Możliwości wykorzystania archiwalnego DNA w badaniach filogenetycznych ryb

Transkrypt

1 Uniwersytet Warmińsko-Mazurski w Olsztynie Wydział Ochrony Środowiska i Rybactwa mgr inż. Sławomir Ciesielski Możliwości wykorzystania archiwalnego DNA w badaniach filogenetycznych ryb Praca doktorska wykonana w Zakładzie Genetyki Ewolucyjnej pod kierunkiem Prof. dr hab. Mirosława Łuczyńskiego OLSZTYN 2001

2 Spis treści 1. Wstęp Materiał Materiały łuskowe Preparaty utrwalane w formalinie Pozostałości kostne Metody Izolacja DNA Łańcuchowa reakcja polimerazy Sekwencjonowanie DNA Analiza sekwencji DNA Czynności zapobiegające zanieczyszczeniom DNA Wyniki Materiały łuskowe Preparaty utrwalane w formalinie Pozostałości kostne Dyskusja Materiały łuskowe Preparaty utrwalane w formalinie Pozostałości kostne Podsumowanie Wnioski Literatura... 62

3 1. Wstęp Jednym z naczelnych zadań biologii ewolucyjnej jest wyjaśnienie, w jaki sposób rozwinął się dzisiejszy świat roślin i zwierząt. Większość cech obecnie żyjących organizmów zostało ukształtowanych w przeszłości, a na podstawie różnic między tymi cechami wnioskuje się o historycznym przebiegu zmian, które doprowadziły do dzisiejszych relacji między taksonami. Zagadnienia te wyjaśniane są poprzez analizy filogenetyczne, dzięki którym możliwe jest ukazanie powiązań nie tylko między oddzielnymi taksonami, ale również między populacjami, osobnikami a nawet między poszczególnymi genami (HILLIS i inni, 1996). W przeszłości analizy filogenetyczne przeprowadzane były prawie wyłącznie na cechach morfologicznych, fizjologicznych czy behawioralnych. Współcześnie przeprowadza się często rekonstrukcje filogenetyczne na podstawie wyników badań zróżnicowania molekularnego białek i kwasów nukleinowych (AVISE, 1994). Szczególnie sekwencjonowanie fragmentów jądrowego i mitochondrialnego DNA dostarcza ogromnej ilości danych, które z kolei stanowią podstawę dla analiz filogenetycznych. Wyniki badań molekularnych dostarczają danych, mających wiele zalet w porównaniu z wynikami badań morfologicznych. Jedną z ich podstawowych cech jest to, że dotyczą bezpośrednio struktury materiału genetycznego. Wcześniej badane cechy morfologiczne nie zawsze w sposób bezbłędny odzwierciedlały zależności między analizowanymi taksonami, wiadomo bowiem, iż wpływ na cechy fenotypowe mogą mieć chociażby warunki środowiskowe (BRIOLAY i inni, 1998). Dzięki bezpośredniemu badaniu cząsteczek DNA unika się więc niejednokrotnie formułowania błędnych wniosków filogenetycznych. Rekonstrukcja powiązań filogenetycznych na podstawie różnic w sekwencji DNA opiera się na analizie utrwalonych mutacji w obrębie badanych linii filogenetycznych. Szczególnie przydatne w tym względzie są mutacje punktowe: tranzycje (podstawienie jednej puryny w miejsce innej puryny lub podstawienie jednej pirymidyny w miejsce innej pirymidyny) i transwersje (zamiana puryny na pirymidynę lub odwrotnie) podczas gdy insercje czy delecje, chociaż prowadzą do zwiększenia 2

4 różnorodności genetycznej, niejednokrotnie uniemożliwiają identyfikację homologicznych genów, co jest warunkiem przeprowadzenia analizy filogenetycznej. (HILLIS, 1994). Szczególną cechą zmian ewolucyjnych zachodzących na poziomie molekularnym jest zależność pomiędzy czasem różnicowania się dwóch grup organizmów a dzielącymi je różnicami w budowie DNA. Niejednokrotnie zależność ta jest prostoliniowa, co może wskazywać na stałe tempo utrwalania się mutacji (SMITH, 1992). Przeprowadzone badania porównawcze sekwencji aminokwasów cytochromu c wykazały, że liczba podstawień aminokwasowych wzrasta wraz z odległością filogenetyczną porównywanych organizmów. Obserwacje te doprowadziły do postawienia hipotezy "zegara molekularnego" (ZUCKERKANDL i PAULING, 1965), według której zmiany molekularne zachodzą w stałym tempie, jakkolwiek jest ono różne dla różnych genów. Wiedząc kiedy dwa porównywane ze sobą gatunki oddzieliły się od wspólnego przodka oraz znając stopień zróżnicowania konkretnego fragmentu DNA można dokonać tzw. "kalibracji zegara molekularnego" (SMITH, 1992; SIMPSON, 1999). Pozwala to ustalić tempo dywergencji badanego fragmentu genomu, które jest charakterystyczne dla badanych gatunków. Proces rekonstrukcji powiązań filogenetycznych w oparciu o dane molekularne komplikuje między innymi fakt, że poszczególne pozycje nukleotydowe w sekwencjach DNA podlegających dywergencji mogą podlegać mutacji więcej niż jeden raz. Mimo rozwiniętych metod wnioskowania o zmianach ewolucyjnych na podstawie różnic między sekwencjami nukleotydowymi współcześnie istniejących taksonów, rozważania filogenetyczne są nadal stosunkowo spekulatywne. Zachodzące procesy ewolucyjne można by precyzyjnie opisać jedynie porównując sekwencje DNA współcześnie żyjących gatunków z odpowiednimi sekwencjami DNA ich wymarłych przodków. Dopiero niedawno udało się stwierdzić, że "archiwalne" tkanki roślin i zwierząt, liczące setki, tysiące a nawet miliony lat, często nadal przechowują w sobie informację genetyczną, którą można "odczytać" i wykorzystać w molekularnych studiach ewolucyjnych (PÄÄBO, 1993; HERRMANN i HUMMEL, 1993; COOPER i 3

5 WAYNE, 1998). Dysponując umiejętnością analizy DNA zachowanego w tkankach należących do wymarłych taksonów można bezpośrednio zmierzyć tempo ewolucji molekularnej (PÄÄBO, 1989). Ponadto sekwencje archiwalnego DNA są niejednokrotnie jedynym źródłem informacji o stanowisku systematycznym wymarłych już gatunków roślin i zwierząt (TAYLOR, 1996). Pierwsza publikacja analizująca sekwencję archiwalnego DNA ukazała się w 1984 (HIGUCHI i inni, 1984) i dotyczyła kwaggi (Equus quagga) - przedstawiciela koniowatych. Autorzy wyizolowali DNA z zasuszonego fragmentu skóry i poddali sekwencjonowaniu fragment genu I podjednostki oksydazy cytochromowej (CO I), co pozwoliło poznać stanowisko systematyczne tego gatunku. W następnych latach ukazywało się coraz więcej doniesień o możliwości wykorzystania archiwalnych tkanek w badaniach filogenetycznych. Większość prac koncentrowała się wokół zagadnień demograficznych dotyczących człowieka (STONE i STONEKING, 1993; HANDT i inni, 1994; ARNAIZ-VILLENA i inni, 1997; COOPER i inni, 1997; KRINGS i inni, 1997). Liczne publikacje dotyczą również pochodzenia i pozycji systematycznej zwierząt (COOPER i WAYNE, 1998). Wykorzystując kopalne fragmenty szkieletów udało się przybliżyć pozycję systematyczną mamuta (Mammuthus primigenius; HAGELBERG i inni, 1994; HÖSS i inni, 1994), leniwca olbrzymiego (Mylodon darwinii, HÖSS i inni, 1995), czy też antylopy błękitnej (Hippotragus leucophaeus, ROBINSON i inni, 1996). Ponadto, wykorzystując DNA zachowane w archiwalnych tkankach, możliwe było oszacowanie zmian w zróżnicowaniu genetycznym historycznej i współcześnie istniejącej populacji dzikiego królika (Oryctolagus cuniculus; HARDY i inni, 1995) oraz wilka (Canis lupus; ROY i inni, 1996). Analiza archiwalnego DNA może mieć również znaczenie aplikacyjne, co zostało ukazane w pracy COOPER A i współautorów (1996). Autorzy dowodzą, iż umiejętność odczytania informacji genetycznej z materiałów archiwalnych umotywowała reintrodukcję dzikiej kaczki na wyspie Laysan (Hawaje). W tym przypadku analiza genetyczna kości wydobytych z zastygłej lawy wulkanicznej udowodniła, że na wyspie tej przed wiekami występował omawiany gatunek kaczki. 4

6 Obecnie dzięki nowoczesnym technikom molekularnym możliwe jest badanie sekwencji DNA zachowanych w różnorakich materiałach tkankowych. Analizie genetycznej poddaje się takie tkanki jak mięśnie, kości, skóra oraz jej wytwory (na przykład włosy czy łuski, CIESIELSKI i BRZUZAN, 1999). Możliwe jest również odzyskanie informacji genetycznej z tkanek zatopionych w parafinie w celu wykonania preparatów histologicznych (GREER i inni, 1991) jak i z wykonanych już preparatów histologicznych (JACKSON i inni, 1989). Z powodzeniem udaje się izolować DNA z eksponatów muzealnych, zarówno zasuszonych jak i zakonserwowanych w alkoholu czy formalinie (SHEDLOCK i inni, 1997; WIRGIN i inni, 1997; VACHOT i MONNEROT, 1998). W zależności od sposobu konserwacji tkanek, zawarte w nich cząsteczki kwasów nukleinowych są mniej lub bardziej zdegradowane (KELMAN i MORAN, 1996). Cząsteczki DNA najlepiej zachowują się w tkankach poddanych zasuszeniu i zamrożeniu, natomiast dużo gorzej w tkankach zakonserwowanych w formalinie i w alkoholu (SHIOZAWA i inni, 1992). Analiza genetyczna archiwalnych tkanek zwierząt polega w większości przypadków na badaniu mitochondrialnego DNA (mtdna). Obecny w cytoplazmie komórek mitochondrialny DNA jest dwuniciową, kolistą cząsteczką o wielkości ± 500 par zasad (MEYER, 1993). W pojedynczej komórce może znajdować się od kilkuset do kilkunastu tysięcy mitochondriów. Każda cząsteczka mtdna składa się z 13 genów kodujących białka, 2 genów kodujących rybosomalny RNA (12S i 16S rrna) oraz 22 genów odpowiedzialnych za ekspresję transportującego RNA (trna). Białka kodowane przez genom mitochondrialny to: 7 podjednostek mitochondrialnej dehydrogenazy NADH (ND1, 2, 3, 4, 4L, 5, 6), cytochrom b, 3 podjednostki oksydazy cytochromowej c (CO I, II, III) oraz 2 podjednostki syntetazy ATP (ATP 6 i 8) (MEYER, 1993; MEYER, 1994). Ponadto w obrębie cząsteczki mtdna wyróżnia się odcinek o długości około 1000 par zasad określany jako region regulacyjny (ang. control region), którego sekwencje sprawują kontrolę nad procesami replikacji i transkrypcji mitochondrialnego DNA (CLAYTON, 1991). Schemat budowy cząsteczki mitochondrialnego DNA przedstawia Rysunek 1. 5

7 O H REGION REGULACYJNY T P F E V L L S H I Q M R G K D S O L Y CN A W Rysunek 1. Model cząsteczki mitochondrialnego DNA ryb (MEYER, 1994; zmienione). Kolorem niebieskim zaznaczono położenie genów kodujących trna, skróty oznaczają nazwy aminokwasów. O H i O L oznaczają miejsca, od których rozpoczyna się replikacja odpowiednio nici ciężkiej (H) i nici lekkiej (L). Figure 1. Piscine mitochondrial gene order (after MEYER, 1994; modified). Transfer RNA genes are shown in blue boxes, the amino acids are described by abbreviations. The origin of lagging-strand (L) synthesis is at O L, whereas the origin of leading-strand (H) is at O H. Szczególnymi własnościami genomu mitochondrialnego jest dziedziczenie go w linii żeńskiej oraz haploidalny charakter tego genomu (AVISE, 1989). Ponadto mtdna cechuje stosunkowo szybkie tempo ewolucji; ocenia się, iż mtdna ewoluuje u ssaków od 5 do 10 razy szybciej niż genom jądrowy (MEYER, 1994). Przeprowadzone do tej pory badania sugerują, że średnio tempo ewolucji genomu mitochondrialnego wynosi 1% dywergencji w ciągu jednego miliona lat (AVISE, 1989; SMITH, 1992). Ponadto tempo mutacji synonimowych (nie powodujących zmian kodowanych aminokwasów) w mitochondrialnych genach może być jeszcze dużo wyższe i osiągnąć 10% dywergencji w ciągu jednego miliona lat (MEYER, 1994). Powyższe cechy decydują o użyteczności 6

8 mitochondrialnego DNA w badaniu powiązań filogenetycznych między gatunkami oraz między populacjami danego gatunku (BILLINGTON i HEBERT, 1991; AVISE,1994; WIRGIN i WALDMAN, 1994; BRZUZAN, 2001). Najczęściej występującymi mutacjami w mitochondrialnym DNA są pojedyncze substytucje nukleotydowe, rzadziej natomiast pojawiają się insercje i delecje (MEYER, 1993). O ile pojedyncze mutacje notowane są praktycznie w każdej części genomu mitochondrialnego, to insercje i delecje stwierdzane są prawie wyłącznie w obrębie regionu regulacyjnego (BUROKER i inni, 1990; BILLINGTON i HEBERT 1991; NESBØ i inni, 1998; CIESIELSKI, 1998; BRZUZAN, 2000; BRZUZAN i CIESIELSKI, 2001). Schemat budowy regionu regulacyjnego mtdna przedstawia Rysunek 2. Jednymi z funkcjonalnych elementów tego regionu są sekwencje promotorowe transkrypcji mtrna obu nici (LSP, HSP), oraz sekwencje odpowiedzialne za przyłączenie czynnika transkrypcyjnego (TF). W części 5 regionu regulacyjnego zlokalizowane są sekwencje terminujące replikację (TAS 1, 2, 3, 4), natomiast w środkowej części tego odcinka obecne są bloki ewolucyjnie konserwatywnych sekwencji (CSBD, CSB1, CSB2, CSB3), których funkcje nie są jeszcze do końca poznane (SCHADEL i CLAYTON, 1996). TAS LSP HSP 5' 3' trna-p trna-f CSB D CSB TF Rysunek 2. Schemat budowy strukturalnej regionu regulacyjnego mtdna na przykładzie ryb siejowatych (BRZUZAN i CIESIELSKI, 2001). Region ten otoczony jest genami trna kodującymi prolinę i fenyloalaninę. W lewej części zaznaczono sekwencje terminujące transkrypcję (TAS 1, 2, 3 i 4). Bloki zaznaczone kolorem niebieskim odpowiadają regionom ewolucyjnie zakonserwowanych sekwencji (CSB D, CSB1, CSB2, CSB3). W prawej części regionu wyróżnia się sekwencje odpowiedzialne za przyłączanie się czynnika transkrypcyjnego (TF) oraz sekwencje inicjujące transkrypcję mtdna nici lekkiej (LSP) i nici ciężkiej (HSP). Figure 2. Structure of the control region in mtdna of coregonid fishes (BRZUZAN and CIESIELSKI, 2001). The control region is flanked by sequences that code for transfer RNAs (proline and phenyloalanine). The control region consists of conserved sections, including the termination associated sequences (TAS 1, 2, 3, and 4), evolutionary conserved sequences (CSB D, CSB 1, 2, 3), binding site for mitochondrial transcription factor (TF), and sites of initiation of transcription for the light and heavy strand (LSP, HSP). 7

9 Pomimo licznych elementów regulatorowych odcinek ten charakteryzuje się najszybszym tempem gromadzenia pojedynczych substytucji. Niestabilność strukturalna tego regionu sprawiła, że jest on często wykorzystywany w studiach nad zmiennością genetyczną ryb (BERNATCHEZ i inni, 1992; BROWN i inni, 1992; TINTI i inni, 1999; WANG i inni, 2000). Drugim stosunkowo często wykorzystywanym w badaniach filogenetycznych fragmentem genomu mitochondrialnego jest gen kodujący cytochrom b (ZARDOYA i MEYER, 1996; LYDEARD i ROY, 1997; BRIOLAY i inni, 1998; DURAND i inni, 1999). Cytochrom b jest białkiem wchodzącym w skład reduktazy cytochromu c enzymu łańcucha oddechowego mitochondrium. Badania zmienności aminokwasów tego białka oraz zróżnicowania nukleotydowego DNA umożliwiły wyróżnienie w obrębie tego genu regionów o większym i mniejszym stopniu zakonserwowania sekwencji (ESPOSTI i inni, 1993). Podobnie jak w przypadku innych genów mitochondrialnego DNA, w obrębie genu cytochrom b obserwuje się różne tempo gromadzenia mutacji w zależności od pozycji w kodonie, przy czym tranzycje znacznie przeważają nad transwersjami (BROWN i inni, 1982). Ponieważ tranzycje zachodzące na trzeciej pozycji kodonu nie powodują zmian w kodowanych aminokwasach, zazwyczaj w tej pozycji kodonu obserwuje się większą zmienność (LYDEARD i ROY, 1997). Tego rodzaju zmienność z powodzeniem można wykorzystać w typowaniu indywidualnych haplotypów w obrębie gatunku (DURAND i inni, 1999). Jednakże ze względu na częstość występowania mutacji synonimowych wynik analiz oddalonych filogenetycznie taksonów jest bardziej wiarygodny, gdy przeprowadza się je w oparciu o kodowane przez ten gen aminokwasy (ADACHI i HASEGAWA, 1996). Poznany charakter zmienności w obrębie genu cytochrom b czyni go użytecznym narzędziem w rozwiązywaniu wielu filogeograficznych i taksonomicznych problemów (ZARDOYA i MEYER, 1996). Przeprowadzone do tej pory studia nad archiwalnym DNA dotyczyły zazwyczaj ptaków i ssaków oraz człowieka (COOPER i WAYNE, 1998). Brakuje natomiast opracowań opisujących analizę DNA archiwalnych tkanek należących do innych grup zwierząt, w tym ryb. O ile autorowi wiadomo, do tej pory ukazało się zaledwie kilka 8

10 publikacji dotyczących możliwości badania archiwalnych DNA tej grupy kręgowców. W trzech z nich analizowana jest zmienność genetyczna całych populacji ryb, na podstawie badań DNA nabłonka kilkudziesięcioletnich zasuszonych łusek (MILLER i KAPUSCINSKI, 1997; NIELSEN i inni, 1997; MARTINEZ i inni, 2001). Kolejne dwie prace przedstawiają metody ekstrakcji kwasów nukleinowych z preparatów muzealnych ryb zakonserwowanych w formalinie (SHIOZAWA i inni, 1992; WIRGIN i inni, 1997). W 1998 roku ukazała się praca, ukazująca próbę analizy DNA z fragmentów kostnych łososi pacyficznych (BUTLER i BOWERS, 1998). Opisywano również próbę identyfikacji gatunkowej preparatów muzealnych ryb należących do rodziny Acipenseridae (DOUKAKIS i inni, 2000). Analiza archiwalnego DNA ryb może być szczególnie użyteczna zwłaszcza obecnie; w wyniku zmian warunków środowiskowych tylko w ciągu ostatniego stulecia wymarło wiele gatunków ryb, a pojedyncze okazy licznych gatunków obejrzeć można jedynie w muzeach przyrodniczych. Okazy muzealne zawierają DNA z utrwaloną w nim historią ewolucji gatunku. Umiejętność analizy DNA zakonserwowanych tkanek pozwala także ustalić powiązania filogenetyczne z gatunkami współcześnie żyjącymi oraz w uzasadnionych przypadkach zrewidować systematykę tych gatunków. Obecnie wykorzystywane techniki molekularne stwarzają również możliwość analizy DNA szczątków uzyskanych z wykopalisk archeologicznych i paleontologicznych. Fragmenty kostne takiego pochodzenia są zazwyczaj bardzo zniszczone, a tradycyjne metody morfologicznej identyfikacji gatunkowej często zawodzą. Dzięki analizie DNA zawartego w tego rodzaju tkankach możliwa jest identyfikacja gatunku, do którego pozostałości te należą (EVGRAFOV, 1994). Niewykluczone, że analiza DNA może ponadto wskazać też populację, z której dany osobnik pochodzi (COOPER i WAYNE, 1998). Analiza DNA zwartego w nabłonku zasuszonych łusek, preparatach muzealnych czy pozostałościach kostnych umożliwia poznanie informacji genetycznej o osobnikach a nawet całych populacjach zasiedlających kiedyś konkretny obszar. Tego rodzaju 9

11 informacje mogą więc być przydatne przy ewentualnych próbach restytucji różnych gatunków ryb. Główną trudnością w procesie genetycznej analizy archiwalnych tkanek jest fakt, iż zawarte w nich kwasy nukleinowe są najczęściej zdegradowane. Obecne w tego rodzaju tkankach łańcuchy DNA są najczęściej popękane i występują w odcinkach o długości rzędu kilkuset par zasad (PÄÄBO, 1993; KELMAN i MORAN, 1996). Ponadto nawet w przypadku mitochondrialnego DNA, który obecny jest w pojedynczej komórce w tysiącach kopii, liczba wyizolowanych cząsteczek DNA jest zazwyczaj ograniczona. Niezbędnym etapem badań jest więc zastosowanie łańcuchowej reakcji polimerazy (PCR ang. Polymerase Chain Reaction; Rysunek 3), umożliwiającej powielenie wybranego fragmentu DNA (MULLIS i FALOONA, 1987). Technika ta "naśladuje" zjawisko replikacji DNA zachodzące w żywych komórkach. Do powielenia określonego odcinka DNA in vitro niezbędna jest obecność tak zwanych starterów (ang. primer), czyli sztucznie zsyntetyzowanych oligonukleotydów o długości zazwyczaj około 20 nukleotydów. Startery te muszą być komplementarne do sekwencji otaczających badany fragment DNA. Aby jednak startery mogły się przyłączyć konieczne jest podniesienie temperatury najpierw do około 90 C (denaturacja nici DNA), następnie zaś obniżenie jej do C, kiedy to startery przyłączają się do pojedynczych nici zdenaturowanego, matrycowego DNA. Startery podawane są w stężeniu na tyle wysokim, że reakcja ich łączenia się z matrycą znacznie przeważa nad reakcją renaturacji, czyli powtórnego łączenia się dwóch nici matrycy DNA. Wreszcie, w temperaturze około 72 C, termostabilna polimeraza DNA syntetyzuje nowe nici DNA korzystając z wolnych nukleotydów dodanych do mieszaniny reakcyjnej. W pierwszym cyklu reakcji syntetyzowane są odcinki DNA o różnej długości. Stopniowo w mieszaninie zaczynają przeważać fragmenty powielanego DNA, ograniczone starterami. Po pierwszym cyklu uzyskujemy z jednej wyjściowej cząsteczki DNA dwie potomne cząsteczki, produktem kolejnego cyklu są już cztery cząsteczki, a po 30 cyklach wytwarzane są już miliony kopii badanego fragmentu DNA. 10

12 Denaturacja nici DNA Przyłączanie starterów 1. cykl Polimeryzacja nowych nici DNA 2. cykl 3. cykl 4. cykl 5. cykl 30. cykl Rysunek 3. Schemat łańcuchowej reakcji polimerazy (ang. Polymerase Chain Reaction, PCR). Każdy cykl reakcji składa się z trzech podstawowych etapów: a) denaturacji nici DNA, b) przyłączania jednoniciowych starterów oraz c) polimeryzacji nowych nici przy udziale termostabilnej polimerazy DNA. Typowa reakcja składa się zazwyczaj z 30 cykli. Dysponując na początku reakcji jednym fragmentem DNA, po pierwszym cyklu otrzymuje się dwie kopie, po dwóch cyklach cztery a po trzydziestu cyklach liczba kopii wynosi Figure 3. The principle of the polymerase chain reaction (PCR). Every cycle of PCR consists of three stages: a) denaturation of DNA helix, b) annealing of specific single-stranded primers, and c) polymerisation of new DNA molecules. The typical PCR reaction usually consists of 30 cycles. First cycle generates two copies, second cycle - four copies, and after thirty cycles millions of copies of target DNA are present. 11

13 Główną zaletą techniki PCR jest to, że do przeprowadzenia reakcji teoretycznie wystarcza jedna cząsteczka wyjściowego DNA. Rozwój techniki PCR znacznie ułatwił analizowanie DNA otrzymanego z silnie zdegradowanych tkanek, liczących tysiące lat (PÄÄBO, 1989; PÄÄBO, 1993). Dysponując taką techniką można liczyć na to, że jeśli w badanym preparacie znajduje się choćby jeden fragment cząsteczki DNA to może on zostać powielony. W celu poznania kolejności ułożenia poszczególnych nukleotydów w obrębie analizowanego odcinka DNA uzyskane produkty PCR poddaje się sekwencjonowaniu. Zdobyte w ten sposób informacje pozwalają wnioskować o zależnościach filogenetycznych między badanymi osobnikami czy też tworzonymi przez nie grupami (MEYER, 1993). Zależności te przedstawia się zazwyczaj w formie tak zwanego drzewa filogenetycznego, składającego się z węzłów i gałęzi. Węzeł drzewa filogenetycznego przedstawia jednostkę taksonomiczną, natomiast gałąź to relacja między dwiema jednostkami taksonomicznymi. Długość gałęzi może być odzwierciedleniem różnic między tymi jednostkami, w takim przypadku długość gałęzi będzie zależna od liczby substytucji nukleotydowych. Wyróżnia się dwa podstawowe podejścia umożliwiające konstrukcje drzew filogenetycznych. Pierwsze z nich opiera się na dystansie genetycznym między analizowanymi sekwencjami DNA. Dane liczbowe wartości tego dystansu przedstawione są w postaci macierzy, stanowiąc podstawę wielu metod umożliwiających rekonstrukcję filogenezy. Do najpopularniejszych z nich należy metoda UPGMA (ang. Unweighted Pair Group Method with Arythmetic Averages; SNEATH i SOKAL, 1973). Podstawowym założeniem tej metody jest jednakowe tempo ewolucji wzdłuż wszystkich gałęzi dendrogramu. Równie popularna jest metoda Neighbor-Joining opisana przez SAITOU i NEI (1987), opierająca się na łączeniu sąsiadujących taksonów ("węzłów drzewa"). Należy zaznaczyć, że metody oparte na dystansie genetycznym są stosunkowo proste i pozwalają w krótkim czasie uzyskać dendrogramy odzwierciedlające zależności filogenetyczne pomiędzy badanymi taksonami. 12

14 Drugie podejście stosowane do konstruowania drzew filogenetycznych, polega na wykorzystaniu danych jakościowych. Wyróżnia się tu dwie podstawowe metody konstruowania drzew filogenetycznych na podstawie sekwencji nukleotydowych (HILLIS, 1994). Prostszą z nich jest Metoda maksymalnej oszczędności (ang. Parsimony; FITCH, 1971). Pozwala ona znaleźć taki schemat powiązań molekularnych, który do wyjaśnienia ewolucji analizowanej grupy taksonów wymaga najmniejszej liczby zmian mutacyjnych. W praktyce polega to na skonstruowaniu przy pomocy odpowiedniego algorytmu matematycznego wszystkich możliwych drzew i wyborze tego, do którego skonstruowania wymagana jest najmniejsza liczba mutacji w obrębie analizowanych sekwencji DNA. Równie często wykorzystuje się Metodę maksymalnego prawdopodobieństwa (ang. Maximum Likelihood; FELSENSTEIN, 1981). Metoda ta pozwala znaleźć taki dendrogram, który z największym prawdopodobieństwem określa relacje między analizowanymi sekwencjami DNA. W metodzie tej wszystkie pozycje nukleotydowe, każdej sekwencji DNA są analizowane indywidualnie. Obliczone prawdopodobieństwa wystąpienia poszczególnych zasad na każdej pozycji nukleotydowej są sumowane, dając końcowe prawdopodobieństwo dla każdego z możliwych drzew. Ponieważ uzyskiwane wartości prawdopodobieństwa są bardzo niskie, dla ułatwienia przedstawia się je w postaci logarytmicznej. Uzyskane w ten sposób wartości logarytmiczne są ujemne, a drzewo ukazujące z największym prawdopodobieństwem zależności filogenetyczne cechuje się wartością logarytmu jak najbardziej zbliżoną do zera. Głównym celem badań było opracowanie i przedstawienie metod, umożliwiających analizę DNA zawartego w różnego rodzaju archiwalnych tkankach ryb. Uzyskane dzięki zastosowanym metodom informacje genetyczne w postaci sekwencji nukleotydowych wykorzystano w badaniu powiązań filogenetycznych na poziomie wewnątrzgatunkowym. A. Podjęto próbę wykorzystania zbioru zasuszonych łusek troci wędrownej (Salmo trutta m. trutta L.) do scharakteryzowania populacji ryb, występujących w Dunajcu w latach 19 - sześciedziesiątych. Przeprowadzone analizy udowodniły, iż badane 13

15 łuski zanieczyszczone były materiałem biologicznym należącym do innego gatunku ryb. W konsekwencji uzyskano sekwencje nukleotydowe, których analiza dowiodła, że obce tkanki należały do ryb z rodzaju Thymallus. B. Przedstawiono metody umożliwiające analizę DNA eksponatów muzealnych zakonserwowanych w formalinie. Dzięki zastosowanym metodom udało się wyizolować DNA z zakonserwowanych w formalinie tkanek pelugi (Coregonus peled G.) i sielawy (Coregonus albula L.), u której dodatkowo określono haplotyp mtdna. C. Podjęto próbę analizy DNA pozostałości kostnych z wykopalisk archeologicznych. Skoncentrowano się na szczątkach należących do leszcza (Abramis brama L.), wykazano możliwość analizy genetycznej tego rodzaju tkanek pochodzących z różnych stanowisk archeologicznych i charakteryzujących się różnym wiekiem. Uzyskane dane pozwoliły stwierdzić duże zróżnicowanie mitochondrialnego DNA tego gatunku na terenie Polski. 14

16 2. Materiał 2.1. Materiały łuskowe Łuski pochodziły z 1954 roku i należały do troci wędrownych złowionych w rzece Dunajec. Materiał ten uzyskano z Instytutu Rybactwa Śródlądowego w Olsztynie (Zakład Rybactwa Rzecznego w Żabieńcu) dzięki uprzejmości prof. dr hab. Romana Sycha. Zbiór łusek stanowiło kilkadziesiąt małych kopert, każda z nich zawierała łuski pochodzące od jednego osobnika. Każda koperta zaopatrzona była w szczegółowy opis ryby od której pochodziły łuski. Dodatkowo przeprowadzone morfologiczne badanie łusek (Dr inż. I. Borzęcka; Instytut Rybactwa Śródlądowego w Olsztynie, Zakład Rybactwa Rzecznego w Żabieniecu) potwierdziło, iż łuski te zgodnie z opisem należą do troci. Do analizy genetycznej wybrano materiał zawarty w dziesięciu kopertach, które zawierały największą liczbę łusek Preparaty utrwalane w formalinie Analizowane w pracy tkanki pochodziły z okazów ryb zgromadzonych w Muzeum Przyrodniczym im. Janiny Wengris (Katedra Zoologii; UWM w Olsztynie). Badane tkanki pochodziły od dwóch gatunków ryb siejowatych: sielawy (Coregonus albula L.) złowionej w jeziorze Klawój w 1960 roku oraz pelugi (Coregonus peled G.), która została złowiona w 1989 roku w jeziorze Maróz. W przypadku sielawy pobrano fragmenty łuków skrzelowych, natomiast w przypadku pelugi pobrano próbę tkanki mięśniowej, z okolicy grzbietowej. Obydwa preparaty zakonserwowane były w 4% formalinie. Próby tkanek przechowywano do czasu badań genetycznych w temperaturze - 20 C Pozostałości kostne Do badań przeznaczono 8 prób, które stanowiły fragmenty kostne, zidentyfikowane morfologicznie jako pozostałości leszcza (Abramis brama L.). Próby pochodziły z pięciu różnych stanowisk archeologicznych (Rysunek 4). Trzy próby (Wolin 10, Wolin 12 i Wolin 16) pozyskane były ze stanowiska archeologicznego na Wyspie Wolin (CHEŁKOWSKI i inni, 2001), dwie na stanowisku Dąbki (Dąbki 19 i Dąbki 20), położonego u brzegu jeziora Bukowo (ILKIEWICZ, 1989). 15

17 MORZE BAŁTYCKIE WOLIN DĄBKI 25 KM ŻUBRONAJĆ DUDKA BRODNICA WARSZAWA Rysunek 4. Mapa północnej Polski przedstawiająca lokalizację stanowisk archeologicznych, z których pochodziły badane szczątki kostne leszczy (Abramis brama L.). Figure 4. Location of archaeological sites, from which samples of common bream (Abramis brama L.) were collected. Trzy pozostałe pochodziły ze stanowisk: Dudka (Dudka 25; GUMIŃSKI, 1995), Żubronajć (Żubronajć 26) i ze stanowiska Brodnica (Brodnica 27). Stan zachowanych fragmentów kostnych był różny, gdyż kości od momentu ich wykopania Tabela 1. Zestawienie i opis prób wykorzystanych w badaniu. Table 1. Description of archaeological fish bone samples examined in this study. Lp POCHODZENIE I NUMER PRÓBY WIEK PRÓBY (lata) RODZAJ KOŚCI CAŁKOWITA MASA KOŚCI (g) 1 WOLIN operculum 0,95 2 WOLIN cleithrum 1,60 3 WOLIN praeoperculum 0,95 4 DĄBKI operculum 0,30 5 DĄBKI cleithrum 0,48 6 DUDKA operculum 0,22 7 ŻUBRONAJĆ pharyngeum 0,28 8 BRODNICA operculum 0,70 16

18 przechowywane były w bliżej nie określonych warunkach. W Tabeli 1 zebrano podstawowe dane, charakteryzujące analizowane pozostałości kostne, natomiast Rysunek 5 przedstawia zdjęcia tych prób, wykonane bezpośrednio przed przystąpieniem do badań cm 1 cm cm 1 cm cm 1 cm & cm 1 cm Rysunek 5. Zdjęcia analizowanych szczątków kostnych leszcza (Abramis brama L.), pochodzących z pięciu stanowisk archeologicznych. Szczegóły dotyczące poszczególnych prób przedstawione są w Tabeli 1 Figure 5. Pictures of all examined bones of common bream (Abramis brama L.) collected from various archaeological sites. The detailed description is given in Table 1. 17

19 3. Metody 3.1. Izolacja DNA Materiały łuskowe Do izolacji DNA wykorzystano 10 prób, 8 z nich stanowiły łuski (4-5 łusek na jedną próbę) a dwie były wyciętymi skrawkami kopert z widocznym śladem zaschniętego nabłonka i śluzu (Rysunek 6). Materiał umieszczano w próbówce 1,5 ml, do której dodawano 1 ml roztworu trawiącego (100mM Tris-HCl; 10mM EDTA; ph 8.0; WHITMORE i inni, 1992; 0,5 mg proteinazy K; 0,25 mg DTT). Inkubacja trwała 24 godziny w temperaturze 65 C. W ciągu tego czasu próby były kilkakrotnie silnie wstrząsane. DNA ekstrahowane było raz fenolem i raz mieszaniną chloroformu i alkoholu izoamylowego (24:1). Po ekstrakcji górną fazę przenoszono do nowych probówek zawierających 1 ml izopropanolu. Po 15 minutach strącania próby były wirowane przez 15 minut ( g). Osad rozpuszczano w 70 % etanolu i ponownie poddawano wirowaniu, po czym osad DNA osuszano z alkoholu i zawieszano w sterylnej wodzie. Do czasu amplifikacji DNA było przetrzymywane w temperaturze - 20 C. Rysunek 6. Zdjęcie przedstawiające wewnętrzną stronę koperty, służącej do przechowywania pobranych łusek ryb. Przerywaną linią zaznaczono fragment z zaschniętym nabłonkiem i śluzem, który wykorzystano do izolacji DNA. Figure 6. The internal side of envelope, that was used to store the fish scales. Marked fragment of the envelope with the dry slime on it was cut out and used for DNA extraction 18

20 Preparaty utrwalane w formalinie Do izolacji DNA metodą opisaną przez SHIOZAWĘ i współautorów (1992) wykorzystano fragmenty łuków skrzelowych (o masie 0,4 g) sielawy oraz fragment tkanki mięśniowej (o masie 0,35 g) pelugi. Pobrane tkanki przemyto w buforze TE9 (500 mm TRIS, 20mM EDTA, 10mM NaCl, ph 9.0; SHIOZAWA i inni 1992) przez 24 godziny w temperaturze pokojowej. Następnie tkanki przeniesiono do 1,5 ml probówek zawierających 1 ml roztworu trawiącego [bufor TE9, 4 mg proteinazy K, 10 mg soli sodowej siarczanu dodecylu (SDS)]. Inkubacja trwała zazwyczaj 72 godziny i przebiegała w temperaturze 40 C. Po 24 i 48 godzinach do każdej probówki dodawano 4 mg proteinazy K i 10 mg SDS. Podczas inkubacji próby były intensywnie wstrząsane kilka razy dziennie. Strawione tkanki ekstrahowane były dwa razy fenolem i raz mieszaniną chloroformu i alkoholu izoamylowego (24:1). Po ekstrakcji górną fazę przenoszono do nowych probówek zawierających 0,5 ml roztworu strącającego, który był mieszaniną izopropanolu i 3M octanu sodowego (5:1). Po 15 minutach strącania próby przenoszono do wirówki i poddawano wirowaniu przez 15 minut ( g). Osad rozpuszczano w 70 % etanolu i probówki ponownie wirowano, po czym osad DNA osuszano z alkoholu i zawieszano w sterylnej wodzie. Do czasu amplifikacji DNA było przetrzymywane w temperaturze - 20 C. Druga z zastosowanych metod izolacji DNA opisana została przez SHEDLOCK'A i współautorów (1997). Tą metodą izolowano DNA jedynie z tkanki mięśniowej pelugi. Wstępny etap izolacji DNA polegał na przemywaniu zakonserwowanej w formalinie tkanki w 10 ml buforu GTE (100 mm glicyny, 10 mm tris- HCl, ph 8.0, 1mM EDTA; SHEDLOCK i inni, 1997). Proces ten odbywał się w temperaturze pokojowej, i polegał na ciągłym wstrząsaniu tkanki w buforze. Po 24 i 48 godzinach bufor GTE wymieniano na świeży, a po 72 godzinach bufor usunięto a tkankę wysuszono. Następnym etapem było trawienie tkanki w 0,5 ml buforu (1% SDS, 25 mmtris-hcl, ph 7,5, 100 mm EDTA; SHEDLOCK i inni, 1997) przez 24 godziny w temperaturze 40º C. Na początku do tego roztworu dodano 50 μl proteinazy K (20 mg/ml) oraz 20 μl DTT (8 mg/ml), po 19