Katedra i Zakład Mikrobiologii Lekarskiej, Warszawski Uniwersytet Medyczny w Warszawie 2

Transkrypt

1 MED. DOŚW. MIKROBIOL., 2012, 64: Opracowanie metody PCR w czasie rzeczywistym do wykrywania wirusa ospy wietrznej i półpaśca z wykorzystaniem fluorescencyjnej sondy typu TaqMan TaqMan fluorescent probe-based real-time PCR assay for detection of varicella-zoster virus Szymon Kierat 2, Katarzyna Leś 1, Maciej Przybylski 1, Tomasz Dzieciątkowski 1, Grażyna Młynarczyk 1 1 Katedra i Zakład Mikrobiologii Lekarskiej, Warszawski Uniwersytet Medyczny w Warszawie 2 Oddział Medycyny Laboratoryjnej, Wydział Farmaceutyczny, Warszawski Uniwersytet Medyczny w Warszawie Celem pracy było opracowanie, optymalizacja oraz zbadanie użyteczności laboratoryjnej metody real-time PCR, z wykorzystaniem sondy hydrolizującej typu TaqMan, do badania zakażeń wirusem ospy wietrznej i półpaśca (VZV, HHV-3). ABSTRACT Introduction. Varicella-zoster virus (HHV-3) is spread by the respiratory route and disseminates to lymph nodes and then via lymph back to the skin, resulting with the rash of chickenpox. Like other α-herpesviruses, HHV-3 infects the neurons of the dorsal root ganglia, where it causes lifelong latency. Virus reactivation causes episode of herpes zoster (shingles). During severe HHV-3 infections molecular methods, such as real-time PCR (qpcr) assay, are recognized as a method-of-choice for detecting viral DNA in clinical specimens. The aim of this study was to develop the qpcr assay for detection and quantification of varicella-zoster virus DNA in different clinical samples, using specific primers targeting a HHV-3 DNA ORF62 gene and a fluorescent TaqMan probe. Methods. The analytical sensitivity of assay was tested using serial dilutions of viral DNA in range between 100 and copies/ml. Limit of detection (LOD) was calculated using probit analysis, and was determined as 750 copies/ml. In further studies 18 clinical samples (sera, whole blood, skin swabs), taken from a small group of 5 children with symptoms of chickenpox were tested for the presence of varicella-zoster virus DNA, using LightCycler 2.0 system.

2 140 S. Kierat i inni Nr 2 Results. Described in-house qpcr method detected viral DNA in all examined specimens. Detected viral load was between 5750 copies/ml for sera samples and copies/ ml for skin swabs, respectively. Conclusions. The results of this work showed that developed real-time PCR assay based on TaqMan probe was very reliable and valuable for detection and quantification of varicella- -zoster virus DNA in different clinical samples. The high level of sensitivity, specificity, accuracy, and rapidity provided by the developed method are favorable for its use for the detection of HHV-3 DNA in laboratory practice. WSTĘP Ludzki herpeswirus typu 3 (Human herpesvirus 3, HHV-3), zwyczajowo nazywany wirusem ospy wietrznej i półpaśca (Varicella-Zoster Virus, VZV), należy do rzędu Herpesvirales, rodziny Herpesviridae, podrodziny Alphaherpesvirinae i rodzaju Varicellovirus (3). Do pierwotnego zakażenia HHV-3 dochodzi zazwyczaj w wieku dziecięcym, najczęściej drogą kropelkową lub przez bezpośredni kontakt z płynem pęcherzowym ze zmian skórnych (5). Największa zaraźliwość dotyczy wczesnego okresu zakażenia (9), i w ospie wietrznej trwa od 3 do 6 dni po wystąpieniu wysypki. Ryzyko zachorowania w grupie dzieci w ośrodkach takich jak przedszkola i szkoły wynosi około 30%, zaś w przypadku choroby domownika sięga 90% (17). Wirus ustala następnie stan latencji w komórkach zwojów nerwów czaszkowych, korzeni tylnych rdzenia kręgowego i autonomicznego układu nerwowego, a ewentualna reaktywacja objawia się półpaścem (5, 10). Wiremię w przebiegu półpaśca obserwuje się u 78% chorych (15) - może wówczas dojść do rozsiewu wirusa drogą krwi, co jest związane z ryzykiem rozwoju zapaleń płuc, wątroby lub mózgu. U osób z dysfunkcjami układu odpornościowego, pierwotna infekcja może mieć poważny przebieg o charakterze ciężkich zmian narządowych w postaci zapalenia płuc, wątroby, trzustki, krwotocznych owrzodzeń przewodu pokarmowego, zapalenia opon mózgowo- -rdzeniowych i mózgu lub zespołu rozsianego wykrzepiania wewnątrznaczyniowego (13). W tej grupie pacjentów reaktywacja latentnego wirusa może być przyczyną półpaśca zlokalizowanego o klasycznym przebiegu, ale może przybierać też inne, poważniejsze formy (5, 10). Rozpoznanie niepowikłanych postaci ospy wietrznej lub półpaśca ustalane jest najczęściej na podstawie objawów klinicznych, a potwierdzenie laboratoryjne nie jest wymagane (2, 16, 8). Uzyskanie potwierdzenia laboratoryjnego jest uzasadnione, gdy obraz kliniczny zakażenia HHV-3 jest nietypowy (dotyczy to także osób szczepionych szczepionką atenuowaną) lub wtedy, gdy zakażenie ma charakter uogólniony, narządowy bądź układowy (16). W tych przypadkach diagnostyka laboratoryjna służy także monitorowaniu skuteczności leczenia w trakcie i po zakończeniu terapii (10). Obecnie metodami z wyboru w laboratoryjnym potwierdzaniu zakażenia HHV-3 są techniki wykrywania wirusowego DNA oraz techniki hodowlane. Izolacja wirusa w hodowli komórkowej z materiału pobranego od pacjenta pozostaje złotym standardem diagnostyki zakażeń HHV-3 (16), lecz jest to metoda kosztowna, czasochłonna, wymagająca dalszej diagnostyki metodami swoistymi, i dostępna jedynie w nielicznych ośrodkach. Łańcuchowa

3 Nr 2 Wykrywanie wirusa ospy wietrznej i półpaśca 141 reakcja polimerazy (PCR, polymerase chain reaction) jest techniką czułą, swoistą i szybką, pozwalającą na wykrycie wirusowego DNA w różnych materiałach klinicznych (8, 16). Zalety te dotyczą także techniki PCR z detekcją w czasie rzeczywistym (qpcr), która w porównaniu z klasycznym PCR jest metodą mniej czaso- i pracochłonną, obarczoną mniejszym ryzykiem kontaminacji laboratorium produktem amplifikacji, umożliwia również ilościowe określenie poziomu wirusowego DNA w materiale badanym (6). Celem pracy było opracowanie metody PCR z detekcją w czasie rzeczywistym do wykrywania DNA ludzkiego wirusa ospy wietrznej i półpaśca, ustalenie jej podstawowych parametrów analitycznych oraz weryfikacja z użyciem materiałów klinicznych. MATERIAŁ I METODY Dobór sekwencji oligonukleotydów. W opracowywanej metodzie zdecydowano się na wybór regionu docelowego w obrębie otwartej ramki odczytu 62 (ORF62) HHV-3, w obrębie której występuje wybitnie konserwatywny odcinek DNA, wybrany jako region docelowy w projektowanej metodzie. Startery PCR oraz sondę, wykorzystywane w niniejszej metodzie (Tabela I), zaprojektowano przy pomocy oprogramowania LightCycler Probe Design Software 2.0 (Roche Diagnostics). Jako matrycy do wyboru sekwencji starterów i sondy, użyto sekwencji całogenomowego DNA HHV-3, szczep Dumas (GeneBank: X ). Startery (Oligo) powielają fragment otwartej ramki odczytu ORF62 HHV-3 o długości 136 par zasad, a komplementarna w obrębie produktu PCR sonda hydrolizująca typu TaqMan została wyznakowana na końcu 5 fluorescencyjnym barwnikiem reporterowym 5 cyjaniną (5 Cy), a na końcu 3 wygaszaczem BHQ-2 (Oligo). Tabela I. Sekwencje starterów i sondy. Sekwencja 5 3 Zawartość Temperatura par G+C topnienia Starter 1 TAC ATG CGG AAC GGG AGA C 57,9% 60,7 ºC Starter 2 CCC TAT AGC ATG GCT CCA GA 55,0% 60,3 ºC Sonda 5 Cyjanina AAC TGG TTC AGG GCC GAG TTG BHQ2 57,1% 66,9 ºC Podczas optymalizacji działania projektowanej metody wykonano badania mające na celu dobór końcowego stężenia starterów oraz sondy, badanie tożsamości uzyskanego produktu PCR oraz ocenę skuteczności stosowanej dla potrzeb pracy metody izolacji DNA HHV-3. Materiały odniesienia zawierające DNA HHV-3. Dla potrzeb pracy wykorzystano następujące źródła DNA HHV-3: (i) standard referencyjny o znanej liczbie kopii, zawierający 3,13x10 6 kopii/ml oczyszczonego całogenomowego DNA HHV-3 (Vircell Microbiologists), przygotowany przez producenta z wirusa namnożonego w linii komórkowej MRC-5 (ATCC CCL-171); standard ten używany był jako kontrola dodatnia we wszystkich reakcjach, a także jako matryca do badania tożsamości produktu PCR; (ii) izolat kliniczny HHV /99, namnożony w linii komórkowej HEL 299 (ATCC CCL-137), który został użyty w badaniu oceny skuteczności standardowej metody izolacji DNA oraz jako matryca do badania

4 142 S. Kierat i inni Nr 2 tożsamości produktu PCR, a także (iii) próbki surowicy, krwi pełnej oraz wymazy z gardła i zmian skórnych, pobrane od pięciu pacjentów pediatrycznych prezentujących objawy ospy wietrznej, nie później niż 48 godzin od momentu rozpoznania. DNA wyizolowane z wymazu ze zmian skórnych zostało użyte także jako matryca do badania tożsamości produktu PCR. Szeregi rozcieńczeń standardu (100000, oraz 1000 kopii DNA HHV-3/ml) wykorzystano jako kalibratory w badaniach ilościowych oraz jako próby w badaniach liniowości, granicy wykrywalności oraz granicy oznaczalności. Do określenia liniowości i jej zakresu, dokładności, granic wykrywalności i oznaczalności wykorzystano rozcieńczenia standardu HHV-3 w stosunku logarytmicznym co 0,5 log 10 w zakresie kopii DNA HHV-3/ml. DNA HHV-3 izolowano przy użyciu zestawu High Pure Viral Nucleic Acid Kit (Roche Diagnostics). Izolację przeprowadzono z objętości 200 μl odpowiednich materiałów, zgodnie z instrukcją wytwórcy, zawieszając wyizolowane DNA w końcowej objętości 50 μl wody. PCR w czasie rzeczywistym. Reakcję łańcuchowej polimeryzacji w czasie rzeczywistym przeprowadzono w aparacie LightCycler 2.0 (Roche Applied Science) z użyciem zestawu amplifikacyjnego LightCycler TaqMan Master (Roche Diagnostics), zawierającego polimerazę DNA, trójfosforany deoksynukleotydów, chlorek magnezu oraz związki buforujące ph. Oprócz zestawu amplifikacyjnego, w skład mieszaniny reakcyjnej o końcowej objętości 20 μl wchodziło 5 μl materiału badanego, sonda (0,5 µm) oraz oba startery (0,25 µm). Na etapie optymalizacji metody zbadano działanie sondy w zakresie stężeń od 0,17 μm do 0,5μM oraz obu starterów w stężeniach od 0,15 μm do 0,5 μm. Pomiar poziomu fluorescencji odbywał się w każdym cyklu reakcji, przy długości fali λ = 670 nm z użyciem filtra referencyjnego λ = 530 nm. Parametry reakcji przedstawia tabela II. Tabela II. Parametry PCR w czasie rzeczywistym, warunki zoptymalizowane dla aparatu LightCycler 2.0 (Roche Diagnostics) Proces Ilość cykli Temperatura [ C] Czas trwania Inkubacja polimerazy DNA typu Hot-Start minut Denaturacja sekund Hybrydyzacja starterów sekund Wydłużanie 72 5 sekund Chłodzenie sekund Metodyka walidacji. Na etapie sprawdzenia prawidłowości działania metody wykonano badania swoistości analitycznej, czułości analitycznej, powtarzalności, odtwarzalności, zakresu liniowości metody, dolnej granicy wykrywalności oraz dolnej i górnej granicy oznaczalności. Prócz tego sprawdzono zdolność metody do wykrywania DNA HHV-3, izolowanego z wirusa namnożonego w hodowli komórkowej oraz z materiałów pobranych od pacjentów pediatrycznych w okresie objawów ospy wietrznej. Do badania tożsamości produktu użyto metody sekwencjonowania DNA z wykorzystaniem zestawu BigDye v3.1 (Applied Biosystems) przy użyciu sekwenatora ABI 3130 Genetic Analyzer (Applied Biosystems). Uzyskane sekwencje porównano z bazą danych sekwencji nukleotydów NCBI, przy użyciu oprogramowania BLASTN ( nih.gov). W celu oceny, czy w reakcji PCR powielono żądany fragment DNA, określono podobieństwo uzyskanych sekwencji do sekwencji homologicznych (ORF 62 HHV-3),

5 Nr 2 Wykrywanie wirusa ospy wietrznej i półpaśca 143 natomiast w celu oceny ryzyka nieswoistej amplifikacji nieprawidłowych produktów PCR określono podobieństwo do najbardziej zbliżonych sekwencji niehomologicznych. Badanie swoistości wyłącznej przeprowadzono z użyciem DNA izolowanego z czystych hodowli bakterii (Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes, Enterococcus faecium, Escherichia coli i Klebsiella oxytoca), DNA izolowanego z wirusów namnożonych w hodowlach komórkowych: ludzkiego adenowirusa (HAdV) typu 5, HAdV-7, ludzkiego herpeswirusa (HHV) typu 1, HHV-2, HHV-4 i HHV-5, jak również komplementarnego DNA (cdna) uzyskanego z hodowli wirusów RNA: wirusa parainfluenzy typu 3, wirusa ECHO 18, enterowirusa 71, wirusa Coxsackie A9 oraz wirusa Coxsackie B3. Zbadano także czy w reakcji nie dochodzi do nieswoistego powielenia ludzkiego DNA, wyizolowanego z materiałów klinicznych nie zawierających HHV-3: krwi pełnej, surowicy, osocza i popłuczyn pęcherzykowo-oskrzelikowych (14). Jako materiał do wyznaczenia czułości analitycznej przyjęto wyniki 112 oznaczeń prowadzonych z próbkami zawierającymi znaną teoretyczną ilość DNA standardu w zakresie granic wykrywalności metody, używając prób zawierających od 1050 kopii DNA standardu HHV-3 w mililitrze do kopii/ml (14). Powtarzalność metody określono jako zgodność pomiędzy serią niezależnych wyników w takich samych warunkach pracy w krótkim przedziale czasu (14), i zbadano ją w serii 6 próbek zawierających kopii DNA standardu HHV-3 w mililitrze. Następnie obliczono odchylenie standardowe, względne odchylenie standardowe oraz wyznaczono przedział ufności dla wartości przeciętnej. Odtwarzalność metody zdefiniowano jako zgodność pomiędzy wynikami pomiarów tej samej próby, przeprowadzonych przez dwóch różnych analityków, w ciągu dwóch kolejnych dni, z użyciem różnych serii odczynników (14). Przeprowadzono 4 reakcje w pięciu powtórzeniach, z wykorzystaniem rozcieńczenia standardu DNA HHV-3 zawierającego kopii/ml. Wartość liczbową współczynnika odtwarzalności wyrażono za pomocą względnego odchylenia standardowego. W celu określenia liniowości i jej zakresu przeprowadzono reakcję qpcr dla mian wirusowego DNA w zakresie od 300 do kopii DNA HHV-3/ml, sporządzając szereg dziesięciu różnych rozcieńczeń, różniących się od siebie o 0,5 logarytmu dziesiętnego (14). Wszystkie rozcieńczenia DNA HHV-3 zbadano w pięciu powtórzeniach. W obliczeniach użyto wartości mian wyrażonych jako ich logarytm dziesiętny. Obliczono współczynnik korelacji między wartościami wartości teoretycznego miana wirusowego DNA i zmierzoną wartością Cp. Granicę wykrywalności metody wyliczono określając ją jako najniższe stężenie DNA, które zostanie wykryte z 95% prawdopodobieństwem przy badaniu co najmniej 24 próbek stanowiących powtórzenia 3-, 4- lub 6-ciu rozcieńczeń DNA szczepu referencyjnego w dziesiętnej skali logarytmicznej (13). Prawdopodobieństwo uzyskania wyniku dodatniego obliczono zgodnie z metodyką opisaną przez Burns i Valdivia (1). Przed wykonaniem obliczeń, zlogarytmowano (log 10 ) wartości kopii DNA standardu HHV-3. Oznaczenia przeprowadzono wykorzystując szereg rozcieńczeń DNA wzorca, różniących się o pół wartości logarytmu dziesiętnego i zawierających 100, 300, 1050, 3100 oraz kopii DNA HHV-3 w mililitrze. Każde rozcieńczenie badano w 6 powtórzeniach. W celu określenia granic oznaczalności, testowano analogiczne serie rozcieńczeń DNA wzorca HHV-3, jak w przypadku badania granicy wykrywalności. Uzyskane miana DNA

6 144 S. Kierat i inni Nr 2 HHV-3 zlogarytmowano (log 10 ), a następnie obliczono dla tych logarytmów względny błąd całkowity, przyjmując wartości akceptowalne w zakresie ±20% (15). W końcowym etapie badania metody, przeprowadzono reakcje qpcr dla DNA wyizolowanego z materiałów klinicznych od pacjentów z rozpoznaną ospą wietrzną. Dla każdej próby przeprowadzono reakcje dwiema metodami: - LightCycler VZV Qual Kit (Roche) test jakościowy, certyfikowany do diagnostyki in vitro, - opracowywaną metodą w założeniach test ilościowy. Test LightCycler VZV Qual Kit przyjęto za metodę odniesienia. WYNIKI Sekwencjonowanie produktów PCR z użyciem DNA izolowanego ze szczepu wzorcowego, szczepu klinicznego izolowanego w hodowli komórkowej oraz materiału ze zmian skórnych dziecka z objawami ospy wietrznej dało sekwencje całkowicie zgodne z sekwencją DNA odpowiedniego regionu ORF62 szczepu referencyjnego HHV-3. Jednocześnie nie zaobserwowano znaczącego podobieństwa uzyskanej sekwencji do sekwencji nukleotydów organizmów innych, niż HHV-3. Wszystkie reakcje łańcuchowej polimeryzacji w czasie rzeczywistym, przeprowadzone w celu oceny swoistości przeprowadzone z DNA i cdna wyizolowanymi z bakterii, wirusów oraz materiałów pochodzących od człowieka, dały wynik ujemny. Obliczona swoistość metody wynosi 100%. Spośród 112 próbek zawierających DNA HHV-3, wziętych do badania czułości, ze 110 uzyskano wyniki dodatnie, a z dwóch uzyskano wyniki fałszywie ujemne. Oba wyniki fałszywie ujemne uzyskano w próbkach zawierających 1050 kopii DNA HHV-3/ml. Czułość badanej metody wyniosła 98,21%. W badaniu powtarzalności metody, dla matrycy zawierającej kopii HHV-3 w mililitrze, określono wartość średnią punktu przegięcia krzywej amplifikacji produktu PCR (crossing point, Cp) jako 29,3 cykli qpcr, odchylenie standardowe wynosiło 0,38 cykli, względne odchylenie standardowe 1,29%, a 95% przedział ufności wynosił ± 0,395 cykli qpcr. Odpowiednio, w badaniach odtwarzalności, wykorzystując matrycę zawierającą kopii HHV-3/ml, uzyskano średnią wartość Cp 32,39 cykli, odchylenie standardowe 0,54 cykla, a względne odchylenie standardowe 1,67%. Metoda wykazuje wysoki stopień korelacji liniowej (R 2 = 0,996). Zakres liniowości (Ryc. 2) obejmuje cały testowany zakres mian wirusowego DNA tj kopii DNA HHV-3 w mililitrze. W badaniach granicy wykrywalności określono, że prawdopodobieństwo 95% wykrycia DNA standardu HHV-3 znajduje się między wartościami standardów zawierających 300 i 1050 kopii/ml. Przyjmując jako wartość odcięcia standard, który metoda może, lecz nie musi wykryć (standard zawierający 100 kopii DNA HHV-3/ml wykryto w 3 spośród 6 powtórzeń) obliczono średnią wartość Cp dla uzyskanych wyników dodatnich, wynoszącą 38,31 cykli. Wartość tę przyjęto jako parametr przesunięcia Cp (14). Metodą kolejnych iteracji określono, że prawdopodobieństwo wykrycia DNA HHV-3 przyjmuje wartość 0,95072 dla

7 Nr 2 Wykrywanie wirusa ospy wietrznej i półpaśca 145 Ryc. 1 Badanie czułości metody PCR w czasie rzeczywistym w kierunku wykrywania HHV-3 w materiale z zakażonej hodowli komórkowej. Poszczególne krzywe amplifikacyjne dotyczą DNA izolowanego z seryjnych rozcieńczeń wirusa w zakresie od 10-1 do 10-5 (patrz Tabela III) Ryc. 2 Wykres przedstawiający krzywą regresji liniowej uzyskaną w badaniu liniowości metody w zakresie użytych rozcieńczeń DNA standardu HHV-3

8 146 S. Kierat i inni Nr 2 Ryc. 3 Graficzne przedstawienie granicy wykrywalności opracowanej metody. Tabela III. Miano DNA HHV-3 oznaczone w materiale z hodowli komórkowej Rozcieńczenie Miano DNA HHV-3 [kopie/ml] dodatni (<1260) 10-5 ujemny 739,35 kopii standardu DNA HHV-3 w mililitrze. Zdecydowano się przyjąć wartość 750 kopii DNA standardu HHV-3 w mililitrze (rycina 3) jako granicę wykrywalności metody. Wyniki uzyskane podczas testowania granicy oznaczalności przedstawiono na rycinie 4. Przyjmując przedział akceptacji <-20%, +20%> (15), przyjęto miano 1260 kopii DNA HHV-3/ml za dolną granicę oznaczalności, zaś kopii/ml (najwyższa dostępna liczba kopii DNA standardu) za górną granicę oznaczalności. Podczas badania DNA pochodzącego z namnożonego w hodowli komórkowej izolatu klinicznego HHV /99, metoda umożliwiała wykrycie rozcieńczeń DNA w zakresie od 10-1 do Nie wykryto natomiast DNA w rozcieńczeniu 10-5, jednak znajdowało się ono poniżej obliczonej granicy wykrywalności metody (Ryc.1). Wyniki zestawiono w tabeli III. Wyniki badania materiałów klinicznych, uzyskanych przy użyciu opracowywanej metody oraz metody referencyjnej zestawiono w tabeli IV.

9 Nr 2 Wykrywanie wirusa ospy wietrznej i półpaśca 147 Ryc. 4. Graficzne przedstawienie dolnej i górnej granicy oznaczalności opracowanej metody. Pionowa przerywana linia wyznacza miano DNA HHV-3, dla którego względny błąd całkowity oznaczeń wynosi 20%. Tabela IV. Wyniki ilościowe uzyskane opracowywaną metodą dla materiałów klinicznych. * wyniki powyżej zakresu liniowości (> kopii DNA VZV/ml materiału). Pacjent Materiał Miano DNA HHV-3 oznaczone przy użyciu badanej metody [kopie/ml] Wyniki oznaczeń jakościowych, uzyskane za pomocą metody referencyjnej wymaz ze skóry dodatni wymaz z gardła dodatni krew pełna dodatni surowica dodatni wymaz ze skóry * dodatni wymaz z gardła 8800 dodatni krew pełna dodatni surowica 5800 dodatni wymaz ze skóry * dodatni wymaz z gardła dodatni krew pełna dodatni surowica 6000 dodatni wymaz ze skóry * dodatni wymaz z gardła * dodatni krew pełna dodatni surowica ujemny wymaz ze skóry * dodatni wymaz z gardła dodatni

10 148 S. Kierat i inni Nr 2 DYSKUSJA Poszukując skutecznych i ekonomicznych sposobów diagnozowania zakażeń HHV-3, należy wziąć pod uwagę możliwości rozpoznania zakażenia w dwóch odrębnych sytuacjach klinicznych. Z jednej strony, diagnostyka ospy wietrznej, czy półpaśca ogranicza się najczęściej do badania lekarskiego (8), ponieważ zarówno w półpaścu, jak i w ospie wietrznej, badanie fizykalne od momentu pojawienia się osutki pozwala na ustalenie pewnej diagnozy (4). Z drugiej strony, w najbliżej przyszłości można spodziewać się wzrostu zapotrzebowania na badania laboratoryjne w kierunku HHV-3 u coraz większej liczby pacjentów z upośledzeniem reaktywności układu immunologicznego (biorcy narządów, krwiotwórczych komórek macierzystych oraz zakażeni HIV) oraz pacjentów szczepionych szczepionką atenuowaną (5, 13). W badaniu opracowanej metody wykazano, że cechują ją bardzo dobre parametry analityczne oraz wysoki poziom odporności na błędy laboratoryjne; metodę można też łatwo dostosować do różnych materiałów klinicznych, co sprawia że mogłaby ona znaleźć zastosowanie w trudnych diagnostycznie przypadkach. Argumentem za wprowadzeniem opracowanej metody do rutynowej diagnostyki jest też możliwość wykonania oznaczeń ilościowych. Obecnie dostępne są przede wszystkim testy jakościowe. Watzinger i wsp. (18) wymieniają tylko jeden test komercyjny, który wykorzystuje technikę qpcr i przeznaczony jest do analiz ilościowych w diagnostyce zakażeń HHV-3 (RealArt VZV PCR Kit, Artus obecnie niedostępny na rynku polskim). W odróżnieniu od zakażeń ludzkim wirusem upośledzenia odporności, wirusami zapalenia wątroby typów B i C, cytomegalowirusem, czy wirusem Epsteina-Barr, dla których zależność kliniczna między poziomem wiremii, a rozwojem i nasileniem objawów jest dobrze zbadana, problem ten w odniesieniu do przebiegu zakażenia wirusem ospy wietrznej i półpaśca został dotychczas opisany w niewielkiej liczbie publikacji (19). Przydatność opracowanej metody została także potwierdzona w materiałach klinicznych istotnych dla diagnostyki zakażeń HHV-3, a uzyskanych od pacjentów oddziału pediatrycznego chorych na ospę wietrzną, a także w testach z użyciem wirusa namnożonego w hodowli komórkowej. Do badania metody z użyciem materiałów klinicznych wykorzystano wszystkie próbki otrzymane z Kliniki Chorób Zakaźnych Wieku Dziecięcego WUM. Ograniczona liczba próbek wynika z czynników losowych zostały pobrane od wszystkich pacjentów z nie budzącym wątpliwości rozpoznaniem klinicznym ospy wietrznej, hospitalizowanych w Klinice w czteromiesięcznym okresie pozyskiwania próbek dla potrzeb pracy. W przyszłych badaniach walidacyjnych, dostosowujących metodę do materiałów takich jak wymazy z gardła i materiał ze zmian skórnych, należy rozważyć wprowadzenie kalibratora o wartości kilkudziesięciu milionów kopii DNA HHV-3 w mililitrze w celu poszerzenia zakresu liniowości metody (Tab. IV). Zastosowanie opracowanej techniki w diagnostyce zakażeń wirusem ospy wietrznej i półpaśca powinno pozwolić na uzyskanie wiarygodnych wyników. Włączenie opracowanej metody do multi plekso wej metody qpcr różnicującej chorobotwórcze dla ludzi α-herpeswirusy (12), pozwoliłoby na jeszcze pełniejsze wykorzystanie możliwości PCR w czasie rzeczywistym poprzez przeprowadzenie jednoczesnej reakcji dla 3 patogenów, co pozwoliłoby skrócić czas ustalania rozpoznania, jak i wdrożenia celowanego leczenia.

11 Nr 2 Wykrywanie wirusa ospy wietrznej i półpaśca 149 PIŚMIENNICTWO 1. Burns M, Valdiva H, Modelling the limit of detection in real-time quantitative PCR, 2008, Eur Food Res Technol 226; Cohen J, Brunell P, Straus S i inni. Recent advances in varicella-zoster virus infection. Ann Intern Med 1999; 130: Davison A, Eberle R, Hayward GS i inni. Herpesviridae. W: Virus taxonomy - classification and nomenclature of viruses. Ninth report of ICTV. Red. M.Q, King,.J. Adams, E.B. Carstens i inni, Elsevier Academic Press, San Diego 2011, Dworkin R, Johnson R, Breuer J i inni. Recommendations for the management of herpes zoster. Clin Infect Dis 2007; 44: S1-S Dwyer DE, Cunningham AL. Herpes simplex and varicella-zoster virus infections. Med J Aust 2002; 177: Dzieciątkowski T, Majewska A, Krawczyk E i inni. Postacie kliniczne i diagnostyka herpeswirusowych zakażeń skóry. Przegl Dermat 2007; 94: European Directorate for the Quality of Medicine & HealthCare. Validation Of Nucleic Acid Amplification Technology (NAT) for the Detection Of Hepatitis C Virus (HCV) RNA In Plasma Pools. Official Control Authority Batch Release of Biological Substances; 2001: 3 8. Gershon AA. Varicella-zoster virus infections. Pediatr Rev 2008; 29: Gershon A, Takahashi M, Seward J. Varicella vaccine. W: Vaccines, 5th Edition. Red. S. Plotkin, W. Orenstein, P. Offit, Elsevier Academic Press, San Diego 2008, Gilden D, Mahalingam R, Cohrs E i inni. Herpesvirus infections of the nervous system. Nat Clin Pract Neurol 2007; 3: Hubert P, Nguyen-Huub J, Boulanger B i inni., Harmonization of strategies for the validation of quantitative analytical procedures. A SFSTP proposal part III, J Pharmaceut Biomed 2007; 45: Midak-Siewirska A, Karabin K, Chudzik E i inni. Zastosowanie techniki real-time PCR do wykrywania DNA ludzkiego wirusa opryszczki typu 1. Med Dośw Mikrobiol 2010; 62: Miller GG, Dummer JS. Herpes simplex and varicella zoster viruses: forgotten but not gone. Am J Transpl : Parshionikar S, Haughland RA, Shanks O i inni. Method Validation of U.S. Environmental Protection Agency. Microbiological Methods of Analysis. FEM Document Number ; 2009: Quinlivan M, Ayres K, Ran H i inni. Effect of viral load on the outcome of herpes zoster. J Clin Microbiol 2007; 45: Simon K, Dziemianko I. Obraz kliniczny zakażeń Herpesviridae w stanach obniżonej odporności u chorych po przeszczepach szpiku kostnego i narządów miąższowych. Przegl Epidemiol 2003; 58: Sitarska-Gołębiowska J. Ospa wietrzna i półpasiec. W: Zakażenia i zarażenia człowieka. Epidemiologia, zapobieganie i zwalczanie. Red. W. Magdzik, D. Naruszewicz-Lesiuk, PZWL, Warszawa 2001, Watzinger F, Ebner K, Lion T. Detection and monitoring of virus infections by real-time PCR. Mol Aspects Med; 2006; 27: Watzinger F, Suda M, Preuner S i inni. Real-time quantitative PCR assays for detection and monitoring of pathogenic human viruses in immunosuppressed pediatric patients. J Clin Microbiol; 2004; 42: Otrzymano: 13 IV 2012 r Adres Autora: Warszawa ul. Chałubińskiego 5, Katedra i Zakład Mikrobiologii Lekarskiej, Warszawski Uniwersytet Medyczny maciej@conexion.pl

12