Zastosowanie metody real-time PCR do wykrywania RNA enterowirusów człowieka

Transkrypt

1 MED. DOŚW. MIKROBIOL., 2010, 62: Katarzyna Leś 2, Maciej Przybylski 1,2, Tomasz Dzieciątkowski 1,2, Grażyna Młynarczyk 1,2 Zastosowanie metody real-time PCR do wykrywania RNA enterowirusów człowieka 1 Katedra i Zakład Mikrobiologii Lekarskiej, Warszawski Uniwersytet Medyczny Kierownik: prof. dr hab. G. Młynarczyk 2 Zakład Mikrobiologii, Samodzielny Publiczny Centralny Szpital Kliniczny Kierownik: prof. dr hab. G. Młynarczyk Celem pracy było zaprojektowanie i optymalizacja warunków reakcji w metodzie real-time PCR z wykorzystaniem sondy typu TaqMan do wykrywania enterowirusów człowieka. Użyto starterów oraz sondy komplementarnych dla konserwatywnych sekwencji w obrębie regionu niekodującego genomu enterowirusów (5 UTR). Sprawdzono swoistość metody wobec 19 taksonów enterowirusów z grup Coxsackie A, Coxsackie B, echowirusów i enterowirusów 68/71, a także innych wirusów zakażających człowieka. Określono zakres czułości metody względem szeregu dziesiętnych rozcieńczeń zawiesiny wzorcowych szczepów enterowirusów. Wprowadzenie w 1957 roku określenia enterowirusy pozwoliło zakwalifikować do jednej grupy poliowirusy, wirusy Coxsackie z grupy A i B oraz echowirusy (1, 14). Dzisiaj znanych jest ponad 60 przedstawicieli tego rodzaju. Są to małe, bezotoczkowe wirusy zawierające RNA jako materiał genetyczny, należące do rodziny Picornaviridae (8, 14), powodujące różnego rodzaju zakażenia u dzieci i osób dorosłych. Zwykle objawy zakażenia enterowirusami są niespecyficzne np. gorączka lub bóle głowy, ale zdarzają się także postacie objawowe stanowiące zagrożenie życia (15). Najczęściej do zakażeń enterowirusami dochodzi drogą fekalno-oralną lub oddechową w okresie lata i wczesnej jesieni (13, 14). Enterowirusy wywołują wiele chorób, z których najgroźniejszą jest nagminne porażenie dziecięce (poliomyelitis), powodowane przez poliowirusy typu 1-3. Szczepy te w wyniku wtórnej wiremii atakują ośrodkowy układ nerwowy przez zakończenia obwodowych włókien nerwowych. W postaciach poronnych choroby i w postaci nieporażennej powrót do zdrowia jest całkowity. Postać porażenna poliomyelitis w 25% przypadków prowadzi do poważnego kalectwa, w 25% do inwalidztwa niewielkiego stopnia, natomiast pozostali pacjenci wracają do pełnego zdrowia bez śladów porażeń. Śmiertelność wynosi od 1-4 % u dzieci, lecz wśród dorosłych może dochodzić nawet do 10% (1, 14, 15). Enterowirusy niepoliomielityczne wywołują szereg chorób, które wprawdzie nie są tak groźne dla życia człowieka jak poliomyelitis, ale również mogą wymagać hospitalizacji. Zaliczamy do nich: aseptyczne zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych, herpanginę, chorobę bornholmską czy zapalenie wsierdzia (1, 14).

2 246 K. Leś i inni Nr 3 Przez wiele lat za złoty standard w diagnozowaniu zakażeń enterowirusowych uważano izolację szczepów wraz z późniejszą identyfikacją typu wirusa testem neutralizacji z wzorcowymi surowicami. W obecnej chwili do izolacji enterowirusów w hodowlach komórkowych stosuje się co najmniej dwie różne linie komórek w celu zapewnienia jak największej wydajności tej metody (10). Testy neutralizacji, wykorzystujące różnice w budowie antygenowej enterowirusów, polegają na inkubacji wyizolowanego szczepu wirusowego z surowicami odpornościowymi dla konkretnych serotypów enterowirusów, a następnie zakażeniu wrażliwych hodowli komórkowych (11). Podstawą identyfikacji jest reaktywność surowic wzorcowych z odpowiednim serotypem wirusa. Ze względu na różnorakie ograniczenia w badaniach serologicznych lub izolacji wirusa w hodowlach komórkowych, konieczne stało się opracowanie nowych technik diagnostycznych, które umożliwiają wykrywanie obecności enterowirusów w organizmie pacjenta już w początkowych etapach zakażenia. Reakcja łańcuchowej polimeryzacji (PCR) jest jedną z technik biologii molekularnej, która umożliwia powielanie fragmentów DNA in vitro. W celu wykrycia wirusowego RNA konieczna jest jednak uprzednia transkrypcja RNA do komplementarnego DNA (cdna) za pomocą odwrotnej transkryptazy. Na matrycy powstałego cdna przeprowadza się reakcję PCR (RT-PCR). Metoda ta połączona z elektroforezą żelową pozwala wykryć enterowirusowe RNA nawet w niewielkiej ilości materiału badanego; charakteryzuje się także dużą swoistością (2, 7, 10). Jedną z odmian PCR jest reakcja łańcuchowej polimeryzacji w czasie rzeczywistym (qpcr), która umożliwia szybkie powielanie, wykrywanie i identyfikację nawet znikomych ilości materiału genetycznego. Technika real-time PCR charakteryzuje się wyższą czułością niż tradycyjna reakcja łańcuchowej polimeryzacji (6, 12); można ją także z powodzeniem stosować w przypadku dłużej przechowywanego wrażliwego materiału biologicznego, np. próbek krwi pełnej lub surowicy krwi (9). Dodatkowo na korzyść qpcr przemawia możliwość zautomatyzowania procedury i znacznego obniżenia kosztów analizy (16). Celem pracy było opracowanie i optymalizacja testu PCR z detekcją w czasie rzeczywistym do wykrywania RNA ludzkich enterowirusów w różnych materiałach klinicznych, ze szczególnym uwzględnieniem surowicy krwi oraz płynu mózgowo-rdzeniowego. MATERIAŁ I METODY Do badań użyto 19 szczepów enterowirusów, należących do grup Coxackie A, Coxackie B, ECHO oraz enterowirus 68/71 (Tabela I). Szczepy namnażane były w komórkach linii MK 2 (ATCC: CCL-7) utrzymywanych w podłożu Eagle a (WSiS Lublin) z dodatkiem 10% płodowej surowicy bydlęcej (Invitrogen). Zakażone hodowle komórkowe inkubowano do wystąpienia efektu cytopatycznego obejmującego 75-80% komórek. Izolację wirusowego RNA przeprowadzono, zgodnie z procedurą dostarczoną przez producenta, przy użyciu odczynnika TRIzol (Invitrogen), używając jako materiału zawiesin wirusa zebranych znad hodowli komórkowych. Wyizolowane RNA zawieszano w końcowej objętości 50 µl wody destylowanej wolnej od kwasów nukleinowych oraz nukleaz. Wyizolowane RNA w objętości 8 µl używano do syntezy cdna w reakcji odwrotnej transkrypcji z użyciem losowych heksametrów i odwrotnej transkryptazy M-MLV (Invitrogen) (Tabela II).

3 Nr 3 Wykrywanie RNA enterowirusów metodą real- time PCR 247 Produkt reakcji, czyli cdna stanowiło materiał do wykrywania enterowirusów w łańcuchowej reakcji polimerazy, zarówno z detekcją w czasie rzeczywistym, jak i w wariancie klasycznym. Tabela I. Nazwy i numery szczepów enterowirusów wykorzystywanych w badaniach Nazwa i numer szczepu Coxsackie A 9 (1971) Echo 5 (0552) Coxsackie A 16(354PT) Echo 6 (1846) Coxsackie B2 Echo 9 (2121) Coxsackie B2(2082) Echo 9 (2165) Coxsackie B3 Echo 9 (2325) Coxsackie B3(97PT) Echo 11 (1843) Coxsackie B4 Echo 18 (20290) Coxsackie B4 Echo 30 (2110) Coxsackie B5 Entero 71 Coxsackie B5(1957) Tabela II. Skład mieszaniny reakcyjnej do odwrotnej transkrypcji Odczynnik Objętość H 2 O 20 µl 5x bufor FS 8 µl 0,1 DTT 5 µl 10 mm dntp 5 µl Inhibitor RNAz 1,5 µl BSA 1 µl Do wykrywania genetycznego materiału enterowirusów metodą qpcr stosowano swoiste startery, zaprojektowane do amplifikacji fragmentu genomu o długości 96 par zasad w obrębie regionu 5 UTR. W celu zwiększenia specyficzności reakcji zaprojektowano sondę znakowaną na końcu 5 fluoroforem JOE a na końcu 3 wygaszaczem DABCYL (Oligo) (Tabela III). Tabela III. Sekwencje użytych starterów i sondy Nazwa Sekwencja (5 3 ) Ent_1 TCC GGC CCC TGA ATG C Ent_2 CAC CGG ATG GCC AAT CCA Ent_JOE JOE GCG GAA CCG ACT ACT TTG GG DABCYL Badania techniką real-time PCR wykonywano w aparacie LightCycler 2.0 z użyciem zestawu amplifikacyjnego LightCycler TaqMan Master (Roche Diagnostics). Mieszanina reakcyjna zawierała 5 µl cdna, po 1 µm obu starterów oraz 200 nm sondy w końcowej objętości 20 µl. PCR rozpoczynał się etapem aktywacji (hot-start) termostabilnej DNA polimerazy przez 10 min w temp. 95 C, po którym następowało 40 cykli składających się z denaturacji 10 s w temp. 95 C, przyłączania starterów przez 30 s w temp. 55 C oraz wydłużania nici w temperaturze temp. 72 C przez 18 s. Reakcję kończyło schłodzenie próbek

4 248 K. Leś i inni Nr 3 do temp. 40 C na 30 sekund. Odczyt fluorescencji odbywał się przy długości fali 560 nm, typowej dla fluoroforu JOE. Do określenia swoistości zaprojektowanej reakcji real-time PCR użyto RNA wyizolowanego z zakażonych enterowirusami komórek linii MK 2 (Tabela I). Jako kontrolę ujemną wykorzystano DNA wyekstrahowane z niezakażonej linii A549, zaś za kontrole swoistości reakcji posłużyło DNA izolowane z ludzkich herpeswirusów (HSV-1, HSV-2, EBV, HHV-7) oraz adenowirusów typu 4 i 12. Poprzez dodanie namnożonego wirusa Echo 18 do materiałów klinicznych (surowica, osocze, krew pełna, popłuczyny z drzewa oskrzelowego, płyn mózgowo-rdzeniowy) i izolację RNA oraz odwrotną transkrypcję sposób opisany powyżej, badano potencjalną inhibicję reakcji real-time PCR w danym materiale. Do określenia czułości metody PCR wykonano seryjne 10-krotne rozcieńczenia supernatantu hodowli komórkowej zakażonej wirusem Coxackie A9. RNA wyekstrahowano z 200 µl kolejnych rozcieńczeń supernatantu w podłożu Eagle a w zakresie od 10 0 do Dla porównania wykonano standardowy RT-PCR służący do wykrywania enterowirusów wg. Hyypia (7) w końcowej objętości 50 µl z użyciem 5 µl wyizolowanego cdna. Produkty amplifikacji poddawano 60-cio minutowej elektroforezie w 1,5% żelu agarozowym z dodatkiem bromku etydyny (Serva) w buforze TAE (Invitrogen), przy napięciu 10 V/cm żelu. Wizualizację przeprowadzano w świetle ultrafioletowym za pomocą transiluminatora UV. Wszystkie opisane powyżej badania prowadzono w dwukrotnych, niezależnych powtórzeniach. WYNIKI Przy użyciu jakościowej metody real-time PCR wynik dodatni, wyrażony wykładniczym przyrostem fluorescencji mieszaniny reakcyjnej, osiągnięto wyłącznie dla próbek zawierających cdna enterowirusów człowieka. W pozostałych próbkach, zawierających kontrolne DNA uzyskane z niezakażonej linii A549, wirusa opryszczki typu 1 i 2, wirusa ospy wietrznej/półpaśca, herpeswirusa typu 7, wirusa Epsteina-Barr oraz ludzkich adenowirusów typu 4 i 12, nie zaobserwowano fluorescencji przy długości fali świetlnej 560 nm, co oznacza, że nie zaszła w nich swoista amplifikacja kwasu nukleinowego. Obserwacja taka poczyniona dla próbek zawierających materiał genetyczny innych wirusów świadczy o wysokiej swoistości zaprojektowanej reakcji (Ryc.1). Dodatkowo w próbach z użyciem różnych materiałów klinicznych nie zaobserwowano w żadnym z nich zmian w progu czułości wykrywania wirusowego cdna. Podczas określania zakresu czułości metody, technika real-time PCR umożliwiała wykrycie wszystkich użytych rozcieńczeń cdna wirusa Coxackie A9. Wynik dodatni w postaci obserwowanego wzrostu fluorescencji wystąpił we wszystkich próbkach zawierających rozcieńczenia cdna w zakresie od 10 0 do 10-8 (Ryc.2). W użytej do porównania metodzie RT- PCR połączonej z elektroforetycznym rozdziałem produktów (7) uzyskano także specyficzną amplifikację sekwencji docelowych wirusa Coxackie A9. Jednak rozcieńczenia cdna zastosowane przy określaniu czułości techniką real-time PCR, amplifikowane konwencjonalną metodą RT-PCR, dawały wynik dodatni w postaci widocznych prążków na żelu agarozowym wyłącznie w zakresie rozcieńczeń od 10 0 do 10-4 (Ryc.3).

5 Nr 3 Wykrywanie RNA enterowirusów metodą real- time PCR 249 Ryc.1. Badanie swoistości reakcji real-time PCR w kierunku wykrywania enterowirusów człowieka. Wynik dodatni (eksponencjalny przyrost poziomu fluorescencji) wystąpił w przypadku próbki zawierającej cdna wirusa Echo18. Pozostałe próbki zawierające DNA izolowane z niezakażonej linii komórkowej A549 oraz DNA HSV-1, HSV-2, EBV, VZV, HHV-7, HAdV-4 i HAdV-12 dały wynik ujemny. Ryc.2. Badanie czułości metody real-time PCR w kierunku wykrywania enterowirusów człowieka. Poszczególne krzywe oznaczają amplifikację cdna seryjnych rozcieńczeń wirusa Coxackie A9 w zakresie od 10-2 do K (-) to kontrola ujemna reakcji - DNA izolowane z niezakażonej linii komórkowej A549.

6 250 K. Leś i inni Nr 3 Ryc.3. Badanie czułości tradycyjnej metody PCR w kierunku wykrywania enterowirusów człowieka. Poszczególne ścieżki elektroforegramu oznaczają cdna pochodzące z seryjnych rozcieńczeń wirusa Coxackie A9 w zakresie od 10 0 do 10-4 ; K (-) to kontrola ujemna reakcji - DNA izolowane z niezakażonej linii komórkowej A549; marker - wzorzec masowy DNA 100 bp (Invitrogen). DYSKUSJA Z powodu swego rozpowszechnienia, enterowirusy w dalszym ciągu pozostają jednym z najważniejszych czynników odpowiedzialnych za objawowe zakażenia człowieka. Diagnostyka zakażeń enterowirusami jest skomplikowana i czasochłonna ze względu na liczbę typów wirusów występujących w obrębie rodzaju (1, 14). Wykrycie przeciwciał swoistych w klasie IgG lub wykrycie swoistych przeciwciał wszystkich klas w przebiegu ostrego zakażenia objawowego rzadko prowadzi do jednoznacznego określenia enterowirusowej etiologii bieżącego zakażenia. Także uznana metoda serologiczna, jaką jest wykrywanie swoistych przeciwciał w klasie IgM może dawać niejednoznaczne wyniki, zwłaszcza w zakażeniach przewlekłych, zakażeniach o przebiegu subklinicznym lub podczas zwiększonej stymulacji immunologicznej populacji w sezonie epidemicznym (10). Uważana do niedawna za złoty standard w diagnostyce zakażeń o etiologii enterowirusowej metoda izolacji wirusów w hodowlach komórkowych charakteryzuje się niską czułością. Potwierdzenie etiologii aseptycznego enterowirusowego zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych poprzez wyizolowanie wirusa z próbki płynu mózgowo-rdzeniowego ma miejsce tylko w mniej niż 75% przypadków (15). Należy również zwrócić uwagę na brak możliwości namnażania niektórych szczepów enterowirusów w hodowlach komórkowych, co poważnie utrudnia diagnozowanie zakażeń (3, 10). W latach w Państwowym Zakładzie Higieny przeprowadzono badania próbek materiału klinicznego pobranych

7 Nr 3 Wykrywanie RNA enterowirusów metodą real- time PCR 251 od osób z objawami wskazującymi na wirusowe zakażenie ośrodkowego układu nerwowego. Spośród tej grupy analizie poddano 1946 przypadków pacjentów ze schorzeniami ośrodkowego układu nerwowego. Dodatni wynik izolacji uzyskano u 31,11 % i 28,27%, odpowiednio w 1995 i 1996 roku. W 2000 roku na 268 próbek poddanych izolacji wynik ujemny izolacji miał miejsce w przypadku 264 próbek, co oznacza tylko 1,5 % wyników dodatnich. Powyższe fakty wskazują na wyjątkowo niską częstość izolacji enterowirusów w Polsce (3). Pomimo, że coraz częściej technika ta jest zastępowana przez nowoczesne metody molekularne, izolacja enterowirusów w hodowlach komórkowych nadal pozostaje metodą niezbędną w prowadzeniu prac badawczych. Dostarcza ona szeregu istotnych informacji m. in. o krążeniu szczepów należących do poszczególnych typów, jak i dominacji określonych typów enterowirusów w sezonach epidemicznych. Kolejny etap diagnostyki, test seroneutralizacji, uważany jest za metodę wysoce czasochłonną i skomplikowaną. W ujęciu praktycznym niemożliwe jest badanie materiału klinicznego przy użyciu surowic, w których znajdowałyby się przeciwciała dla szczepów z całego rodzaju. Z tego też powodu stosuje się surowice pulowane, dobrane tak, by po reakcji dawały charakterystyczne wyniki dla konkretnych szczepów (10, 11). Jednakże nawet dostępność wielu zestawów surowic nie umożliwia serotypowania wszystkich szczepów, gdyż izoluje się szczepy niepoddające się identyfikacji w testach neutralizacji (10). Ograniczeniem metody jest również fakt, iż wynik testu zależy od doświadczenia osoby wykonującej badanie. W warunkach szpitalnego laboratorium mikrobiologicznego utrudnia to znacząco stosowanie tej metody w rutynowej diagnostyce. Próby standaryzacji testów seroneutralizacji zakończyły się niepowodzeniem, z tego też powodu serotypowaniem enterowirusów zajmują się tylko referencyjne i wyspecjalizowane laboratoria naukowe (10). W praktyce uzyskanie wyniku potwierdzającego zakażenie ludzkimi enterowirusami pozwala lekarzowi na szybkie postawienie diagnozy. Najważniejszym zadaniem dla klinicysty jest odróżnienie stanu zagrażającego życiu dziecka od bardziej łagodnych przyczyn podwyższonej temperatury ciała szczególnie, gdy istnieje podejrzenie o zakażenia OUN. Infekcje o podłożu bakteryjnym mogą rozwijać się bardzo gwałtownie, bez możliwości różnicowania z aseptycznym zapaleniem opon mózgowo-rdzeniowych na etapie przedmiotowego badania dziecka (5). Czułość i swoistość testów PCR zaprojektowanych do wykrywania enterowirusów została określona na poziomie >95 % i jest znacząco wyższa od czułości hodowli komórkowych (65-75%) (4). Dzieci z podejrzeniem aseptycznego zapalenia opon mózgowo rdzeniowych poddawane są zbędnej antybiotykoterapii oraz wielu badaniom, w tym bardzo kosztownym, jak rezonans magnetyczny czy tomografia komputerowa. Wykrywając materiał genetyczny enterowirusów w próbkach materiału pobranych od pacjenta już w pierwszym dniu hospitalizacji można doprowadzić do znaczącego obniżenia kosztów procedur medycznych w następstwie skrócenia czasu hospitalizacji oraz racjonalizacji terapii (16). Reakcja łańcuchowa polimeryzacji z detekcją produktu w czasie rzeczywistym stała się niezbędnym narzędziem diagnostycznym ze względu na swą wysoką czułość i swoistość. Większość metod RT-PCR oraz qpcr służących do diagnostyki zakażeń enterowirusowych polega na wykrywaniu sekwencji w obrębie regionu 5 UTR, co spowodowane jest jego konserwatywnością w obrębie całego rodzaju Enterovirus (5, 7, 12). Czułość izolacji wirusa z PMR jest niewystarczająca, i jak wynika z danych Państwowego Zakłady Higieny spada ona w naszym kraju niepokojąco z roku na rok (3). Może okazać się więc,

8 252 K. Leś i inni Nr 3 że reakcja łańcuchowa polimeryzacji w wariancie real-time będzie szczególnie przydatna w diagnozowaniu aseptycznego zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych. Dodatkową zaletą opracowanej metody jest jej wszechstronność w odniesieniu do różnych rodzajów materiału klinicznego, w których w przebiegu zakażenia można poszukiwać materiału genetycznego enterowirusów. Wykorzystując w badaniach szereg materiałów klinicznych o różnej zawartości składników organicznych oraz elementów komórkowych nie zaobserwowano spadku poziomu wykrywalności cdna enterowirusów w odniesieniu do materiału wzorcowego, którym był supernatant zakażonej hodowli komórkowej. Zalety diagnozowania enterowirusowego zapalenia opon mózgowo rdzeniowych przy użyciu metody qpcr zaobserwowano już w krajach, w których z powodzeniem korzysta się z tej metody. Dodatkowo, skrócenie czasu oczekiwania na wynik do jednego dnia, w porównaniu np. z metodą izolacji (5-8 dni), może przyczynić się do uniknięcia niepotrzebnej antybiotykoterapii oraz obniżenia kosztów procedur medycznych. WNIOSKI 1. Zaprojektowana metoda real-time PCR z zastosowaniem sondy TaqMan pozwala na swoiste wykrywanie cdna różnych gatunków enterowirusów. 2. Zastosowanie metody real-time PCR w rutynowej diagnostyce zakażeń enterowirusami człowieka mogłoby pozwolić na znaczące skrócenie czasu oczekiwania na wynik badania. Podziękowania Autorzy dziękują Fundacji na Rzecz Chorych z Chorobami Krwi za pomoc podczas wykonywania części badań molekularnych w niniejszej pracy. K. Leś, M. Przybylski, T. Dzieciątkowski, G. Młynarczyk Detection of human enteroviruses with real-time PCR assay using TaqMan fluorescent probe SUMMARY Infections with human enteroviruses are common worldwide and cause a wide range of signs and symptoms. Nowadays in current diagnostics procedures older virological methods, such virus isolation in a cell cultures and seroneutralisation assay, are replaced with molecular biology tests. The aim of the study was development of real-time PCR assay for detection of human adenoviruses. DNA isolated from MK 2 cell line infected with nineteen different enterovirus strains was used for development of a qualitative real-time PCR assay using primers targeting a conserved region of the 5 UTR region and a specific TaqMan probe. The analytical sensitivity of real-time PCR assay was tested using serial dilutions of Coxackie A9 cdna in range between 10 0 and For comparison typical end-point detected RT-PCR for enterovirus detection with the same cdna dilutions was made. The

9 Nr 3 Wykrywanie RNA enterowirusów metodą real- time PCR 253 sensitivity of novel method was about ten thousand-fold higher than older one. The conclusion is that real-time PCR is very advisable in diagnostics of diseases caused with enteroviruses. The high level of sensitivity, specificity, accuracy, and rapidity provided by this assay are favorable for the use in the detection of enteroviral RNA in clinical specimens, especially from neuroinfections. PIŚMIENNICTWO 1. Abzug MJ: The enteroviruses: an emerging infectious disease? The real, the speculative and the really speculative. Adv Exp Med Biol; 2008; 609: Binduga-Gajewska I, Gut W, Wielkopolska A, Jarząbek Z: Zastosowanie metody RT-PCR i nested-pcr do wykrywania zakażeń enterowi rusami. Med Dosw Mikrobiol; 1999; 51: Binduga-Gajewska I, Gut W, Jarząbek Z: Badanie wirusologiczne udziału enterowirusów niepoliomielitycznych w zakażeniach ośrodkowego układu nerwowego w Polsce w latach Przegl Epidemiol; 2003; 57: DeBiasi R, Tyler K: Molecular methods for diagnosis of viral encephalitis. Clin Microbiol Rev; 2004; 10: Gunkey C, Ozkaya E, Yapar M i inni: Laboratory diagnosis of enteroviral infections of the central nervous system by using a nested RT-polymerase chain reaction (PCR) assay. Diagn Microbiol Infect Dis; 2003; 47: Gunson RN, Collins TC, Carman WF: Practical experience of high throughput real time PCR in the routine diagnostic virology setting. J Clin Virol; 2006; 35: Hyypiä T, Auvinen P, Maaronen M: Polymerase chain reaction for human picornaviruses, J Gen Virol; 1989; 70: Hyypiä T, Hovi T, Knowles NJ i inni: Classification of enteroviruses based on molecular and biological properties. J Gen Virol; 1997; 78: Mackay IM, Arden KE, Nitsche A: Real-time PCR in virology. Nucleic Acids Res; 2002; 30: Muir P, Kammerer U, Korn K i inni: Molecular typing of enteroviruses: current status and future requirements. Clin Microbiol Rev; 1998; 11: Oberste MS, Maher K, Kilpatrick DR i inni: Molecular evolution of the human enteroviruses: correlation of serotype with VP1 sequence and application to picornavirus classification. J Virol; 1999; 73: Petitjean J, Vabret A, Dina J: Development and evaluation of a real-time RT-PCR assay on the LightCycler for the rapid detection of enterovirus in cerebrospinal fluid specimens. J Clin Virol; 2006; 35: Rotbart HA, Hayden FG: Picornavirus infections: a primer for the practitioner. Arch Fam Med; 2000; 9: Rotbart HA: Enteroviruses. W: Clinical virology. Red. DD Richman, RJ Whitley, FG Hayden, ASM Press, Washington 2002, Sawyer MH: Enterovirus infections: diagnosis and treatment. Semin Pediatr Infect Dis; 2002; 13: Yang S, Rothman R: PCR-based diagnostics for infectious diseases: uses, limitations, and future applications in acute-care settings. Lancet Infect Dis; 2004; 4: Otrzymano: 22 VI 2010 r. Adres Autora: Warszawa, ul. Chałubińskiego 5, Katedra i Zakład Mikrobiologii Lekarskiej, Warszawski Uniwersytet Medyczny maciej@conexion.pl

10