaniu do soku z żurawiny/brusznicy. Być może Lactobacillus GG, jako typowy szczep jelitowy nie kolonizował ujścia cewki moczowej/pochwy. W 2003 roku (Reid G, Charbonneau D, Erb J, Kochanowski B, Beuerman D, Poelmer R, Bruce AW. Oral use of Lactobacillus rhamnosus GR-1 and L. fermentum RC-14 signficantly alters vaginal flora: randomized, placebo-controlled trial in 64 healthy women. FEMS Immunol Med Microbiol 2003; 35: ) przeprowadzono randomizowane badania kliniczne z użyciem placebo nad wpływem doustnie podawanych przez 60 dni Lactobacillus rhamnosus GR-1 i L. fermentum RC-14 na florę pochwową u 64 zdrowych kobiet. Analiza mikroskopowa wykazała powrót do normalnej flory u 37% kobiet grupy badanej w porównaniu z 13% kobiet z grupy kontrolnej. Hodowla dała obraz znamiennego zwiększenia się liczby Lactobacillus, natomiast zmniejszenia się liczby drożdży i pałeczek jelitowych. Probiotyk był bezpieczny przy codziennym zażywaniu. W 2004 roku ci sami autorzy przeprowadzili następne badanie przy użyciu tych samych szczepów (Reid G, Burton J, Hammond JA, Bruce AW. Nucleic acid-based diagnosis of bacterial vaginosis and improved management using probiotic lactobacilli. J Med Food 2004; 7: ) podawanych 59 kobietom z bezobjawową bakteryjna waginozą diagnozowaną za pomocą DGGE. Wykazali powrót mikroflory pochwy zdominowanej przez Lactobacillus po 2 miesiącach od podawania probiotyków. Przechodzenie (cross-colonisation) bakterii z odbytu do pochwy dotyczy także takich patogenów, jak Streptococcus agalactiae, uropatogenne szczepy Escherichia coli czy Staphylococcus aureus. W ostatnio opublikowanej pracy, (Warner JE, Onderdonk AB. Diversity of toxic shock syndrome toxin 1-positive Staphylococcus aureus isolates. Appl Environ Microbiol 2004; 70: ) wykazano za pomocą metody PFGE identyczne szczepy S. aureus obecne w obu miejscach u 59% badanych kobiet. Należy zwrócić uwagę, że brak jest w literaturze dowodów na przechodzenie czy krzyżową kolonizację odbytu i pochwy przez te same szczepy Lactobacillus. Być może na przeszkodzie stał dawniej brak odpowiednich metod typowania molekularnego. Dodatkowo, podawanie szczepów Lactobacillus pod postacią produktów mlecznych nie jest możliwe u wszystkich pacjentów ze względów dietetycznych. Opisywane szczepy Lactobacillus, podawane doustnie, wykazywały niedostateczną przeżywalność w układzie pokarmowym i wymagały ochrony wewnątrz specjalnych kapsułek. Znane jest z polskiego opisu patentowego nr zastosowanie skojarzenia bakterii kwasu mlekowego z gatunku Lactobacillus brevis i Lactobacillus salivarius podgatunek salicinius do wytworzenia kompozycji farmaceutycznej stosowanej do podawania dopochwowego w celu leczenia waginozy i zapalenia pochwy. Wymieniony opis patentowy ujawnia również kompozycję farmaceutyczną zawierającą skojarzenie bakterii kwasu mlekowego z gatunku Lactobacillus brevis i Lactobacillus salivarius podgatunek salicinius. Z badań (Struś M., Podstawy stosowania probiotyków dopochwowych w zakażeniach narządu moczowo-płciowego. Zakażenia, 2005, 4, 40-43) wynika, że w mikroflorze pochwy zdrowych kobiet najczęściej występuje po kilka gatunków Lactobacillus. Wykazano, że gatunkami najczęściej izolowanymi były szczepy, które należały do kompleksu L. acidophilus, a ponadto gatunki: L. fermentum i L. plantarum. Zastosowane według patentu nr szczepy nie są charak-

4 4 PL B1 terystyczne dla populacji polskich kobiet. Również sposób podawania (dopochwowy) jest niewygodny przy codziennym stosowaniu. Znane są z polskiego opisu patentowego nr P nowe szczepy: Lactobacillus fermentum 57A zdeponowany pod numerem - B/00007, Lactobacillus plantarum 57B zdeponowany pod numerem - B/00008, Lactobacillus gasseri 57C zdeponowany pod numerem - B/00009, Lactobacillus plantarum 78B zdeponowany pod numerem - B/ Przedmiotem wynalazku jest również kompozycja nowych szczepów z rodzaju Lactobacillus, która zawiera szczepy Lactobacillus fermentum 57A, Lactobacillus plantarum 57B, Lactobacillus gasseri 57C, których względne ilości wyznacza proporcja 0,5:0,5:1. Powyższe szczepy pobrano z tylnego sklepienia pochwy zdrowej kobiety, wykazującej normalną florę pochwy. Badania dowodzą, że szczepy Lactobacillus plantarum 57B, Lactobacillus fermentum 57A i Lactobacillus gasseri 57C spełniają wszystkie wymagania stawiane produktom probiotycznym. Na podstawie przeprowadzonych testów można wnioskować, że nowe szczepy są korzystniejsze w porównaniu z innymi przebadanymi szczepami. Dodatkowo, każdy z wyselekcjonowanych i zdeponowanych szczepów posiada silną cechę wiodącą. Szczep Lactobacillus plantarum 57B charakteryzuje się silnymi właściwościami antagonistycznymi, szczególnie na patogeny, takie jak: Gardnerella vaginalis i Escherichia coli, Lactobacillus fermentum 57A bardzo dobrze przylega do komórek ustroju gospodarza, zaś Lactobacillus gasseri 57C wytwarza duże ilości nadtlenku wodoru. Celem wynalazku jest zastosowanie kompozycji szczepów z rodzaju Lactobacillus znajdujących do skutecznego przywracania właściwej flory bakteryjnej pochwy przez podanie w jak najwygodniejszej formie. Istotą wynalazku jest zastosowanie kompozycji nowych szczepów z rodzaju Lactobacillus zawierającej szczepy Lactobacillus fermentum 51A, Lactobacillus plantarum 57B i Lactobacillus gasseri 57C wyróżniających się szczególnymi właściwościami, którymi są: silne zróżnicowanie powinowactwa do nabłonka przewodu pokarmowego i nabłonka pochwy umożliwiająca kolonizację pochwy i ujścia odbytu po przejściu przez jelita i zdolność do koagregacji umożliwiająca synergiczne działanie, do wytwarzania preparatu farmaceutycznego do stosowania doustnego w celu przywracania właściwej flory bakteryjnej pochwy i odbytu. Zastosowanie kompozycji polega na przygotowaniu porcji preparatu farmaceutycznego składającego się z liofilizowanych szczepów bakterii Lactobacillus fermentum 57A, Lactobacillus plantarum 57B i Lactobacillus gasseri 57C i farmaceutycznie dopuszczalnego nośnika i/lub substancji dodatkowych, zamkniętej w kapsułce. Nieoczekiwanie stwierdzono, że kompozycja szczepów z rodzaju Lactobacillus posiada unikalną zdolność do symultanicznej kolonizacji pochwy i odbytu. Zastosowane w kompozycji szczepy z rodzaju Lactobacillus nie ulegają wpływom warunków panujących w przewodzie pokarmowym, tak więc kompozycja jest predysponowana do podawania doustnego. Nieoczekiwanie stwierdzono, że szczepy z rodzaju Lactobacillus wchodzące w skład kompozycji posiadają unikalną cechę wzajemnej koagregacji. Wymienione właściwości kompozycji szczepów z rodzaju Lactobacillus umożliwiają jej doustne stosowanie. Szczep Lactobacillus fermentum 57A wykazuje bardzo dobre powinowactwo do nabłonka jelitowego i posiada zdolność przylegania do tego nabłonka, jest zatem w stanie stworzyć warunki do jego kolonizacji. Ponieważ szczep Lactobacillus gasseri 57C wykazuje bardzo dobre powinowactwo do nabłonka pochwy, a nie posiada tak silnie wyrażonej cechy powinowactwa do nabłonka jelitowego nie potrafiłby samodzielnie kolonizować tej powierzchni. Zjawisko koagregacji z pozostałymi szczepami pozwala mu także, pośrednio, uczestniczyć w kolonizacji nabłonka jelitowego, a tym samym odbytu. W ten sposób powstają liczne populacje Lactobacillus gasseri w przewodzie pokarmowym, które mają zwiększone szanse na przejście na nabłonek pochwy, który jest naturalnym środowiskiem dla tego gatunku i do którego wykazuje on wysoki stopień powinowactwa. Zatem ułatwione przejście Lactobacillus gasseri 57C i pozostałych dwóch szczepów do ekosystemu pochwy dzięki koagregacji powoduje szybką kolonizację nabłonka pochwy. I. Badania oporności kompozycji zawierającej szczepy Lactobacillus na warunki panujące w przewodzie pokarmowym 1. Przeżywalność szczepów Lactobacillus w niskim ph odpowiadającym ph soku żołądkowego Przeżywalność szczepów Lactobacillus w niskim ph wykazano w oparciu o zmodyfikowaną metodę Lankaputra i Shah (1995). Badane szczepy Lactobacillus fermentum 57A, Lactobacillus plantarum 57B, Laciobacilluss gasseri 57C namnożono w płynnym podłożu MRS. Hodowlę prowadzono

5 PL B1 5 w warunkach beztlenowych w 37 C przez 24 godziny. Po upływie tego czasu, za pomocą metody seryjnych rozcieńczeń, określono uzyskaną gęstość poszczególnych szczepów bakterii. Następnie, przy pomocy 1N HCL obniżano ph medium hodowlanego do wartości 1,2 równej wartości ph soku żołądkowego. Hodowle dalej inkubowano przez 20 minut w warunkach beztlenowych w 37 C, a następnie wysiewano w celu określenia stopnia redukcji badanych populacji bakterii pod wpływem niskiego ph. Wynik podano w tabeli 1. T a b e l a 1 Oporność szczepów Lactobacillus na niskie ph Gęstość bakterii podana w j.t.k./1 ml Badany szczep Gęstość wyjściowa Gęstość po 20 min. inkubacji w ph 1,2 L fermentum 57A 2 x x 10 6 L. plantarum 57B 1 x ,2 x 10 7 L. gasseri 57C 2,5 x x 10 6 Kontrola L. rhamnosus GG 1 x x Przeżywalność szczepów Lactobacillus w sztucznym soku żołądkowym Przeżywalność szczepów Lactobacillus w sztucznym soku żołądkowym wykazano w oparciu o zmodyfikowaną metodę Pedersen i wsp. (2004). Badane szczepy Lactobacillus fermentum 57A, Lactobacillus plantarum 57B, Lactobacilluss gasseri 57C namnożono w płynnym podłożu MRS. Hodowlę prowadzono w warunkach beztlenowych w 37 C przez 24 godziny. Następnie, przenoszono po 100 µl każdego szczepu o gęstości rzędu j.t.k./1 ml do 10 ml sztucznego soku żołądkowego (7 ml 36% HCL, 3,6 g pepsyny [Difco], 2 g NaCl na 1 l wody destylowanej) o ph 2,5 ustalonym przy pomocy 1N HCL. Określono gęstość wyjściową hodowli poszczególnych szczepów bakterii za pomocą metody seryjnych rozcieńczeń. Następnie, hodowle inkubowano przez 20 minut w warunkach beztlenowych w 37 C, po tym czasie szczepy wysiewano w kolejnych rozcieńczeniach w celu określenia stopnia redukcji badanych populacji bakterii pod wpływem działania sztucznego soku żołądkowego. Wynik podano w tabeli 2. T a b e l a 2 Przeżywalność szczepów Lactobacillus w sztucznym soku żołądkowym z pepsyną Badany szczep Czas wyjściowy Gęstość bakterii podana w j.t.k./1 ml Po 20 min. Inkubacji w sztucznym soku żołądkowym o ph 2,5 L. fermentum 57A 1,3 x x 10 6 L. plantarum 57 B 1,4 x ,1 x 10 6 L. gasseri 57C 2 x x 10 5 Kontrola L. rhamnosus GG 6,9 x ,5 x Oznaczanie oporności szczepów Lactobacillus na sole żółci W celu oznaczenia oporności badanych szczepów Lactobacillus na sole żółci posłużono się metodą Dashkevicz'a i Feighner'a (1989). Metoda ta polegała na dodaniu do agaru MRS [Oxoid] barwnika wskaźnikowego - purpury bromokrezolowej [FOCH] w ilości 0,17 g/l oraz soli żółci [OXGAL firmy Difco], w pięciu kolejnych stężeniach: 1 g/l, 2 g/l, 5 g/l, 10 g/l, 20 g/l. Na tak przygotowane, stałe podłoża MRS posiewano metodą redukcyjną 10 płynnych, uprzednio przygotowanych hodowli badanych szczepów Lactobacillus, które następnie inkubowano w standardowych warunkach beztlenowych przez 48 godz. Po zakończonej inkubacji kolonie szczepów opornych na dane stężenie soli żółci nabierały koloru jasno żółtego, jak również podłoże wzrostowe zmieniało swoje zabarwienie z fioletowego na żółte. Intensywność wzrostu badanych szczepów i zabarwienia podłoża na kolor żółty oceniono w skali półilościowej od - do +++. Wyniki podano w tabeli 3.

6 6 PL B1 T a b e l a 3 Oporność szczepów Lactobacillus na sole żółci w stężeniach: 1, 2, 5, 10, 20 g/l Stężenie soli żółci L. fermentum 57A L. plantarum 57 B L. gasseri 57C Kontrola L. rhamnosus GG 1 g/l g/l g/l g/l g/l Badanie właściwości adherencyjnych szczepów 57A, 57 B, 57C oraz mieszaniny tych szczepów do ludzkiej linii komórek jelitowych CaCo2 Hodowlę tkankową linii CaCo2 prowadzono metodą wielokrotnych pasaży przez okres 20 dni do uzyskania jednolitej warstwy (monolayer). Stosowano podłoże DMEM (Dulbecco Minimal Essential Medium) (Gibco), wzbogacone dodatkiem 10% inaktywowanej, płodowej surowicy cielęcej. Ponadto, podłoże to zawierało 3 mm/ml L-glutaminy oraz antybiotyki: 100 µg/ml -1 streptomycyny i 100 U/ml -1 penicyliny. Hodowle prowadzono w temperaturze 37 C w atmosferze o zwiększonej wilgotności zawierającej 10% CO 2, zmieniając podłoże odżywcze 2 razy w tygodniu. Badane szczepy Lactobacillus (każdy z osobna i później w formie mieszaniny) hodowano przez 48 h w 5 ml bulionu MRS w cieplarce, w temperaturze 37 C, w warunkach beztlenowych, a następnie całość wirowano (2 tys. obrotów przez 10 min). Supernatant odlewano, a bakterie pozostałe na dnie probówki zalewano świeżym MRS w objętości 1 ml i sprawdzono gęstość za pomocą rozcieńczeń dziesiętnych podając wynik w c.f.u./ml. Gęstość wyjściowa dla szczepu 57A wynosiła 8 x 10 7, dla szczepu 57B 2,5 x 10 8, dla szczepu 57 C wynosiła 8 x 10 7, zaś dla mieszaniny wynosiła 2 x Następnie, pobierano 100 µl badanych zawiesin bakterii i dodawano do 900 µl tkankowego podłoża hodowlanego DMEM. Tak przygotowaną mieszaninę dodawano do dołków zawierających komórki linii CaCo2. Komórki linii tkankowej wraz z badanymi szczepami inkubowano w temperaturze 37 C, w atmosferze wzbogaconej 10% CO 2 przez 30 minut. Po inkubacji komórki przemywano dwukrotnie PBS w celu usunięcia nie przyczepionych bakterii, a następnie utrwalano 3,7% formaldehydem w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Po utrwaleniu komórki ponownie przemywano PBS i barwiono fioletem krystalicznym przez 3 minuty. Preparat oceniano mikroskopowo przy powiększeniu 1000 x. Liczono komórki Lactobacillus i Bifidobacterium w 20 polach widzenia preparatu podając średnią z 20 pól. Interpretację wyników przeprowadzono według następującej legendy. Legenda dotycząca określenia stopnia adherencji testowanych bakterii z rodzaju Lactobacillus do tkanki jelitowej - CaCo2 Stopień adherencji +++ Powyżej Zakres Zakres Poniżej 40 Liczba komórek bakteryjnych T a b e l a 4 Zestawienie wyników z adherencji do tkanki CaCo2 bakterii z rodzaju Lactobacillus 57A,57B, 57C i mieszaniny tych szczepów w obecności kontroli GG Szczep Tkanka CaCo2** Lactobacillus fermentum 57A ++ Lactobacillus plantarum 57B - Lactobacillus gasseri 57C + Mieszanina szczepów Lactobacillus 57A, 57B, 57C ++ Kontrola L. rhamnosus GG +++

7 PL B1 7 Badane szczepy L. fermentum 57A, L. plantarum 57B, L. gasseri 57C wykazały dużą oporność zarówno na niskie ph (równe wartości ph występujące w soku żołądkowym), jak i na sztuczny sok żołądkowy zawierający pepsynę - enzym występujący w soku żołądkowym. W przypadku oporności na sole żółci szczepy L. fermentum 51A, L. plantarum 57B wykazują podobną, wysoką oporność na sole żółci w przeciwieństwie do szczepu L. gasseri 57C, który już w stężeniu soli żółci równym 2 g/l traci swoją żywotność. Analizując powyższe wyniki możemy przewidywać, że szczepy L. fermentum 57A, L. plantarum 57B, L. gasseri 57C bez większego wpływu na zmniejszenie się ich populacji przeżywają niesprzyjające warunki panujące w ludzkim żołądku. W przypadku działania soli żółci szczepy L. fermentum 57A, L. plantarum 57B powinny również nie zmienić w sposób istotny swojej populacji, jedynie szczep L. gasseri 57C, wykazujący większość wrażliwość na sole żółci, może zmniejszyć swoją populacje o kilka log. Powyższa analiza świadczy o możliwości zastosowania szczepów L. fermentum 57A, L. plantarum 57B, L. gasseri 57C podanych droga doustna w celu kolonizacji ujścia pochwy i odbytu. Badane szczepy L. fermentum 57A, L. plantarum 57B, L. gasseri 57C wykazały bardzo zróżnicowaną adherencję do linii jelitowe CaCo2. Wydaje się, że jedynie szczep L. fermentum 57A ma szansę zaadherowania do ludzkiego nabłonka jelitowego, zaś pozostałe szczepy nie wykazują takiej zdolności. W oparciu o te wyniki możemy przewidywać, że gęstość Lactobacillus w końcowym odcinku jelita grubego w stosunku do gęstości podanej w formie preparatu doustnego może ulec niewielkiemu spadkowi nie tylko ze względu na działanie soku żołądkowego, ale również ze względu na dobre własności adherencyjne szczepu L. fermentum 57A. II. Uwidocznienie właściwości koagregacji szczepów Lactobacillus wchodzących w skład kompozycji Wyizolowane szczepy Lactobacillus posiadają unikalną cechę wzajemnej koagregacji, dzięki której mogą występować w naturalnym zespole (koagregacie), który jest mieszaniną 2 lub 3 szczepów skupionych razem dzięki oddziaływaniom powierzchniowym. Taki rodzaj powinowactwa pomiędzy naturalnie wyselekcjonowanymi szczepami zasiedlającymi tą samą niszę ekologiczną prowadzi do współdziałania z zakresie zdobywania receptorów na powierzchni nabłonka, antagonizmu wobec innych, często patologicznych składników mikroflory i lepszego wykorzystywania dostępnych źródeł energii. Zjawisko koagregacji uwidoczniono w przykładzie wykonania na rysunki, na którym: Figura 1 przedstawia koagregacje szczepów wchodzących w skład kompozycji. Zdjęcie makroskopowe kolonii wykazujące obecność dwóch różnych morfologicznie składowych pojedynczej kolonii (z lewej L. fermentum, z prawej L. plantarum). Figura 2 przedstawia obraz prążków w rozdziale elektroforetycznym po reakcji PCR (DNA wyizolowane z koagregatu) ze starterem swoistym dla gatunku L. plantarum potwierdzający obecność szczepu L. plantarum 57B w koagregacie przedstawionym na fig. 1. Figura 3 przedstawia obraz prążków w rozdziale elektroforetycznym po reakcji PCR (DNA wyizolowane z koagregatu) ze starterem swoistym dla gatunku L. fermentum potwierdzający obecność szczepu L. fermentum 57A w koagregacie przedstawionym na fig. 1. III. Zdolność do kolonizacji odbytu i pochwy Kompozycja szczepów Lactobacillus posiada w całości unikalną zdolność do kolonizacji zarówno przewodu pokarmowego, jak i pochwy, wynikającą ze zróżnicowania i współdziałania jego poszczególnych składników. Widać to przy badaniu kolonizacji nabłonka odbytu i pochwy in vivo w trakcie badań klinicznych - jedne ze składników zespołu (Lactobacillus fermentum 57A i Lactobacillus plantarum 57B) po doustnym podaniu występują w wyższych liczbach na powierzchni nabłonka odbytu, zaś inne (Lactobacillus gasseri 57C) w wyższych liczbach na nabłonku pochwy. Figura 4 uwidacznia zdjęcie makroskopowe przedstawiające zróżnicowane morfologicznie kolonie reprezentujące populacje Lactobacillus zasiedlające nabłonek odbytu (zdjęcie lewe, dominacja L. plantarum 57B) i pochwy (zdjęcie prawe, dominacja L. gasseri 57C). Próbkę pobrano od kobiety, która przyjmowała kompozycję szczepów Lactobacillus przez 21 dni. Widać zróżnicowane powinowactwo gatunków Lactobacillus do obu miejsc w postaci różnic w liczbach poszczególnych kolonii.

8 8 PL B1 T a b e l a 5 Przykładowy rozkład liczb szczepów Lactobacillus w wymazach z pochwy i odbytu pacjentki stosującej kompozycję według wynalazku Liczba kolonii - pochwa Liczba kolonii - odbyt Lactobacillus gasseri 57C 1 x x 10 3 Lactobacillus plantarum 57B 3 x x 10 5 P r z y k ł a d w y k o n a n i a I. Badanie kliniczne pacjentów Badania kliniczne przeprowadzono w grupie 18 zdrowych kobiet bez klinicznych objawów stanu zapalnego dróg rodnych, ale z historią nawracających stanów zapalnych pochwy. Badania wykazały, ze po doustnym podaniu kompozycji szczepów Lactobacillus według wynalazku występuje: 1. spadek ph pochwy o 0,4, 2. spadek wskaźnika skali Nugenta o 2 jednostki, 3. podwyższenie liczy szczepów Lactobacillus na nabłonku pochwy o dwa logarytmy (log c.f.u/ml). Nr pacjenta T a b e l a 6 Wpływ podawania kompozycji szczepów Lactobacillus na ph pochwy I III-10 IV-20 V-31 VI-50 VII ,5 5,2 5,5 5,5 5,2 5,2 - VIII ,9 4,9 4,9 5,5 4,9 4,9 4, ,9 4,6 4,4 4,2 4,4 4,6 4, ,5 4,6 4,6 4,2 4, ,6 4,6 4,9 4,9 4,6 4,6 4, ,6 4,6 5,2 5,5 5,2 4,6 4, ,5 5,2 5,5 4,9 4,9 4,6 5, ,0 4,2 4,4 4,0 4,2 4,0 5, ,9 5,2 4,6 4,6 4,6 4,9 4, ,2 5,5 4,9 4,9 4,6 4,4 4, ,4 4,9 4,0 4,2 4,2 4,2 4, ,4 4,9 4,6 4,6 4,4 4,2 4, ,9 5,5 4,9 4,9 4,9 4,2 4, ,6 4,6 4,9 4,9 4,6 4,6 4, ,5 5,5 5,2 5,5 4,9 4,9 4, ,5 4,9 4,9 4,9 4,9 4,6 4, ,9 4,6 4,6 4,9 4,9 4, ,5 5,5 4,4 4,9 4,4 4,6 4,6 Średnia ph 5,0 4,9 4,8 4,8 4,6 4,6 4,6 Legenda: - brak wizyty

9 PL B1 9 T a b e l a 7 Wpływ podawania kompozycji szczepów Lactobacillus na wartość wskaźnika skali Nugenta (0-3 normalna flora, 4-6 wynik wątpliwy, 7-10 bakteryjna waginoza) Nr pacjenta I III-10 IV-20 V-31 VI-50 VII J VIII-70 Średnia z Nugenta 2,50 (3) 2,39 (2) 1,8 (2) 1,28 (1) 0,76 (1) 0,69 (1) 1,1 (1) Legenda: - brak wizyty T a b e l a 8 Wpływ podawania kompozycji szczepów Lactobacillus na całkowitą liczbę szczepów Lactobacillus (podanych w c.f.u./ml) kolonizujących nabłonek pochwy Nr pacjenta I c.f.u/ml III- 10 c.f.u/ml IV- 20 c.f.u/ml V- 31 c.f.u/ml VI- 50 c.f.u/ml VII- 62 c.f.u/ml VIII- 70 c.f.u/ml x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x 10 4

10 10 PL B1 cd tabeli x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x 10 6 Średnia całkowitej liczby Lactobacillus Legenda: - brak wizyty 1 x x x x x x x 10 4 P r z y k ł a d w y k o n a n i a II (preparat farmaceutyczny) Jedna kapsułka preparatu farmaceutycznego zawiera: substancja aktywna 10 9 liofilizowanych szczepów Lactobacillus w następujących proporcjach: 50% Lactobacillus gasseri 57C, 25% Lactobacillus fermentum 57A, 25% Lactobacillus plantarum 57B, substancje dodatkowe: laktoza, mannitol, glutamian sodu, stearynian magnezu. Preparat stosowany jest doustnie 1 2 kapsułki dziennie popijając wodą. Preparat farmaceutyczny stosuje się wspomagająco w celu przywrócenia i/lub uzupełnienia prawidłowej flory bakteryjnej układu moczowo-płciowego oraz utrzymania właściwego ph pochwy. Zastrzeżenia patentowe 1. Zastosowanie kompozycji nowych szczepów z rodzaju Lactobacillus zawierającej Lactobacillus fermentum 57A, Lactobacillus plantarum 57B i Lactobacillus gasseri 57C wyróżniających się szczególnymi właściwościami, którymi są: właściwość silnego zróżnicowania powinowactwa do nabłonka przewodu pokarmowego i nabłonka pochwy umożliwiająca kolonizację pochwy i ujścia odbytu po przejściu przez jelita i właściwość koagregacji umożliwiająca synergiczne działanie do wytwarzania preparatu farmaceutycznego do stosowania doustnego w celu przywracania właściwej flory bakteryjnej pochwy i odbytu. 2. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że polega na przygotowaniu porcji preparatu farmaceutycznego składającego się z liofilizowanych szczepów bakterii Lactobacillus fermentum 57A, Lactobacillus plantarum 578 i Lactobacillus gasseri 57C i farmaceutycznie dopuszczalnego nośnika i/lub substancji dodatkowych zamkniętych w kapsułce.

11 PL B1 11 Rysunki

12 12 PL B1 Departament Wydawnictw UP RP Cena 4,92 zł (w tym 23% VAT)