PL B1. Sposób otrzymywania kwasu (S)-7-hydroxy-6-oxo-2,3,4,6-tetrahydroizochinolino-3-karboksylowego oraz jego zastosowanie

Transkrypt

1 PL B1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) (13) B1 Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (21) Numer zgłoszenia: (22) Data zgłoszenia: (51) Int.Cl. C07D 217/24 ( ) A61P 31/04 ( ) A61P 31/10 ( ) A61P 39/06 ( ) (54) Sposób otrzymywania kwasu (S)-7-hydroxy-6-oxo-2,3,4,6-tetrahydroizochinolino-3-karboksylowego oraz jego zastosowanie (43) Zgłoszenie ogłoszono: BUP 03/11 (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: WUP 08/14 (73) Uprawniony z patentu: NARODOWY INSTYTUT ZDROWIA PUBLICZNEGO - PAŃSTWOWY ZAKŁAD HIGIENY, Warszawa, PL INSTYTUT CHEMII ORGANICZNEJ POLSKIEJ AKADEMII NAUK, Warszawa, PL (72) Twórca(y) wynalazku: JOLANTA SOLECKA, Warszawa, PL ROBERT KAWĘCKI, Warszawa, PL LECH KOZERSKI, Warszawa, PL (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Andrzej Witek

2 2 PL B1 Opis wynalazku Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania kwasu (S)-7-hydroxy-6-oxo-2,3,4,6-tetrahydroizochinolino-3-karboksylowego oraz jego nowe zastosowanie w medycynie i farmacji. W polskim zgłoszeniu patentowym P ujawniono cząsteczkę kwasu (S)-7-hydroxy-6-oxo- -2,3,4,6-tetrahydroizochinolino-3-karboksylowego oraz szczep bakterii do jej otrzymywania. W opisie patentowym US ujawniono sposób zabezpieczania materiałów organicznych przed utlenianiem poprzez podawanie pochodnych izochinoliny. W opisie patentowym US ujawniono sposób otrzymywania 6,7-dialkoksy-3,4-dihydroizochinolin-8-olu. Wobec wskazanego powyżej stanu techniki istnieje potrzeba opracowania alternatywnego sposobu otrzymywania kwasu (S)-7-hydroxy-6-oxo-2,3,4,6-tetrahydroizochinolino-3-karboksylowego, który pozwalałby na uzyskiwanie tego związku drogą syntezy chemicznej. Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania kwasu (S)-7-hydroxy-6-oxo-2,3,4,6-tetrahydroizochinolino-3-karboksylowego charakteryzujący się tym, że obejmuje: a) otrzymywanie (S)-N-formylo-3,4-dihydroksyfenyloalaniny z (L) - DOPY w reakcji z formyloksyacetonitrylem w rozpuszczalniku organicznym, b) otrzymywanie kwasu (+)-(S)-6,7-dihydroksy-3,4-dihydroizochinolino-3-karboksylowego z N-formyIo-DOPY w rekcji z tlenochlorkiem fosforu, c) otrzymywanie (S)-7-hydroxy-6-oxo-2,3,4,6-tetrahydroizochinolino-3-karboksylowego poprzez utrzymywanie kwasu (+)-(S)-6,7-dihydroksy-3,4-dihydroizochinolino-3-karboksylowego w ph około 7. Reakcja przedstawiona na schemacie: W kolejnej korzystnej realizacji wynalazku sposób charakteryzuje się tym, że otrzymywanie na etapie a) zachodzi w obecności DMSO przez około 24 godziny w temperaturze pokojowej. W kolejnej równie korzystnej realizacji wynalazku sposób charakteryzuje się tym, że otrzymywanie na etapie a) obejmuje: (i) usuwanie rozpuszczalnika pod wysoką próżnią, (ii) rozpuszczanie pozostałości w acetonitrylu, (iii) dodawanie chlorku metylenu do wytrącenia produktu, (iv) odsączanie i krystalizację w acetonitrylu. Równie korzystnie sposób według wynalazku charakteryzuje się tym, że otrzymywanie na etapie b) zachodzi w pod chłodnicą zwrotną przez około 1 godzinę. W kolejnej równie korzystnej realizacji wynalazku charakteryzuje się tym, że etap b) obejmuje: (i) odsączanie osadu i zatężanie przesączu pod zmniejszonym ciśnieniem; (ii) oczyszczanie przy pomocy HPLC. Kolejnym przedmiotem wynalazku jest kwas (S)-7-hydroksy-6-okso-2,3,4,6-tetrahydroizochinolino-3-karboksylowy do zastosowania jako środek antybakteryjny. Kolejnym przedmiotem wynalazku jest kwas (S)-7-hydroksy-6-okso-2,3,4,6-tetrahydroizochinolino-3-karboksylowy do zastosowania jako środek przeciwgrzybiczy. Kolejnym przedmiotem wynalazku jest kwas (S)-7-hydroksy-6-okso-2,3,4,6-tetrahydroizochinolino-3-karboksylowy do zastosowania jako środek przeciwutleniający. P r z y k ł a d 1 Otrzymywanie (S)-N-formylo-3,4-dihydroksyfenyIoalaniny Do zawiesiny (L)-DOPY (575 mg, 2,9 mmol) w DMSO (5,5 cm 3 ) dodano formyloksyacetonitryl (663 mg, 7,8 mmol). Otrzymaną zawiesinę mieszano w temperaturze pokojowej przez 24 godz. Rozpuszczalnik usunięto pod wysoką próżnią, a pozostałość rozpuszczono w acetonitrylu. Dodano chlorku metylenu w takiej ilości, żeby wytrącić powstały produkt. Osad odsączono i krystalizowano z acetonitrylu. Wydajność 61%. 1 H NMR (CD 3 CN) : 2,89 (1/2ΑΒΧ, J=13.9, 7,3 Hz, 1H); 3.04 (1/2ABX,

3 PL B1 3 J=13.9, 5.4 Hz, 1H); 4.71 (m, 1H); 6.56 (dd, J=7.9, 1,9 Hz, 1H), 6.70 (d, J=1,9 Hz, 1H); 6.72 (d, J=7.9 Hz, 1H); 7.21 (dd, J=7.9, 1,3 Hz, 1H); 8.07 (d, J=1.3 Hz, 1H); 8.24 (br, 1H). 13 C NMR (CD 3 CN) 37.1; 53.3; 116.2; 117.3; 122.0; 129.1; 144.3; 145.2; 163.3; P r z y k ł a d 2 Otrzymywanie kwasu (+) -(S)-6,7-dihydroksy-3,4-dihydroizochinolino-3-karboksylowego Do roztworu N-formylo-DOPY (70 mg, 0.31 mmol) w acetonitrylu (13 cm 3 ) dodano tlenochlorek fosforu (342 mg, 2.24 mmol) i roztwór ogrzewano pod chłodnicą zwrotną przez 1 godz. Wytrącony osad odsączono, a przesącz zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem. Otrzymany brązowy olej był oczyszczony przy pomocy HPLC z użyciem preparatywnej kolumny RP C18 (Nucleosil) stosując początkowo jako eluent 0.1% kwas trifluorooctowy w wodzie, a następnie mieszaninę 10% acetonitrylu w 0.1% kwasie trifluorooctowym. 1 H NMR (H 2 O/D 2 O ph=1.5) : 3.36 (1/2ΑΒΧ, J=17.2, 8.5 Hz, 1H); 3.44 (1/2ΑΒΧ, J=17.2, 7.6 Hz, 1H); 4.86 (ddd, J=8.5, 7.6, 1.0, 1H); 6.94 (s, 1H); 7.31 (s, 1H); 8.72 (s, 1H). 13 C NMR (D 2 O) : 28.0; 54.6; 109.4; 116.7; 116.8; 133.8; 145.2; 158.2; 167.5; HR ESI MS obliczono dla C 10 H 10 NO 4 (M+H) Znaleziono: P r z y k ł a d 3 Otrzymywanie kwasu (+)-(S)-7-hydroxy-6-oxo-2,3,4,6-tetrahydroizochinolino-3-karboksylowego. W ph 7 zsyntetyzowany związek występuje w formie tautomerycznej. 1 H NMR (H 2 O/D 2 O ph=7.0) : 3.12 (1/2ΑΒΧ, J=16. 6, 9.2 Hz, 1H); 3.22 (1/2ΑΒΧ, J=16.6, 7.0 Hz, 1H); 4.34 (dd, J=9.2, 7.0, 1H); 6.46 (s, 1H); 6.97 (s, 1H); 8.14 (s, 1H). 13 C NMR (D 2 O) : 28.0; 54.6; 109.4; 116.7; 116.8; 133.8; 145.2; 158.2; 167.5; Analiza widm NMR pozwoliła na określenie struktury analizowanego inhibitora. Jest to kwas (+)- -(S)-7-hydroxy-6-oxo-2,3,4,6-tetrahydroizochinolino-3-karboksylowy. P r z y k ł a d 4 Aktywność przeciwbakteryjna Aktywność przeciwbakteryjną związku zbadano metodą kolejnych seryjnych rozcieńczeń substancji (określenie wartości MIC) w standardowych warunkach, jak opisano przez Committee Laboratory Standards (CLSI) metoda referencyjna M7-A7 [CLSI - Method for Dilution Antimicrobial Susceptibility Test for Bacteria That Grow Aerobically; Approved Standard-Seventh Edition. M7-A7 [ISBN ]. CLSI, 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne, Pennsylvania USA (2006)]. Wartości MIC podano w tabeli 1. Testowane mikroorganizmy: bakterie, Staphylococcus aureus ATCC 25923, Staphylococcus aureus ATCC 43300, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Escherichia coli ATCC 25922, Escherichia coli ATCC BAA-198, hodowano na tryptic soy agarze (TSA; Oxoid). Klebsiella pneumoniae ATCC 13882, Bordetella bronchiseptica ATCC 4617, Acinetobacter baumannii ATCC 19606, Proteus mirabilis ATCC 12453, Proteus vulgaris ATCC Stenotrophomonas maltophilia ATCC hodowano na agarze odżywczym (Difco). Escherichia coli ATCC BAA-198 hodowano na TSA z ceftazidymem (10 g ml -1 ; Sigma). Enterococcus faecalis ATCC hodowano na TSA z 5% odwłóknioną krwią baranią. Burholderia cepacia ATCC rosła na agarze z wyciągiem mózgowo-sercowym. Wszystkie szczepy inkubowano przez 24 godz. w temperaturze 37 C. Metoda referencyjna (test mikrorozcieńczeń). Zsyntetyzowany związek rozpuszczono w wodzie bidestylowanej. Serie podwójnych rozcieńczeń alkaloidu rozcieńczono podłożem Mueller-Hintona z dodatkiem kationów (CAMHB). 95 μl tych roztworów nanoszono do dołków sterylnych płytek (Mar-Four). Następnie nanoszono po 5 l inokulum bakterii zawierające 5 x 10 4 CFU ml -1. Zastosowano końcowe stężenie alkaloidu w zakresie od 320 do 5 g ml -1. Dla każdej próbki doświadczenia powtórzono trzykrotnie. Jako próby kontrolne zastosowano polymyxinę B i penicylinę G (od 8 do 0,15 μgml -1 ). Płytki inkubowano od 18 do 24 godzin w 37 C (35 C) w zależności od szczepu bakterii. MIC zdefiniowano jako najniższe stężenie redukujące wzrost bakterii w 100%. Do określenia najmniejszego bakteriobójczego stężenia (MBC) pobrano próbki po 10 l z każdej hodowli bez widocznego wzrostu i przeniesiono na agar TSA. Inkubowano przez 24 godz. w 37 C. Wartości MBC podano w tabeli 1.

4 4 PL B1 P r z y k ł a d 5 Aktywność przeciwgrzybicza. Grzyby: Candida albicans ATCC 10231, Candida krusi ATCC 6258, Candida parapsilosis ATCC rosły na podłożu Sabouranda z 4% glukozą. Test wrażliwości metodą mikrorozcieńczeń przeprowadzono według Clinical and Laboratory Standards Institute, reference method M27 - A2 [CLSI. Reference Method for Broth Dilution Antifungal Susceptibility Testing of Yeast; Approved Standard - Second Edition. M27-A2, CLSI, Wayne, Pa (2002)]. T a b e l a 1 MIC i MBC alkaloidu 1) Microorganism MIC g ml -1 MBC g ml -1 Staphyloccocus aureus ATCC Staphyloccocus aureus ATCC Enterococcus faecalis ATCC >320 >320 Bordetella bronchiseptica ATCC Acinetobacter baumanii ATCC Klebsiella pneumoniae ATCC >320 >320 Burkholderia cepacia ATCC Pseudomonas aeruginosa ATCC > >320 Stenotrophomonas maltophilia ATCC Proteus vulgaris ATCC Proteus mirabilis ATCC Escherichia coli ATCC >320 >320 Escherichia coli ATCC BAA-198 >320 >320 Candida albicans ATCC >320 >320 Candida krusei ATCC Candida parapsilosis ATCC ) MIC związków referencyjnych: penicylina G - S. aureus ATCC g ml -1 ; polimyxyna B- P. aeruginosa ATCC g ml -1 ; amfoterycyna - C. krusei - 1 g ml -1. P r z y k ł a d 6 Genotoksyczność Genotoksyczność związku testowano przy zastosowaniu dwóch genetycznie zmodyfikowanych szczepów Bacillus subtilis M45 (rec - ) oraz H17 (rec + ). Szczepy otrzymano od dr. Sadaie (Kada et. al.: 1980 Bacillus subtilis rec-assay test. in: de Sevres, F.E., Hollender, A. (Eds.), Chemical Mutagens, vol.6. Plenum Press, New York, p. 149). Alkaloid nie wykazał stref zahamowania wzrostu obydwu szczepów. Natomiast strefy zahamowania dla wzorca - 4-nitrochinolino-N-tlenku (2 g) wynoszą dla M45 rec - 24 mm, dla H17 rec + 12 mm. Badany związek nie jest genotoksyczny. Zastrzeżenia patentowe 1. Sposób otrzymywania kwasu (S)-7-hydroksy-6-oxo-2,3,4,6-tetrahydroizochinolino-3-karboksylowego, znamienny tym, że obejmuje: a) otrzymywanie (S)-N-formylo-3, 4-dihydroksyfenyloalaniny z (L) - DOPY w reakcji z formyloksyacetonitrylem w rozpuszczalniku organicznym, b) otrzymywanie kwasu ( + )-(S)-6,7-dihydroksy-3,4-dihydroizochinolino-3-karboksylowego z N-formyIo-DOPY w reakcji z tlenochlorkiem fosforu,

5 PL B1 5 c) otrzymywanie (S) -7-hydroxy-6-oxo-2,3,4,6-tetrahydroizochinolino-3-karboksylowego poprzez utrzymywanie kwasu (+)-(S)-6,7-dihydroksy-3,4-dihydroizochinolino-3-karboksylowego w ph około Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że na etapie a) reakcję prowadzi się w obecności DMSO przez około 24 godziny w temperaturze pokojowej. 3. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że etap a) obejmuje: (i) usuwanie rozpuszczalnika pod wysoką próżnią, (ii) rozpuszczanie pozostałości w acetonitrylu, (iii) dodawanie chlorku metylenu do wytrącenie produktu, (iv) odsączanie i krystalizację w acetonitrylu. 4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że na etapie b) reakcję prowadzi się pod chłodnicą zwrotną przez około 1 godzinę. 5. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że etap b) obejmuje: (i) odsączanie osadu i zatężanie przesączu pod zmniejszonym ciśnieniem; (ii) oczyszczanie przy pomocy HPLC. 6. Kwas (S)-7-hydroksy-6-okso-2,3,4,6-tetrahydroizochinolino-3-karboksylowy do zastosowania jako środek antybakteryjny. 7. Kwas (S)-7-hydroksy-6-okso-2,3,4,6-tetrahydroizochinolino-3-karboksylowy do zastosowania jako środek przeciwgrzybiczy. 8. Kwas (S)-7-hydroksy-6-okso-2,3,4,6-tetrahydroizochinolino-3-karboksylowy do zastosowania jako środek przeciwutleniający.

6 6 PL B1 Departament Wydawnictw UPRP Cena 2,46 zł (w tym 23% VAT)