Waleria Hryniewicz, Agnieszka Sulikowska, Katarzyna Szczypa, Jolanta Krzysztoń-Russjan, Marek Gniadkowski

Transkrypt

1 Rekomendacje doboru testów do oznaczania wrażliwości bakterii na antybiotyki i chemioterapeutyki Recommendations for susceptibility testing to antimicrobial agents of selected bacterial species. Waleria Hryniewicz, Agnieszka Sulikowska, Katarzyna Szczypa, Jolanta KrzysztońRussjan, Marek Gniadkowski Krajowy Ośrodek Referencyjny, d/s Lekowrażliwości Drobnoustrojów Centralne Laboratorium Surowic i Szczepionek w Warszawie Warszawa, ul. Chełmska 30/34, tel.: ; fax/tel.: Streszczenie Oznaczanie lekowrażliwości jest jednym z najważniejszych etapów diagnostyki mikrobiologicznej. Szerokie stosowanie antybiotyków pociąga za sobą ciągły wzrost oporności na leki wśród wielu klinicznie ważnych drobnoustrojów, a także pojawianie się nowych mechanizmów oporności. W związku z tym mikrobiolog jest zobowiązany nie tylko do ich prawidłowego określenia, ale także do ich klinicznej interpretacji. Dlatego, mamy nadzieję, że przedstawione zalecenia pomogą we właściwym wykonywaniu antybiogramów i interpretacji uzyskanego wyniku lekowrażliwości. Summary Susceptibility testing is one of the most important steps in microbiological diagnostics. The widespread use of antimicrobial agents has resulted in the dramatic increase of resistance in many pathogens towards various groups of drugs and in the emergence of new resistance mechanisms.. In this situation microbiologist is obliged not only to perform correctly susceptibility testing but also to be able to provide clinical interpretation of underlying mechanisms of resistance. Thus we hope that the recommendations will help in proper performance and interpretation of the susceptibility testing. 1

2 Wstęp Jednym z najważniejszych etapów rutynowej diagnostyki mikrobiologicznej zakażeń bakteryjnych jest oznaczanie wrażliwości na leki. W chwili obecnej stosuje się wiele różnych metod identyfikacji oporności, od prostych testów fenotypowych do bardziej skomplikowanych metod, wykorzystujących techniki biologii molekularnej. Prawidłowy schemat oznaczania wrażliwości coraz częściej wymaga łączenia kilku metod w celu dokładnej identyfikacji mechanizmu odpowiedzialnego za oporność. Niniejsze opracowanie omawia zasady doboru testów w rutynowej diagnostyce mikrobiologicznej. Podstawową i nadal powszechnie stosowaną w oznaczaniu wrażliwości jest opracowana na początku lat sześćdziesiątych metoda dyfuzji antybiotyku z krążka w żelu agarowym [2]. Obecnie, wszystkie istniejące w innych krajach normy oznaczania wrażliwości na leki są pochodnymi tej techniki, z powodzeniem stosowanej od blisko czterdziestu lat [1,4,12,15]. Mimo swej prostoty wymaga ona od mikrobiologa precyzji wykonania i ciągłej kontroli jakości na każdym etapie postępowania. Coraz częściej przyjmuje się jednak, że w przypadku identyfikacji mechanizmów oporności szczególnie groźnych z punktu widzenia terapeutycznego bądź epidemiologicznego, niezbędne jest także rutynowe stosowanie metod przeglądowych [3,12,15], oznaczanie najmniejszego stężenia hamującego leku [12] lub wręcz identyfikacja genu warunkującego oporność [3]. Nie wolno również zapominać, że w przewidywaniu i weryfikowaniu wyniku niezbędna jest identyfikacja gatunku badanego drobnoustroju. Ramy niniejszego opracowania nie pozwalają na zamieszczenie pełnego komentarza, dotyczącego kryteriów wyboru testów. Bezwzględnie jednak należy przyjąć, że zakres badanych leków powinien być indywidualnie dobierany w zależności od stanu chorego, miejsca, w którym toczy się zakażenie oraz drobnoustroju je wywołującego. Konieczna jest również ciągła wewnątrzlaboratoryjna kontrola jakości wykonywanych oznaczeń, regularnie weryfikowana w zewnętrznych sprawdzianach, np. POLMICRO [8]. Należy również pamiętać, że przedstawione tutaj zasady doboru antybiotyków/chemioterapeutyków do oznaczania wrażliwości drobnoustrojów na leki mają służyć jako podstawa wyboru właściwego celowanego postępowania terapeutycznego. Zasady te stale są uaktualniane, co odzwierciedla zarówno pojawiające się nowe mechanizmy oporności jak i zmieniające się w związku z tym kryteria interpretacji klinicznej [8]. Należy pamiętać, że mikrobiolog udziela konsultacji medycznej, a szczególnie ważnym elementem jego pracy jest umiejętność interpretacji wyniku badania mikrobiologicznego. 2

3 Niniejsze rekomendacje opracowano w Krajowym Ośrodku Referencyjnym d/s Lekowrażliwości Drobnoustrojów powołanym decyzją Ministra Zdrowia i Opieki Społecznej w 1997 r. (Pismo nr.pnn0180ep/96 z dnia r.). Głównym celem powołania Ośrodka jest stała współpraca i konsultacja z wszystkimi placówkami zajmującymi się diagnostyką mikrobiologiczną w kraju. Wszystkie szczepy, u których zidentyfikowano nowe, nie opisywane dotychczas na świecie lub/i w Polsce oraz bardzo rzadkie fenotypy oporności (np. oporne na glikopeptydy enterokoki, gronkowce o obniżonej wrażliwości na leki tej grupy, oporne na karbapenemy pałeczki z rodziny Enterobacteriaceae itd.), lub sprawiające trudności diagnostyczne powinny być przesyłane do Ośrodka, który dysponuje możliwością wykonania badań potwierdzających takich jak oznaczanie najmniejszego stężenia antybiotyku hamującego wzrost drobnoustroju (ang. minimal inhibitory concentrationmic), wykrywanie genów oporności. Ośrodek poddaje się zewnętrznej kontroli jakości prowadzonej przez Center for Diseases Control (CDC) w Atlancie i Światową Organizację Zdrowia (WHO), stale współpracując z tymi organizacjami i uczestniczy w organizowaniu Krajowych Zewnętrznych Sprawdzianów Wiarygodności Badań Mikrobiologicznych (POLMICRO) [8]. Podstawą metodyczną niniejszych rekomendacji w zakresie wykonania, interpretacji i standaryzacji oznaczania lekowrażliwości jest norma National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS) [12,14] uzupełniona w niektórych przypadkach o zalecenia Towarzystw Naukowych, dane z publikacji i doświadczenia własne. Wykaz użytych skrótów znajduje się na końcu opracowania. W celu lepszego zrozumienia zagadnień dotyczących oznaczania lekowrażliwości drobnoustrojów zamieszczono w niniejszym opracowaniu podstawowe definicje terminów powszechnie używanych w mikrobiologii i farmakologii odnoszących się do zagadnień lekowrażliwości [6]. Antybiotyk substancja o aktywności przeciwdrobnoustrojowej, wytwarzana przez mikroorganizmy (bakterie, grzyby) lub uzyskana na drodze półsyntetycznej bądź syntetycznej, lecz mająca naturalny wzorzec Chemioterapeutyk substancja o aktywności przeciwdrobnoustrojowej, uzyskana na drodze syntezy chemicznej, nie posiadająca naturalnego wzorca Kontrola jakości (ang. quality control QC) jest złożonym procesem mającym na celu wykrywanie i korygowanie błędów pojawiających się w procesie diagnostycznym. Prawidłowo przeprowadzany program kontroli jakości gwarantuje, że wyniki badań wydawane przez laboratorium są dokładne, wiarygodne oraz powtarzalne. W programie tym oceniana jest jakość pobranego i dostarczonego do laboratorium materiału, metodologia testów diagnostycznych, podłoża, odczynniki, narzędzia oraz praca personelu laboratoryjnego i umiejętność interpretacji 3

4 wyniku badania. Bardzo istotne jest również prawidłowe prowadzenie dokumentacji laboratoryjnej. Wrażliwość termin ten jest używany w dwóch znaczeniach mikrobiologicznym i klinicznym Wrażliwość mikrobiologiczna oznacza, że dany szczep należy do najbardziej wrażliwej populacji i nie posiada mechanizmów oporności. Wrażliwość kliniczna oznacza wrażliwość drobnoustroju na standardowe dawki leku. Niektórzy autorzy oddzielają w pełni wrażliwe drobnoustroje od granicznie wrażliwych, które pomimo posiadania oporności niskiego stopnia, zwykle są wrażliwe na standardowe dawki terapeutyczne. Istnieje wiele czynników, modulujących odpowiedź drobnoustroju na leczenie, w związku z tym trudno jest czasem przewidzieć efekt kliniczny. Dlatego też definicja oparta jest na ocenie wrażliwości in vitro na dany antybiotyk, jego właściwościach farmakokinetycznych i farmakodynamicznych, a zwłaszcza na określeniu możliwego do osiągnięcia stężenia antybiotyku w miejscu zakażenia (praktycznie bierze się pod uwagę stężenie możliwe do osiągnięcia w surowicy krwi). Kategorie wrażliwości, według których interpretujemy wynik oznaczania lekowrażliwości są oparte na skuteczności klinicznej. Średnia wrażliwość bakterie są klasyfikowane jako, średniowrażliwe jeśli należą do grupy szczepów, które znajdują się pomiędzy klinicznie wrażliwymi i klinicznie opornymi. Sukces kliniczny w takich zakażeniach jest trudny do przewidzenia, ale może być osiągnięty, jeśli zastosujemy antybiotyk w wyższej dawce, zwiększymy częstotliwość podawania leku lub, jeśli antybiotyk ulega zagęszczeniu w miejscu zakażenia osiągając wysokie stężenia (np. w układzie moczowym). Wrażliwość w tym przypadku powinna być potwierdzona oznaczeniem MIC. Oporność termin ten jest używany w trzech znaczeniach: mikrobiologicznym, farmakologicznym i klinicznym. Oporność mikrobiologiczna oznacza, że dany szczep posiada mechanizm oporności. Może być to oporność niskiego lub wysokiego stopnia. Oporność farmakologiczna bakterie są oporne w sensie farmakologicznym, jeśli mogą przeżyć w obecności antybiotyku w stężeniu wyższym niż jest możliwy do osiągnięcia in vivo. Oporność kliniczna oznacza, że sukces terapeutyczny jest niemożliwy do osiągnięcia pomimo zastosowania maksymalnych dawek antybiotyku. Oporność krzyżowa oznacza niewrażliwość na wszystkie lub niektóre antybiotyki należące do tej samej grupy chemicznej (np. antybiotyki βlaktamowe, aminoglikozydy, makrolidy) lub czasem niespokrewnionej grupy chemicznej, gdy miejsca uchwytu dla antybiotyków znajdują się blisko siebie (np. oporność na makrolidy i linkozamidy). Mechanizmy oporności wynikające z braku przepuszczalności błony komórkowej lub aktywnego wypompowywania leku z komórki 4

5 mogą powodować oporność na więcej niż jedną grupę chemiczną, zjawisko to jest niekiedy określane jako oporność skojarzona. MIC (ang. minimal inhibitory concentration) określa najmniejsze stężenie leku, wyrażone w mg/l, określone w warunkach in vitro, hamujące wzrost bakterii przy określonej gęstości inokulum i w określonym czasie. MBC (ang. minimal bactericidal concentration) określa minimalne stężenie leku, wyrażone w mg/l, oznaczone w warunkach in vitro, przy którym ginie 99,9% komórek bakteryjnych, przy określonej gęstości inokulum i w określonym czasie. Tolerancja jest wynikiem braku aktywacji enzymów autolitycznych przez antybiotyk β laktamowy, który wykazuje spadek lub brak działania bakteriobójczego bez utraty działania hamującego (nie zmienia się wartość MIC). Przyjęta definicja tolerancji oznacza stosunek MBC/MIC 32 lub więcej. Oporność naturalna stała cecha gatunku, rodzaju, rodziny (itd.) drobnoustrojów. Naturalna oporność wynika z: 1. braku w komórce bakteryjnej celu ( receptora ) dla danego antybiotyku lub niskiego powinowactwa do niego (antybiotyki βlaktamowe Mycoplasma pneumoniae, Chlamydia pneumoniae; cefalosporyny i penicyliny izoksazolilowe Enterococcus spp.) 2. braku lub niskiej penetracji/transportu antybiotyku przez ścianę komórkową (makrolidy, glikopeptydy Enterobacteriaceae; aminoglikozydy Enterococcus spp., Streptococcus spp.) 3. wytwarzania enzymu inaktywującego antybiotyk (karbapenemy karbapenemaza zależna od jonów cynku u Stenotrophomonas maltophilia) Oporność nabyta nowa cecha szczepu wynikająca ze zmian materiału genetycznego. Metody określania wrażliwości: Dyfuzja z krążka w agarze dyfuzja antybiotyku z krążka bibułowego na podłożu stałym, na które naniesiono zawiesinę bakteryjną o określonej gęstości. Miarą wrażliwości badanego szczepu jest wielkość średnicy strefy zahamowania wzrostu wokół krążka nasyconego antybiotykiem, która często, ale nie zawsze koreluje z wartością MIC. Metoda rozcieńczeń w bulionie wykonywana w probówkach (metoda makrorozcieńczeń minimalna objętość bulionu wynosi 2ml) lub płytkach titracyjnych (metoda mikrorozcieńczeń objętość bulionu w każdej studzience wynosi 100µl). Metoda makrorozcieńczeń jest stosowana tam gdzie pojawia się potrzeba wykonania oznaczenia dla pojedynczego szczepu. Buliony zawierające antybiotyk o znanych malejących stężeniach (zazwyczaj stosuje się podwójne rozcieńczenia) są zaszczepione określoną liczbą komórek bakteryjnych. Odczyt polega na 5

6 obserwacji zmętnienia podłoża po określonym czasie. Celem tej metody jest określenie najmniejszego stężenia hamującego (MIC) lub najmniejszego stężenia bakteriobójczego (MBC). Metoda rozcieńczeń w agarze w metodzie tej antybiotyk jest obecny w podłożu agarowym w malejących stężeniach (jedno stężenie na jedną płytkę z agarem), na które posiewana jest zawiesina bakteryjna o określonym inokulum. Celem badania jest określenie najmniejszego stężenia hamującego (MIC). Określanie wartości MIC za pomocą Etestów polega na dyfuzji antybiotyku z plastikowego paska ze stopniowo zmieniającymi się stężeniami (gradient). Badanie przeprowadza się na podłożu stałym, na które naniesiono zawiesinę bakteryjną o określonej gęstości. Inokulum liczba komórek bakteryjnych w podłożu płynnym, wyrażana jako liczba jednostek tworzących kolonię na mililitr (ang. colonyforming unit per millilitre CFU/ml). Może być również określane jako zmętnienie lub gęstość optyczna zawiesiny bakteryjnej. Stężenie graniczne (ang. breakpoint) określona wartość MIC lub określona wielkość strefy zahamowania wzrostu będąca podstawą do zakwalifikowania danego szczepu do jednej z trzech kategorii klinicznych: wrażliwy, średniowrażliwy lub oporny. Aby dokładnie określić stężenie graniczne używamy znaków: < oznacza mniej niż, oznacza mniejszy lub równy, > oznacza większy niż, oznacza większy lub równy. Spektrum termin określający zakres aktywności antybiotyku wobec jednego bądź większej liczby gatunków bakterii (np. Gramdodatnie, Gramujemne, tlenowe, względnie beztlenowe, bezwzględnie beztlenowe). Nabycie przez drobnoustrój mechanizmu oporności może zmienić wzór jego wrażliwości na dany antybiotyk, a niekiedy także na inne i w związku z tym zmienić zakres aktywności (spektrum) antybiotyku. Ponadto w tekście użyte są pojęcia: Antybiogram podstawowy zawiera antybiotyki stosowane jako leki pierwszego rzutu Antybiogram podstawowy dla szczepów z moczu zawiera antybiotyki stosowane jako leki pierwszego rzutu wobec szczepów izolowanych z zakażeń układu moczowego. Antybiogram rozszerzony zawiera rozszerzoną listę antybiotyków stosowanych wobec drobnoustrojów (również dla szczepów z zakażeń układu moczowego) wieloopornych i/lub izolowanych z ciężkich zakażeń. 6

7 1. Oznaczanie wrażliwości szczepów z rodzaju Staphylococcus spp Badanie należy wykonywać na podłożu MHA, inkubować 1618 godzin, w temperaturze 35 o C, w warunkach tlenowych. Dla oksacyliny, meticyliny i wankomycyny inkubację prowadzić pełne 24 godziny Oznaczanie wrażliwości na antybiotyki βlaktamowe. Zawsze należy oznaczać oporność na meticylinę, bowiem szczepy MRSA izoluje się z narastającą częstością z zakażeń pozaszpitalnych. Stosujemy w tym celu jedną z niżej wymienionych metod: Metoda dyfuzyjnokrążkowa. Oznaczając wrażliwość metodą dyfuzyjną dla Staphylococcus spp. antybiogram inkubuje się 24 godziny, na podłożu MHA, w temperaturze 35 o C [14]. Inokulum 0,5 McFarlanda należy przygotować z czystej 1824h hodowli na płytce agarowej z krwią. Odczyt przeprowadzać w świetle przechodzącym, należy zwrócić uwagę na obecność mikrokolonii w strefie zahamowania wzrostu mogących świadczyć o oporności badanego szczepu, lub zanieczyszczeniu szczepem opornym. UWAGA! W identyfikacji szczepów Staphylococcus aureus należy pamiętać, że istnieją szczepy Staphylococcus aureus nie posiadające clumping factor (CFujemne) a wytwarzające koagulazę wolną z opóźnieniem. 7

8 Kryteria klasyfikacji szczepów gronkowcowych na podstawie wyników oznaczania wrażliwości na meticylinę. krążek z antybiotykiem 1 oporny MRSA Staphylococcus aureus (SA) średnio wrażliwy 2 wrażliwy MSSA Staphylococcus spp. (koagulazoujemne) (CNS) 3 oporny MRCNS wrażliwy MSCNS 1 oksacylina 1 µg [15] meticylina 5 µg [15] nie stosować nie stosować nie należy stosować krążków z innymi penicylinami półsyntetycznymi niż oksacylina i meticylina do oznaczania wrażliwości na meticylinę; w żadnym wypadku nie stosować krążka z kloksacyliną. Użycie krążka z oksacyliną jest najwłaściwsze, ponieważ oksacylina jest mniej podatna na degradację przez βlaktamazy. 2 w przypadku otrzymania wyniku średniowrażliwy dla S. aureus należy wykonać oznaczenie metodą przeglądową, lub stwierdzić obecność genu meca metodą PCR. 3 Nie zaleca się testowania wrażliwości na oksacylinę szczepów Staphylococcus. saprophyticus, ponieważ nawet szczepy nie posiadające genu meca (genu warunkującego oporność na meticylinę) w badaniu in vitro mogą być oporne. Rutynowe oznaczanie wrażliwości szczepów S. saprophyticus izolowanych z moczu nie jest zalecane, ze względu na wysoką koncentrację w moczu leków przeciwbakteryjnych, powszechnie używanych w leczeniu ostrego, niepowikłanego zapalenia pęcherza moczowego (np. trimetoprim, kotrimoksazol, fluorochinolony) Metoda przeglądowa z oksacyliną dla S. aureus (nie zaleca się stosowania tej metody dla gronkowców koagulazoujemnych) Na podłoże MHA z oksacyliną w stężeniu 6 mg/l i dodatkiem 4% NaCl posiać wymazówką zawiesinę o gęstości 0.5 McFarlanda lub nanieść pipetą 50 µl jej stukrotnego rozcieńczenia [12]. Inkubować 24 godziny w temp. 35 o C. Odczytywać w świetle przechodzącym, wzrost świadczy o oporności na meticylinę Metody komercyjne, na przykład: A.Test ATB OXA lub ATB STAPH (biomerieux) z użyciem podłoża ATB Na Medium stosować zgodnie z instrukcją producenta [19]. B.Test Cristal MRSA ID (Becton Dickinson) stosować zgodnie z instrukcją producenta [9,18]. 8

9 C. Etest (AB BIODISK). Stosować zgodnie z instrukcja producenta [5]. Testy oparte o wykrywanie białka PBP2 (2a), nowego białka, produktu genu meca, warunkującego oporność na meticylinę [16]: A. MRSAScreen Denka Seiken (Innogenetics) B. Slidex MRSA Detection (biomerieux) C. Oxoid PBP2 DR900M (Oxoid) 1.3. Metoda przeglądowa z wankomycyną dla S. aureus Z całonocnej hodowli na podłożu agar z krwią baranią przygotować zawiesinę o gęstości 0,5 McFarlanda, nanieść punktowo 10 µl zawiesiny na podłoże BHIA z wankomycyną o stężeniu 6 mg/l (wg Krajowego Ośrodka Referencyjnego ds. Lekowrażliwości Drobnoustrojów zaleca się użycie wankomycyny w stężeniu 4 mg/l), inkubować pełne 24 godziny w temp C (jeśli wynik jest ujemny inkubację przedłużyć do 48 godzin) i oceniać w świetle przechodzącym [12] Metoda przeglądowa z wankomycyną dla S. aureus wg Hiramatsu [17] Założyć hodowlę bulionową w podłożu BHI broth, doprowadzić do optycznej gęstości OD = 0.3 przy długości fali 578 nm (10 8 CFU/ml), rozcieńczyć 10krotnie (10 7 CFU/ml), następnie 100 µl tej zawiesiny nanieść i rozprowadzić równomiernie na płytkę BHIA z zawartością 4 mg/l wankomycyny. Inkubować w 37 C przez 24 h, a w przypadku braku wzrostu inkubację przedłużyć do 48 h. Izolaty wrażliwe na wankomycynę nie wykazują wzrostu po 48h hodowli. W przypadku wzrostu drobnoustroju na w/w podłożach szczep taki należy przesłać do laboratorium referencyjnego celem przeprowadzenia dokładnych badań ilościowych. 1.4.Szczepy wzorcowe: Do metody krążkowej: Staphylococcus aureus ATCC wrażliwy na meticylinę Escherichia coli ATCC służy do kontroli jakości antybiotyków βlaktamowych w połączeniach z inhibitorami βlaktamaz (kwas klawulanowy, sulbaktam, tazobaktam) Do metody przeglądowej z oksacyliną w podłożu: Staphylococcus aureus ATCC wrażliwy na meticylinę Staphylococcus aureus ATCC oporny na meticylinę lub 9

10 Staphylococcus aureus MR3 z kolekcji Krajowego Ośrodka Referencyjnego ds Lekowrażliwości Drobnoustrojów szczep o heterogennej ekspresji oporności na meticylinę Do metody przeglądowej z wankomycyną w podłożu: Staphylococcus aureus ATCC (Mu3) Staphylococcus aureus ATCC (Mu50) ANTYBIOGRAM PODSTAWOWY oksacylina 1 µg erytromycyna 15 µg linkomycyna 15 µg lub klindamycyna 2 µg Oznaczenie wrażliwości na meticylinę. Wynik oznaczania wrażliwości na erytromycynę jest reprezentatywny dla roksytromycyny, klarytromycyny, azytromycyny i dirytromycyny. Krążek z linkozamidem należy układać obok krążka z erytromycyną w celu identyfikacji indukowalnej oporności na makrolidy, linkozamidy i streptograminy w mechanizmie MLS B ; Z doświadczenia Ośrodka Referencyjnego wynika, że linkomycyna jest bardziej przydatna do wykrywania tego typu oporności. Kryteria dla linkomycyny: oporność przy strefie < 16 mm, wrażliwość > 21mm[16]. UWAGA!W związku z wysokim procentem szczepów gronkowców, wytwarzających penicylinazy (ponad 90 % szczepów szpitalnych), można pominąć rutynowe oznaczanie wrażliwości na penicylinę. W przypadku oznaczania wytwarzania penicylinaz należy stosować krążek z nitrocefiną (test cefinazowy) lub oznaczać oporność na penicylinę metodą dyfuzyjną krążkiem z penicyliną 10 IU. SZCZEPY OPORNE NA METICYLINĘ (MRSA i MRCNS) SĄ OPORNE IN VIVO NA WSZYSTKIE ANTYBIOTYKI βlaktamowe, tj. PENICYLINY, PENICYLINY SKOJARZONE Z INHIBITORAMI βlaktamaz, CEFALOSPORYNY I KARBAPENEMY. Oporność na meticylinę jest terminem najczęściej używanym, w piśmiennictwie mogą być użyte także określenia: oporność na oksacylinę lub szczepy oporne na oksacylinę (ORSA, ORCNS). Pojęcia te są równoważne. Szczepy homogennie oporne na meticylinę są zwykle wielooporne (i mogą być oporne na tetracykliny, aminoglikozydy, makrolidy, często też na linkosamidy, chloramfenikol, kotrimoksazol i fluorochinolony) [9]. Należy jednak pamiętać, że na podstawie typu ekspresji oporności (heterogenna vs homogenna) nie można wnioskować na temat wrażliwości szczepu. 10

11 ANTYBIOGRAM PODSTAWOWY DLA SZCZEPÓW IZOLOWANYCH Z MOCZU oksacylina 1 µg ofloksacyna 5 µg lub norfloksacyna 10 µg nitrofurantoina 300 µg Oznaczanie wrażliwości na meticylinę j.w. Stosowanie fluorochinolonów nie jest zalecane u pacjentów poniżej 16 roku życia. Nieaktywna wobec S. saprophyticus i S. epidermidis. trimetoprim/sulfametoksazol 1,25/23,75 µg (kotrimoksazol) trimetoprim 5 µg 11

12 ANTYBIOGRAM ROZSZERZONY wankomycyna 30 µg teikoplanina 30 µg tetracyklina 30 µg chloramfenikol 30 µg ciprofloksacyna 5 µg lub ofloksacyna 5 µg rifampicyna 5 µg gentamicyna 10 µg Antybiotyk z wyboru w leczeniu zakażeń wywołanych przez MRSA. W związku z doniesieniami o średniowrażliwych i opornych na wankomycynę S. aureus (VISA, VRSA) zalecane jest oznaczanie wrażliwości na wankomycynę metodą przeglądową lub za pomocą Etestu (ściśle wg zaleceń producenta). Szczepy mające MIC dla wankomycyny. 4 mg/l należy przesłać do laboratorium referencyjnego. Może być mniej aktywna od wankomycyny wobec niektórych szczepów gronkowców, zwłaszcza koagulazoujemnych; S. haemolyticus ma naturalnie obniżoną wrażliwość na teikoplaninę. Wrażliwość na tetracyklinę jest reprezentatywna dla wszystkich leków z tej grupy. Doksycyklina i minocyklina mogą być nastawiane, ponieważ istnieją szczepy oporne na tetracyklinę, a wrażliwe na doksycyklinę i zwłaszcza na minocyklinę. Minocyklina nie jest zarejestrowana w Polsce. Nie zaleca się stosowania tetracyklin u dzieci poniżej 12 r.ż. Stosować wyjątkowo (ze względu na ciężkie działania niepożądane anemia aplastyczna) wobec szczepów izolowanych z płynu mózgowordzeniowego lub niewrażliwych na wszystkie inne antybiotyki. Można oznaczać w przypadku zakażeń, w których prowadzi się leczenie miejscowe, np. z oka i z worka spojówkowego, gdy brak innych możliwości terapeutycznych. Należy pamiętać o szybkim narastaniu oporności na fluorochinolony u gronkowców, nie stosować w monoterapii. Nie zaleca się stosowania fluorochinolonów u dzieci poniżej 16 r.ż. Stosować wyjątkowo, wyłącznie w ciężkich zakażeniach wobec szczepów wieloopornych; nie stosować w monoterapii. Wynik badania jest reprezentatywny dla wszystkich aminoglikozydów; badać zwłaszcza szczepy izolowane z krwi; leków z tej grupy nie stosować w monoterapii, najlepiej kojarzyć z antybiotykami βlaktamowymi lub glikopeptydami. trimetoprim/sulfametoksazol 1,25/23,75 µg mupirocyna 200 µg Służy do likwidacji nosicielstwa MRSA w nosie (preparat na bazie parafiny), należy ograniczyć stosowanie w szpitalach we wskazaniach dermatologicznych (preparat na bazie glikolu polietylenowego) ze względu na zidentyfikowanie w Polsce epidemicznego, szpitalnego szczepu MRSA o wysokiej oporności na mupirocynę. Strefa zahamowania wzrostu <10 mm świadczy o wysokiej oporności. kwas fusydowy 10 µg Za oporne uważać izolaty o strefie zahamowania < 14 mm, za wrażliwe >22 mm [16]. chinupristyna/dalfopristyna 15 µg linezolid 30 µg Preparat Synercid jest już zarejestrowany w Polsce, może być zastosowany do leczenia zakażeń o etiologii VISA, VRSA. W przypadku szczepu opornego na makrolidy w mechanizmie MLS B. Synercid nie wykazuje działania bakteriobójczego. Preparat Zyvox jest dostępny w imporcie docelowym, może być zastosowany do leczenia zakażeń o etiologii VISA, VRSA. 12

13 2. Oznaczanie wrażliwości Enterococcus spp Badanie należy wykonywać na podłożu MHA, inkubować godzin, w temperaturze 35 o C, w warunkach tlenowych. Inkubację dla wankomycyny należy prowadzić 24 godziny Szczepy wzorcowe: Do metody krążkowej: Staphylococcus aureus ATCC Do metody przeglądowej: Enterococcus faecalis ATCC szczep wrażliwy na aminoglikozydy i wankomycynę, Do kontroli jakości oznaczania oporności na wysokie stężenia aminoglikozydów. Służy także do kontroli zawartości w podłożu tyminy i tymidyny, przy prawidłowej zawartości strefa wokół krążka z kotrimoksazolem 20 mm. Enterococcus faecalis ATCC szczep oporny na aminoglikozydy i wankomycynę, służy do kontroli jakości podłoży stosowanych do oznaczania oporności na wankomycynę i wysokiej oporności na aminoglikozydy w metodzie przeglądowej. 13

14 ANTYBIOGRAM PODSTAWOWY penicylina 10 IU 1 i ampicylina 10 µg 2 gentamicyna 120 µg streptomycyna 300 µg 1 oznacza również wrażliwość na aminopenicyliny (ampicylina, amoksycylina) i ureidopenicyliny (piperacylina) oraz na odpowiednie preparaty z inhibitorami β laktamaz, 2 oznacza również wrażliwość dla wszystkich aminopenicylin i odpowiednich preparatów skojarzonych z inhibitorami βlaktamaz Preparaty skojarzone z inhibitorami stosować tylko w zakażeniach wywołanych florą mieszaną. Z klinicznego punktu widzenia istotne jest oznaczanie jedynie tzw. wysokiej oporności na aminoglikozydy (HLAR). Wrażliwość na gentamycynę i streptomycynę oznacza możliwość leczenia skojarzonego z aminopenicylinami, ureidopenicylinami (oraz odpowiednimi preparatami z inhibitorami βlaktamaz) lub z glikopeptydami. W przypadku oporności na wysokie stężenia gentamycyny, a przy wrażliwości na wysokie stężenia streptomycyny, można stosować streptomycynę w terapii skojarzonej z w/w antybiotykami βlaktamowymi i glikopeptydami. Interpretacja wyników oznaczania HLAR metodą dyfuzyjną: strefa > 10 mm szczep bez HLAR, brak strefy zahamowania wzrostu szczep HLAR; strefa < 9 mm wynik niejednoznaczny badanie należy powtórzyć metodą przeglądową na podłożu BHI agar z gentamycyną w stężeniu 500 mg/l lub/i streptomycyną 2000 mg/l. wankomycyna 30 µg Konieczne jest, aby inkubację prowadzić pełne 24 godziny a odczyty dokonywać w świetle przechodzącym; wzrost mgławicowy lub obecność kolonii w strefie zahamowania wzrostu uznajemy za oporność. Zalecane jest oznaczanie wrażliwości szczepów enterokokowych metodą przeglądową na podłożu BHI agar z wankomycyną w stężeniu 6 mg/l, w temp 35 o C; posiewać inokulum 0,5 Mc Farlanda; inkubację prowadzić 24 godziny, (jeśli wynik jest ujemny inkubację przedłużyć do 48 godzin); w metodzie dyfuzyjnej dokładnie sprawdzić obecność mikrokolonii w strefie zahamowania wzrostu, świadczące o oporności szczepu (oglądać w świetle przechodzącym). teikoplanina 30 µg UWAGA! Należy pamiętać, aby nie oznaczać wrażliwości dla szczepów Enterococcus spp. na cefalosporyny, klindamycynę i kotrimoksazol ponieważ enterokoki posiadają naturalną oporność na te leki. Informacje te można umieszczać pod wynikiem antybiogramu. 14

15 ATYBIOGRAM PODSTAWOWY DLA SZCZEPÓW IZOLOWANYCH Z MOCZU penicylina 10 IU 1 i ampicylina 10µg 2 1 oznacza również wrażliwość na aminopenicyliny (ampicylina, amoksycylina) i ureidopenicyliny (piperacylina) oraz na odpowiednie preparaty z inhibitorami βlaktamaz. 2 oznacza również wrażliwość dla wszystkich aminopenicylin. i odpowiednich preparatów skojarzonych z inhibitorami βlaktamaz. Preparaty skojarzone z inhibitorami stosować tylko w zakażeniach wywołanych florą mieszaną. Można stosować ampicylinę (amoksycylinę) w monoterapii w leczeniu zakażeń układu moczowego o etiologii E. faecalis, ponieważ gatunek ten jest powszechnie wrażliwy na ten antybiotyk. Większość szczepów E. faecium jest opornych na ampicylinę [10]. nitrofurantoina 300 µg tetracyklina 30 µg ciprofloksacyna 5 µg lub. Wrażliwość na tetracyklinę jest reprezentatywna dla wszystkich leków z tej grupy. Doksycyklina i minocyklina mogą być nastawiane, ponieważ istnieją szczepy oporne na tetracyklinę, a wrażliwe na doksycyklinę i minocyklinę. Nie zaleca się stosowania u dzieci poniżej 12 r.ż. Minocyklina nie jest zarejestrowana w Polsce. Nie zaleca się stosowania fluorochinolonów u dzieci poniżej 16 r.ż. norfloksacyna 10 µg trometamol fosfomycyny Preparat przeznaczony do leczenia ostrego zapalenia pęcherza (cystitis). W 200 µg 3 zakażeniach wywołanych przez enterokoki stosować tylko wobec E. faecalis. 3 krążek z fofsomycyną 200µg zawiera 50µg glukozo6fosforanu; w przypadku oznaczania MIC fosfomycymy metodą rozcieńczeń w agarze do podłoża należy dodać 25mg/l glukozo6fosforanu. Nie oznaczać MIC metodami rozcieńczeń w bulionie. 15

16 ATYBIOGRAM ROZSZERZONY Jeśli mamy do czynienia ze szczepami wieloopornymi oraz VRE izolowanymi z zakażeń zagrażających życiu (grupa chorych z obniżoną odpornością) należy dodatkowo oznaczyć wrażliwość na inne leki np.: chloramfenikol, rifampicynę, erytromycynę, które nie są stosowane w standardowej terapii zakażeń enterokokowych. Zawsze oznaczać MIC dla takich szczepów! imipenem 10 µg Stosować tylko w wyjątkowych sytuacjach i tylko do leczenia zakażeń wywołanych przez E. faecalis; E. faecium posiada naturalną oporność na imipenem. erytromycyna 15 µg tetracyklina 30 µg chloramfenikol 30 µg rifampicyna 5 µg chinupristyna/dalfopristyna 15 µg linezolid 30 µg Wrażliwość na tetracyklinę jest reprezentatywna dla wszystkich leków z tej grupy. Doksycyklina i minocyklina mogą być nastawiane ponieważ istnieją szczepy oporne na tetracyklinę, a wrażliwe na doksycyklinę i minocyklinę. Minocyklina nie jest zarejestrowana w Polsce. Nie zaleca się stosowania tetracyklin u dzieci poniżej 12 r.ż. Stosować wyjątkowo, zawsze po oznaczeniu MIC. Stosować wyjątkowo, tylko wobec szczepów wieloopornych; nie stosować w monoterapii. Preparat Synercid jest już zarejestrowany w Polsce, może być stosowany do leczenia zakażeń o etiologii Enterococcus faecium opornego na wankomycynę (VRE). E. faecalis posiada naturalną oporność na chinupristynę/dalfopristynę. Preparat Zyvox jest dostępny w imporcie docelowym, może być stosowany wobec E. faecium i E. faecalis opornych na wankomycynę (VRE). 16

17 3. Oznaczanie wrażliwości Streptococcus pneumoniae Badanie należy wykonywać na podłożu KBMHA, inkubować godziny, w temperaturze 35 o C, w atmosferze, 5 % CO Szczepy wzorcowe: Streptococcus pneumoniae ATCC oksacylina 1 µg ANTYBIOGRAM PODSTAWOWY Krążkiem z oksacyliną bada się wrażliwość na penicylinę. Wrażliwość na penicylinę oznacza wrażliwość na aminopenicyliny, aminopenicyliny w połączeniu z inhibitorami βlaktamaz, cefalosporyny I,II,III generacji. Nie można podać interpretacji: średniowrażliwy i oporny tylko na podstawie interpretacji wielkości strefy zahamowania wzrostu wokół krążka z oksacyliną strefa 19mm, dla takich izolatów. W przypadku szczepów izolowanych z zakażeń inwazyjnych oraz szczepów o obniżonej wrażliwości na penicylinę (strefa 19mm wokół krążka z oksacyliną) bezwzględnie oznaczać MIC penicyliny i cefalosporyn III generacji (cefotaksymu lub ceftriaksonu) 1. Szczepy oporne na penicylinę są oporne na cefalosporyny I i II generacji, a niekiedy nawet III generacji, poza tym mogą wykazywać brak wrażliwości na szereg innych grup terapeutycznych jak: makrolidy, tetracykliny, chloramfenikol, kotrimoksazol. UWAGA! Wybór i skuteczność antybiotyków βlaktamowych w przypadku zakażenia szczepem o średniej wrażliwości na penicylinę jest uzależnione od miejsca toczącego się zakażenia. W takim przypadku możemy je z powodzeniem stosować w zakażeniach dróg oddechowych, pod warunkiem np. podwyższenia dawki. Natomiast stosowanie w zakażeniach OUN cefalosporyny III generacji mogą okazać się skuteczne pod warunkiem zwiększenia dawki bądź w terapii skojarzonej. erytromycyna 15 µg Wynik badania wrażliwości na erytromycynę jest reprezentatywny dla roksytromycyny, klarytromycyny, azytromycyny i dirytromycyny. trimetoprim/sulfametoksazol 1,25/23,75 µg (kotrimoksazol) Ponad 30% szczepów izolowanych w Polsce jest opornych. 1 Interpretacja wartości MIC dla penicyliny i cefalosporyn III generacji Antybiotyk Wartość MIC (mg/l) wrażliwy średniowrażliwy oporny penicylina 0,06 0,121 2 cefotaksym lub ceftriakson 0,

18 ANTYBIOGRAM ROZSZERZONY klindamycyna 2µg wankomycyna 30 µg teikoplanina 30 µg tetracykliny 30 µg moksifloksacyna 5µg chloramfenikol 30 µg rifampicyna 5 µg chinupristyna/dalfopristyna 15 µg linezolid 30 µg Badać rutynowo szczepy izolowane z krwi, płynu mózgowordzeniowego i materiału pochodzącego z groźnych zakażeń; o ile możliwe oznaczać MIC wankomycyny dla takich izolatów. j.w., oporność przy strefie zahamowania wzrostu <16 mm. Wrażliwość na tetracyklinę jest reprezentatywna dla wszystkich leków z tej grupy. Doksycyklina i minocyklina mogą być nastawiane, ponieważ istnieją szczepy oporne na tetracyklinę, a wrażliwe na doksycyklinę i minocyklinę Minocyklina nie jest zarejestrowana w Polsce. Nie zaleca się stosowania tetracyklin u dzieci poniżej 12 r.ż. Pierwszy fluorochinolon z aktywnością wobec pneumokoków, zarejestrowany tylko do leczenia wybranych zakażeń układu oddechowego. Nie zaleca się stosowania fluorochinolonów u dzieci poniżej 16 r.ż. Stosować wyjątkowo tylko w zakażeniach OUN. Zawsze oznaczyć MIC. Stosować wyjątkowo, jedynie w ciężkich zakażeniach wieloopornymi szczepami. Należy umieścić informację, że nie powinna być stosowana w monoterapii. Preparat Synercid jest już zarejestrowany w Polsce, może być zastosowany do leczenia ciężkich zakażeń Preparat Zyvox jest dostępny w imporcie docelowym. 18

19 4. Oznaczanie wrażliwości paciorkowców βhemolizujących i jamy ustnej (ang. oral streptococci), dawniej paciorkowce zieleniące 4.1.Badanie należy wykonywać na podłożu KBMHA, inkubować godziny, w temperaturze 35 o C, w warunkach tlenowych z dodatkiem 5% CO Szczepy wzorcowe: Streptococcus pneumoniae ATCC ANTYBIOGRAM PODSTAWOWY penicylina 10 IU lub ampicylina 10 µg erytromycyna 15 µg klindamycyna 2 µg W przypadku paciorkowców zieleniących izolowanych w monokulturze z materiałów jałowych w warunkach fizjologicznych (krew, płyn mózgowo rdzeniowy, kości) zalecane jest oznaczanie MIC penicyliny. W przypadku paciorkowców βhemolizujących gr. B (S. agalactiae) oznaczać zawsze wrażliwość na ampicylinę (mogą wykazywać obniżoną wrażliwość na penicylinę); S. pyogenes jest powszechnie wrażliwy na penicylinę G, (jeżeli strefa wokół krążka z penicyliną <24mm, taki szczep należy przesłać do laboratorium referencyjnego). Wynik oznaczania wrażliwości na erytromycynę jest reprezentatywny dla roksytromycyny, klarytromycyny, azytromycyny i dirytromycyny. ANTYBIOGRAM ROZSZERZONY cefotaksym 30 µg lub ceftriakson30µg ofloksacyna 5 µg wankomycyna 30 µg lub teikoplanina 30 µg Badać zwłaszcza izolaty z zakażeń ośrodkowego układu nerwowego. Kryteria interpretacyjne dotyczą jedynie szczepów paciorkowców β hemolizujących. Szybkie narastanie oporności na fluorochinolony. Nie zaleca się stosowania fluorochinolonów u dzieci poniżej 16 r.ż. Nie należy oznaczać wrażliwości w przypadku szczepów izolowanych z układu moczowego. chloramfenikol30µg chinupristyna/dalfopristyna 15 µg tertracyklina 30 µg 19

20 krążek z antybiotykiem penicylina 10UI/ ampicylina 10µg 2 Paciorkowce β hemolizujących strefa w mm Paciorkowce jamy ustnej (ang. oral streptococci) MIC strefa w mm MIC O 1 Ś 1 W 1 O Ś W O Ś W O Ś W ,12 0,25 0,12 0,25 0,252 0, cefotaksym 30µg ceftriakson 30µg ,5 0, ,5 0, cefepim 30µg 24 0, , Ooporny, Śśredniowrażliwy, Wwrażliwy 2 oznaczenie wrażliwości na penicylinę/ampicylinę metodą dyfuzyjnokrążkową tylko dla paciorkowców βhemolizujących W przypadku zakażeń uogólnionych, wywołanych przez paciorkowce jamy ustnej o obniżonej wrażliwości na penicylinę, antybiotyki ßlaktamowe stosować w terapii skojarzonej z aminoglikozydami. 5. Oznaczanie wrażliwości Moraxella catarrhalis 5.1. Badanie należy wykonywać na podłożu MHA, inkubować godzin, w temperaturze 35 o C, w warunkach tlenowych Wytwarzanie βlaktamaz należy badać krążkiem z nitrocefiną (test cefinazowy). Jest to jedyna wiarygodna metoda. O wytwarzaniu β laktamaz można pośrednio wnioskować na podstawie oznaczania wrażliwości na penicylinę i ampicylinę metodą dyfuzyjną. Ze względu na powszechne wytwarzanie βlaktamaz (ponad 90% szczepów M. catarrhalis wytwarza βlaktamazę) badanie to można pominąć. W leczeniu zakażeń wywołanych przez M. catarrhalis produkujących βlaktamazę skuteczne są leki: ampicylina/sulbaktam, amoksycylina/kwas klawulanowy, cefalosporyny II (cefaklor, cefuroksym) i III generacji, fluorochinolony, makrolidy, tetracykliny. 20