Monolisa HCV Ag Ab ULTRA

Transkrypt

1 Monolisa HCV Ag Ab ULTRA 1 płytka 96 testów płytek 480 testów PRZESIEWOWY TEST IMMUNOENZYMATYCZNY DO WYKRYWANIA ZAKAŻENIA HCV (WIRUSA ZAPALENIA WĄTROBY TYPU C) W LUDZKIEJ SUROWICY / OSOCZU Wyrób do diagnostyki in vitro Kontrola jakości producenta Wszystkie produkty są wytwarzane i wprowadzane do obrotu przez Bio-Rad podlegają naszemu systemowi jakości poczynając od momentu otrzymania surowców aż do chwili wprowadzenia do obrotu ostatecznego produktu komercyjnego. Każda seria odczynników jest poddana kontroli jakości i jest dopuszczona do sprzedaży po spełnieniu określonych kryteriów jakości. Dane dotyczące procesu produkcji oraz kontroli jakości każdej serii produkcyjnej są archiwizowane u producenta.

2 SPIS TREŚCI 1 - ZASTOSOWANIE TESTU 2 - ZASADA TESTU 3 - SKŁAD ZESTAWU 4 - INNE NIEZBĘDNE MATERIAŁY 5 - HIGIENA I BEZPIECZEŃSTWO PRACY 6 - ŚRODKI OSTROŻNOŚCI 7 - PRÓBKI 8 - REKONSTYTUCJA - PRZECHOWYWANIE - TRWAŁOŚĆ ODCZYNNIKÓW 9 - PROCEDURA 10 - ADAPTACJA SYSTEMU 11 - OBLICZENIE I INTERPRETACJA WYNIKÓW 12 - SPEKTROFOTOMETRYCZNA WERYFIKACJA PIPETOWANIA PRÓBKI I ODCZYNNIKA 13 - CHARAKTERYSTYKA TESTU 14 - OGRANICZENIA TESTU 15 - LITERATURA 2

3 1 - ZASTOSOWANIE TESTU Monolisa HCV Ag Ab ULTRA jest testem jakościowym immunoenzymatycznym, przeznaczonym do wykrywania zakażenia wirusem HCV, polegającym na wykrywaniu antygenu kapsydowego i przeciwciał powstających w odpowiedzi na zakażenie wirusem zapalenia wątroby typu C w ludzkiej surowicy lub osoczu. 2 - ZASADA TESTU W teście Monolisa HCV Ag Ab ULTRA mikropłytka - faza stała została opłaszczona: Przeciwciałem monoklonalnym przeciwko białkowemu antygenowi kapsydu wirusa hepatitis C. Dwoma rekombinowanymi białkami, wytwarzanymi przez komórki E.coli, pochodzącymi z regionu NS3: genotyp 1 i 3a. Jednym rekombinowanym antygenem z regionu niestrukturalnego NS4. Zmutowanym peptydem ze strukturalnego rejonu kapsydu, kodowanego przez genom wirusowy. Jako koniugaty zastosowano: Koniugat 1 (R6): Biotynylowane mysie przeciwciało monoklonalne skierowane przeciwko kapsydowi wirusa hepatitis C. Przeciwciało to nie reaguje ze zmutowanym peptydem kapsydowym wirusa, opłaszczonym na mikropłytce. Koniugat 2 (R7): Mysie przeciwciała przeciwko ludzkim IgG, znakowane peroksydazą i streptawidyną. Wykonanie testu składa się z następujących etapów: 1) Naniesienie do studzienek koniugatu 1 oraz próbek i surowic kontrolnych. Gdy w próbce występują przeciwciała anty HCV, zwiążą się one z antygenami na fazie stałej oraz, gdy w próbce jest obecny antygen kapsydu wirusa hepatitis C, zostanie on związany z fazą stałą przez opłaszczone na niej przeciwciała monoklonalne i przez biotynylowane przeciwciała monoklonalne przeciwko kapsydowi wirusa (koniugat 1). 2) Po inkubacji w temperaturze 37 C przez 90 minut i etapie płukania następuje dodanie znakowanych peroksydazą przeciwciał przeciwko ludzkim IgG i streptawidyny z peroksydazą (koniugat 2). Koniugat streptawidyna/peroksydaza reaguje z biotynylowanymi monoklonalnymi przeciwciałami przeciwko antygenowi kapsydu wirusa hepatitis C, związanymi z fazą stałą w poprzednim etapie. Koniugat przeciwciał przeciwko ludzkim IgG z peroksydazą zwiąże się z przeciwciałami anty-hcv, które związały się z fazą stałą w poprzednim etapie. 3) Po inkubacji w temperaturze 37 C przez 30 minut, nie związany koniugat zostaje usunięty podczas płukania, a kompleks antygenu z przeciwciałem, zostaje wykryty po dodaniu substratu. 4) Po 30 minutach następuje zahamowanie reakcji i spektrofotometryczny odczyt absorbancji przy długości fali 450/ nm. Pomiar absorbancji próbki mówi o obecności lub braku przeciwciał anty-hcv lub/i antygenu kapsydowego HCV. Intensywność barwy jest proporcjonalna do ilości przeciwciał lub antygenu, związanego z fazą stałą. 3

4 3 - SKŁAD ZESTAWU Oznaczenie Charakterystyka odczynnika Opakowanie 1 płytka 5 płytek R1 MIKROPŁYTKA 12 pasków po 8 studzienek opłaszczonych przeciwciałami 1 5 monoklonalnymi przeciwko kapsydowi wirusa hepatitis C oraz oczyszczonymi rekombinowanymi antygenami i zmutowanym peptydem kapsydu wirusa HCV R2 BUFOR PŁUCZĄCY (20x) Bufor Tris NaCl, ph 7.4 Konserwant: Proclin 300 (0.04%) 70 ml 235 ml R3 R4 R5a R5b KONTROLA UJEMNA Bufor Tris HCl, zawierający BSA Konserwant: Proclin 300 (0.1%) KONTROLA DODATNIA Ludzka surowica zawierająca przeciwciała anty-hcv, ujemna pod względem antygenu HBs oraz przeciwciał anty-hiv1 i anty-hiv2 rozcieńczona w buforze Tris HCl zawierającym BSA, inaktywowana fotochemicznie Konserwant: Proclin 300 (0.1%) DODATNIA KONTROLA ANTYGENU Dodatnia kontrola antygenu (syntetyczny peptyd kapsydu) ROZCIEŃCZALNIK ANTYGENU Rozcieńczalnik antygenu dla R5a. Woda z Proclin 300 (0.5%) R6 KONIUGAT 1 Mysie biotynylowane przeciwciała monoklonalne przeciwko antygenowi kapsydowemu HCV. Barwa purpurowa. Konserwant: Azydek sodu (< 0.1%), Cosmocil 0.025% R7 KONIUGAT 2 Znakowane peroksydazą mysie przeciwciała przeciwko ludzkim IgG i streptawidyna/peroksydaza. Barwa zielona. Konserwant: Proclin 300 (0.5%) R8 BUFOR DO SUBSTRATU PEROKSYDAZY Roztwór kwasu cytrynowego i octanu sodu, ph 4.0, zawierający H 2O 2 (0.015%) i DMSO (4%) R9 CHROMOGEN Roztwór zawierający czterometylobenzydynę (TMB) R10 ROZTWÓR ZATRZYMUJĄCY 1 N kwas siarkowy 4 - INNE NIEZBĘDNE MATERIAŁY 1 ml 1.5 ml sqf 1 ml 1 ml 15 ml 15 ml 60 ml 5 ml 28 ml 1 ml 3 ml sqf 1 ml 1 ml 2 fiolki 2 x 30 ml 2 fiolki 2 x 30 ml 2 fiolki 2 x 60 ml 2 fiolki 2 x 5 ml 3 fiolki 3 x 28 ml Woda destylowana lub dejonizowana Podchloryn sodu (wybielacz) i dwuwęglan sodu Bibuła Rękawiczki jednorazowe Okulary ochronne Próbówki jednorazowe Pipety automatyczne lub półautomatyczne, regulowane lub o stałej pojemności, pobierające 50 µl, 80 µl, 100 µl, 200 µl i 1 ml. Cylindry miarowe na 10 ml, 200 ml i 1000 ml Worteks Płuczka mikropłytek: manualna, półautomatyczna* lub automatyczna * Łaźnia wodna z termostatem lub inkubator mikropłytek* o temperaturze 37 ± 1 C Pojemnik na materiał zakaźny i zanieczyszczone odpady Czytnik mikropłytek* z filtrami 490,620,450/ 620 do 700 nm * Informacji w sprawie wyposażenia w sprzęt udzieli serwis techniczny BioRad 5 - HIGIENA I BEZPIECZEŃSTWO PRACY Wszystkie odczynniki zestawu służą do diagnostyki in vitro oraz do stosowania przez specjalistów. Test ten powinien być stosowany przez odpowiednio przeszkolony personel laboratorium, który zna procedury i potencjalne zagrożenia. Należy nosić odpowiednią odzież ochronną, włącznie z fartuchem, 4

5 okularami, jednorazowymi rękawiczkami (zalecane są syntetyczne rękawiczki nielateksowe). Należy stosować zasady Dobrej Praktyki Laboratoryjnej. Należy dokładnie umyć ręce po wykonaniu testu. Nie pipetować ustami. Kontrolna surowica dodatnia R4 została inaktywowana fotochemicznie. Materiał pochodzenia ludzkiego, używany do przygotowania kontroli dodatniej (R4), był ujemny pod względem antygenu powierzchniowego wirusa hepatitis B (HBs Ag) i przeciwciał przeciwko ludzkim wirusom niedoboru odporności (anty-hiv1 i anty-hiv2). Ponieważ nie ma metod absolutnie wykluczających obecność czynników zakaźnych, odczynniki pochodzące z materiału ludzkiego oraz badane próbki powinny być traktowane jako materiał potencjalnie zakaźny. Wszystkie materiały mające kontakt z próbkami i odczynnikami pochodzenia ludzkiego oraz roztwór płuczący, należy traktować jako potencjalnie zakaźne. Unikać rozlania próbek i zawierających próbki odczynników. Zanieczyszczone powierzchnie zmyć 10% roztworem podchlorynu. Jeśli nastąpiło zanieczyszczenie kwasem, należy go najpierw zneutralizować dwuwęglanem sodu, następnie zmyć powierzchnię wybielaczem i wysuszyć bibułą. Materiał używany do czyszczenia wyrzucić do pojemnika na odpady. Próbki, odczynniki pochodzenia ludzkiego i materiały zanieczyszczone biologicznie dekontaminować przed wyrzuceniem: - przez moczenie w 5% podchlorynie sodu (1 objętość podchlorynu na 10 objętości zanieczyszczonego płynu lub wody) przez 30 minut, - lub przez autoklawowanie w temperaturze 121 C, przez co najmniej 2 godziny. UWAGA: Nie autoklawować roztworów zawierających podchloryn sodu. Należy unikać kontaktu skóry i błon śluzowych z buforem do substratu, chromogenem i roztworem zatrzymującym. Karta charakterystyki substancji jest dostępna na życzenie. Zawsze neutralizować i/lub autoklawować roztwory i inne płyny zawierające materiał biologiczny przed wylaniem do zlewu. Niektóre odczynniki są konserwowane azydkiem sodu. Związek ten może reagować z miedzią i ołowiem, tworząc azydki metali o właściwościach wybuchowych. Aby zapobiec akumulacji azydku w zlewie i rurach, po wylaniu zinaktywowanych odczynników zawierających azydek spłukać zlew dużą ilością wody. Niektóre odczynniki zawierają: ProClin 300 (0.04%, 0.1% i/lub 0.5%) Xi - PRODUKT DRAŻNIĄCY R43: Może wywołać uczulenie w kontakcie ze skórą. S28-37: W razie kontaktu ze skórą, szybko przemyć dużą ilością wody z mydłem. Nakładać odpowiednie rękawice. Karta charakterystyki substancji (MSDS) jest dostępna na życzenie 6 - ŚRODKI OSTROŻNOŚCI Uzyskanie prawidłowego wyniku zależy od przestrzegania zasad Dobrej Praktyki Laboratoryjnej: Nazwa testu, oraz specjalny numer identyfikacyjny danego testu są podane na obramowaniu każdej mikropłytki. Ten sam numer identyfikacyjny znajduje się też na każdym pasku Monolisa HCV Ag-Ab ULTRA : Specific ID number = 55. Sprawdź specjalny numer identyfikacyjny przed każdym użyciem testu, jeżeli numeru identyfikacyjnego brak lub różni się od podanego powyżej, paska nie należy używać Nie używać odczynników po upływie terminu przydatności. Podczas jednego oznaczenia używać wyłącznie odczynników o tym samym numerze serii. UWAGA: Podczas danego oznaczenia można używać odczynników z innej ale identycznej serii w przypadku: roztworu płuczącego (R2, oznaczonego: 20x na zielono), buforu do peroksydazy (R8, oznaczonego: TMB buf na niebiesko), chromogenu (R9, oznaczonego: TMB 11x na purpurowo) oraz roztworu zatrzymującego reakcję (R10, oznaczonego: 1N na czerwono) Odczynników tych można używać w niektórych innych testach Bio-Rad. Ponadto, prawidłowo rekonstytuowany roztwór płuczący (R2, oznaczony: 20x na zielono) może być używany wymiennie z dwoma innymi roztworami płuczącymi obecnymi w zestawach testowych firmy Bio-Rad (R2, oznaczony: 10x na niebiesko lub 10x na pomarańczowo); pod warunkiem stosowania jednego rodzaju buforu w serii oznaczeń. Szczegółowych informacji udzieli serwis techniczny. Przed użyciem przenieść odczynniki w celu stabilizacji na 30 minut do temp. pokojowej. Unikać zanieczyszczenia podczas rekonstytucji odczynników. Nie wykonywać testu w obecności reaktywnych par związków (zasadowych, kwasów i aldehydów) oraz kurzu, mogących wpływać na aktywność enzymatyczną koniugatu. Używać dobrze umytego i wypłukanego wodą destylowaną szkła, lub, co jest preferowane, materiałów jednorazowych. Nie dopuszczać do wysuszenia mikropłytki pomiędzy etapem płukania a dodawaniem kolejnego odczynnika. 5

6 Reakcja enzymatyczna jest bardzo wrażliwa na działanie jonów metali. Unikać kontaktu elementów metalowych z roztworami substratu i koniugatu. Roztwór wykrywający reakcję (bufor do substratu + chromogen) powinien mieć barwę różową. Zmiana tej barwy wkrótce po rekonstytucji świadczy o nie przydatności roztworu do użycia. Roztwór należy przygotowywać w czystym jednorazowym plastikowym lub w szklanym pojemniku, przepłukanym 1N kwasem solnym, a następnie wodą destylowaną i wysuszonym. Roztwór należy przechowywać w ciemności. Do każdej badanej próbki zmieniać końcówkę pipety automatycznej. Płukanie studzienek jest istotnym etapem procedury; należy przestrzegać przewidzianych cykli płukania, oraz zwracać uwagę, czy studzienki są prawidłowo napełniane i całkowicie opróżniane. Nieprawidłowe płukanie jest przyczyną błędnych wyników. Nigdy nie używać tego samego pojemnika do nanoszenia koniugatu i roztworu substratu. 7 - PRÓBKI Próbki krwi należy pobierać zgodnie z rutynową procedurą. Oznaczenie powinno być wykonywane z nierozcieńczonej surowicy lub osocza, pobranego na antykoagulant (EDTA, cytrynian, ACD). Jak najszybciej oddzielić surowicę lub osocze od czerwonych krwinek lub skrzepu, aby zapobiec hemolizie. Próbki z widocznymi cząstkami organicznymi należy odwirować przed oznaczeniem. Cząstki lub agregaty fibryny w próbce mogą być przyczyną fałszywie dodatnich wyników. Jeśli test będzie wykonany w ciągu 7 dni, próbki można przechować w temperaturze +2-8 C. Jeśli test będzie wykonany później, należy je zamrozić w temp. -20 C. Unikać rozmrażania i ponownego zamrażania próbek. Do transportu próbki (najlepiej zamrożone) należy zapakować zgodnie z przepisami określającymi zasady przewożenia materiałów zakaźnych. NIE UŻYWAĆ PRÓBEK ZANIECZYSZCZONYCH, HIPERLIPEMICZNYCH ANI SILNIE ZHEMOLIZOWANYCH UWAGA: Na oznaczenie nie wywiera wpływu obecność w surowicy do 90 g/l albuminy, 50 µg/ml biotyny, 100 mg/l bilirubiny, poziom lipemii odpowiadający 36 g/l trioleiny, ani hemoliza wynosząca do 87 g/l hemoglobiny. Próbki ujemne, próbki dodatnie pod względem przeciwciał anty-hcv i antygenu HCV były oznaczane przed i po ogrzaniu do temperatury 56 C przez 30 minut i po 3 cyklach zamrażania / rozmrażania. W żadnym przypadku nie wpłynęło to na wykrycie przeciwciał przeciwko wirusowi HCV. Ogrzanie próbki spowodowało znaczne obniżenie wartości absorbancji przy wykrywaniu antygenu w teście Monolisa HCV Ag- Ab ULTRA. 8 - REKONSTYTUCJA ODCZYNNIKÓW TRWAŁOŚĆ - PRZECHOWYWANIE Przed użyciem odczynniki zestawu Monolisa HCV Ag Ab ULTRA przenieść w celu stabilizacji na 30 minut do temperatury pokojowej. 1. Odczynniki gotowe do użycia: Mikropłytka (R1) Każda ramka zawierająca 12 pasków zapakowana jest w torebkę z zamknięciem strunowym. Torebkę należy przeciąć nożyczkami lub skalpelem cm powyżej zamknięcia. Otworzyć opakowanie, wyjąć potrzebną liczbę pasków. Pozostałe paski umieścić w torebce. Torebkę należy szczelnie zamknąć i przechowywać w temperaturze +2-8 C. Koniugat 1: gotowy do użycia (R6) Przed użyciem wymieszać przez odwracanie. Koniugat 2: gotowy do użycia (R7) Przed użyciem wymieszać przez odwracanie. 2. Odczynniki do rekonstytucji Bufor płuczący (R2) Rozcieńczyć wodą destylowaną w stosunku 1:20. Wymieszać. Przygotować 800 ml na jedną płytkę zawierającą 12 pasków. Roboczy roztwór substratu (R8 + R9) Rozcieńczyć stężony roztwór chromogenu (R9) w stosunku 1:11 w buforze do substratu (R8) (np. 1 ml odczynnika R ml odczynnika R8). 10 ml roztworu potrzeba i wystarcza dla 1 do 12 pasków. Wymieszać. Roboczy roztwór dodatniej kontroli antygenu (R5a + R5b) Zawartość fiolki z rozcieńczalnikiem R5b przelać do fiolki z liofilizowanym R5a. Zamknąć fiolkę i pozostawić na 10 minut, od czasu do czasu mieszając przez odwracanie. 3. Trwałość Zestaw przechowywać w temperaturze +2-8 C. Każdy z odczynników, przechowywany w tej temperaturze, może być wykorzystywany do daty ważności podanej na opakowaniu (z wyjątkiem specjalnych zaleceń). R1: Po otwarciu torby, paski mikropłytki przechowywane w szczelnie zamkniętej torbie, w temperaturze +2-8 C, mogą być wykorzystywane przez miesiąc. 6

7 R2: Rozcieńczony bufor płuczący może być przechowywany w temperaturze C przez dwa tygodnie. Stężony bufor płuczący (R2) może być przechowywany w temperaturze C. R5a+R5b: Roboczy preparat dodatniej kontroli antygenu może być przechowywany w temperaturze +2-8 C przez miesiąc, a w temperaturze -20 C przez dwa miesiące (rozmrażany do 5 razy po zamrożeniu w temperaturze - 20 C). R8+R9: Po rekonstytucji, odczynnik przechowywany w ciemności, w temperaturze pokojowej ( C) może być używany przez 6 godzin. 9 - PROCEDURA Oznaczenie należy wykonać ściśle wg opisanej procedury. Aby zapewnić walidację wyników, do każdej serii oznaczeń należy włączać kontrolę ujemną i dodatnią. Należy przestrzegać zasad Dobrej Praktyki Laboratoryjnej. Wykonanie 1. Należy ustalić rozkład używanych studzienek. 2. Przygotować rozcieńczony roztwór płuczący (rozcieńczony R2) i roboczy roztwór dodatniej kontroli antygenu (R5a + R5b). 3. Wyjąć z torebki ramkę i potrzebną liczbę pasków (R1). 4. Nanieść kolejno, bez uprzedniego płukania mikropłytki: µl koniugatu (R6) do każdej studzienki µl kontroli ujemnej (R3) do studzienki A1 50 µl dodatniej kontroli przeciwciał (R4) do studzienek B1, C1, D1 50 µl dodatniej kontroli antygenu (R5a + R5b) do studzienki E1 50 µl próbki 1 do studzienki F1, 50 µl próbki 2 do studzienki G1, etc... Wymieszać zawartość studzienek przez co najmniej 3 aspiracje pipetą lub wytrząsanie mikropłytki przez 5 sekund. Jeśli czas nanoszenia próbek przekracza 10 minut, zaleca się naniesienie kontroli ujemnej i dodatniej po dodaniu próbek. Zależnie od wykorzystywanego systemu, możliwe jest modyfikowanie pozycji kontroli i rozkładu nanoszonych odczynników. N.B.: Po dodaniu próbek, studzienki zawierające próbki (lub kontrole) zmieniają barwę z purpurowej na niebieską. Można zweryfikować obecność w studzienkach próbek i koniugatu przez odczyt spektrofotometryczny przy 620 nm (patrz rozdział 12: WERYFIKACJA SPEKTROFOTOMETRYCZNA PIPETOWANIA PRÓBKI I ODCZYNNIKA). 5. Zakryć szczelnie mikropłytkę folią adhezyjną. 6. Inkubować mikropłytkę w łaźni wodnej z termostatem lub w inkubatorze mikropłytek: przez 90 ± 5 minut w temp. 37 C ± 1 C. 7. Zdjąć folię adhezyjną. Zaaspirować zawartość studzienek do pojemnika na płynne odpady. Do każdej studzienki dodać minimum ml roztworu płuczącego. Zaaspirować ponownie. Powtórzyć etap płukania 4 razy (wykonać co najmniej 5 cykli płukania) Pozostała objętość płynu nie powinna przekraczać 10 µl. (W razie potrzeby osuszyć odwróconą mikropłytkę na bibule.) 8. Szybko nanieść do wszystkich studzienek po 100 µl roztworu koniugatu 2 (R7). Roztwór delikatnie wstrząsnąć przed użyciem. Zakryć mikropłytkę nową folią i inkubować: przez 30 ± 5 minut w temp. 37 C ± 1 C. N.B.: Koniugat ma barwę zieloną. Można zweryfikować jego obecność w studzienkach przez odczyt spektrofotometryczny przy 620 nm (patrz rozdział 12: WERYFIKACJA SPEKTROFOTOMETRYCZNA PIPETOWANIA PRÓBKI I ODCZYNNIKA). 9. Zdjąć folię. Zaaspirować zawartość studzienek i wykonać 5 cykli płukania jak powyżej. 10. Przygotować roztwór substratu (patrz rozdział 8, odczynnik (R8 + R9). 11. Szybko nanieść do wszystkich studzienek po 80 µl roztworu substratu (R8+R9), przygotowanego bezpośrednio przed użyciem. Pozostawić reakcję w ciemności na 30 ± 5 minut w temperaturze pokojowej (18-30 C). Nie zakrywać folią adhezyjną. N.B.: Dodanie substratu, który ma barwę różową, jest kontrolowane wizualnie: widać wyraźną różnicę pomiędzy pustą studzienką a studzienką zawierającą różowy roztwór (w celu weryfikacji automatycznej patrz rozdział 12: WERYFIKACJA SPEKTROFOTOMETRYCZNA PIPETOWANIA PRÓBKI I ODCZYNNIKA). 12. Zatrzymać reakcję enzymatyczną przez dodanie do każdej studzienki 100 µl roztworu zatrzymującego (R10). Roztwór ten dodawać w tej samej kolejności jak substrat do reakcji barwnej. Wymieszać zawartość studzienki. N.B.: Dodanie roztworu zatrzymującego, który jest bezbarwny, jest kontrolowane wizualnie. Po dodaniu tego roztworu znika różowa barwa substratu w studzienkach próbek ujemnych, natomiast studzienki z próbkami dodatnimi zmieniają barwę z niebieskiej na żółtą. 7

8 13. Wytrzeć spód mikropłytki i po upływie co najmniej 4 minut od zatrzymania reakcji, w ciągu 30 minut zmierzyć gęstość optyczną (przy długości fali 450 / nm) każdej studzienki. 14. Przed opisem wyników sprawdzić zgodność kolejności odczytu z ustalonym na początku rozkładem studzienek ADAPTACJA SYSTEMU PŁUKANIE: Należy dokładnie przestrzegać opisanej procedury płukania, aby otrzymać optymalne właściwości testu. W przypadku niektórych aparatów trzeba zwiększyć liczbę cykli płukania, aby zachować akceptowany poziom tła OBLICZENIE I INTERPRETACJA WYNIKÓW Obecność lub brak przeciwciał anty-hcv lub/i antygenu kapsydowego HCV określa porównanie absorbancji danej próbki z obliczoną wartością cut-off. 1. Obliczenie średniej absorbancji dla kontroli dodatniej (ODR4) Przykład: Kontrola dodatnia R4 Próbka Gęstość optyczna B C D Razem całkowita gęstość optyczna Średnia ODR4 = = = Obliczenie wartości granicznej cut-off (CO) Średnia ODR4 CO = Przykład: Średnia wartość OD R4 = CO = = Kryteria walidacji testu: a) Dla kontroli ujemnej R3: wartość absorbancji musi być mniejsza niż: O.D. cut off x 0.6. b) Dla kontroli dodatniej przeciwciał R4: Średnia wartość absorbancji musi być wyższa lub równa i niższa lub równa Jeśli jedna z kontroli dodatniej przeciwciał wykazuje wartość absorbancji o 30% przekraczającą średnią, należy pominąć tę wartość i do obliczeń użyć dwóch pozostałych. c) Dla roboczego roztworu kontroli dodatniej antygenu (R5a + R5b): Wartość absorbancji musi być wyższa niż Test należy powtórzyć, jeśli kontrola ujemna R3, roboczy roztwór kontroli dodatniej antygenu (R5a + R5b) i/lub więcej niż jedna kontrola dodatnia R4 wykazują wartości wykraczające poza limity podane powyżej. 4. Interpretacja wyników Próbki o absorbancji poniżej wartości granicznej cut-off są ujemne w teście Monolisa anty-hcv Ag Ab ULTRA. Wyniki tuż poniżej wartości cut-off (OD cut off - 10% < OD próbki < OD cut-off) należy interpretować ostrożnie (zaleca się powtórzenie oznaczenia takich próbek w duplikacie, o ile pozwala na to system oraz procedury laboratoryjne). Próbki o absorbancji równej lub wyższej niż wartość cut-off, zostają uznane za początkowo dodatnie i przed ostateczną interpretacją muszą być ponownie oznaczone w duplikacie. Jeśli po powtórzeniu oznaczenia próbki początkowo dodatniej, wartość absorbancji podczas drugiego lub trzeciego pomiaru jest większa lub równa wartości cut-off, próbka zostaje uznana za dodatnią w teście 8

9 Monolisa anty-hcv Ag Ab ULTRA. Jeśli obie wartości są niższe niż cut-off, próbka zostaje uznana za ujemną SPEKTROFOTOMETRYCZNA WERYFIKACJA PIPETOWANIA PRÓBKI I ODCZYNNIKA (OPCJA) WERYFIKACJA PIERWSZEGO ETAPU: PIPETOWANIE KONIUGATU 1 (R6) I PRÓBKI Obecność koniugatu 1 (R6) i próbek w studzienkach można potwierdzić za pomocą pomiaru spektrofotometrycznego przy długości fali 620 nm. Wartość OD studzienek zawierających koniugat 1 (R6) i próbkę musi być wyższa niż UWAGA: Po dodaniu próbki, koniugat 1 (R6) zmienia barwę z purpurowej na niebieską. WERYFIKACJA DRUGIEGO ETAPU: OBECNOŚĆ KONIUGATU 2 (R7) Koniugat 2 (R7) ma barwę zieloną. Obecność koniugatu (R7) w studzienkach można potwierdzić przez pomiar spektrofotometryczny przy długości fali 620 nm: Wartość OD każdej studzienki powinna być wyższa niż Wartość niższa wskazuje na niedostateczne dodanie koniugatu. WERYFIKACJA PIPETOWANIA ROZTWORU SUBSTRATU Można zweryfikować dodanie różowego roztworu substratu za pomocą pomiaru spektrofotometrycznego gęstości optycznej studzienek przy długości fali 490 nm. Prawidłowa wartość powinna być wyższa od Wartość niższa wskazuje na niedostateczne dodanie roztworu substratu. Widać wyraźnie różnicę pomiędzy bezbarwnymi pustymi studzienkami, a studzienkami różowymi po naniesieniu roztworu substratu. 13 CHARAKTERYSTYKA TESTU A SWOISTOŚĆ Swoistość testu Monolisa HCV Ag-Ab ULTRA określono, testując próbki pobrane od dawców krwi i od pacjentów, oraz wykonując rutynowe badania w różnych ośrodkach. Swoistość badana dla dawców krwi Badania prowadzono w 3 ośrodkach. Badano surowice od stałych i nowych dawców krwi. Ośrodek Rungis B.B Bordeaux B.B Dawcy z Montpellier Ogółem Francja Francja Francja Liczba badanych próbek Liczba próbek dodatnich po powtórzeniu Z 7161 próbek od dawców krwi, dla 12 próbek uzyskano wynik dodatni po powtórzeniu w teście Monolisa HCV Ag-Ab ULTRA, wykonanym i zinterpretowanym zgodnie z rekomendacjami zawartymi w instrukcji, lecz nie zostały one potwierdzone jako HCV-dodatnie metodą PCR lub w teście HCV PLUS Deciscan Immunoblott. Swoistość dla grupy dawców krwi określono na 99.83% (99.71% do 99.91%, w przedziale ufności 95%). Swoistość badana dla pacjentów hospitalizowanych W 2 ośrodkach oznaczono 469 bieżących próbek, pobieranych od hospitalizowanych pacjentów. 440 próbek było ujemnych w rutynowo wykonywanym teście HCV Ab, zarejestrowanym w UE i w teście Monolisa HCV Ag-Ab ULTRA. Dla 22 próbek uzyskano wynik dodatni w teście Monolisa HCV Ag-Ab ULTRA i w teście rutynowym; dla 21 z nich wynik dodatni potwierdzono i dla 1 prawdopodobnie potwierdzono testem Deciscan. Dla 7 próbek uzyskano wyniki niezgodne pomiędzy testem Monolisa HCV Ag-Ab ULTRA, HCV PLUS Deciscan Immunoblott i metodą PCR. Dla tych 7 próbek uzyskano następujące wyniki: 2 próbki dodatnie w teście rutynowym (ujemne w HCV PCR i HCV PLUS Deciscan Immunoblott) i ujemne w teście Monolisa HCV Ag-Ab ULTRA uznano za fałszywie dodatnie w teście rutynowym. Dwóch próbek nie można było ocenić ze względu na nie interpretacyjny wynik PCR. Zostały one wyłączone z dalszych obliczeń. Jedna próbka była dodatnia w teście rutynowym, ujemna w teście Monolisa HCV Ag-Ab ULTRA, wątpliwa w teście HCV PLUS Deciscan Immunoblott i ujemna metodą PCR. Tylko 2 próbki dodatnie teście Monolisa HCV Ag-Ab ULTRA (o niskim mianie poniżej 1.7) i rutynowym teście HCV Ab, były ujemne w teście PCR i wątpliwe w teście HCV PLUS Deciscan Immunoblott (nisko dodatni prążek NS4). Swoistość określona na podstawie tych badań wynosi 99.5% (443/445), przyjmując dwie ostatnie próbki jako fałszywie dodatnie i 100%, jeśli zostaną one uznane za prawdziwie dodatnie ze względu na obecność przeciwciał pozostałych po dawnym zakażeniu (wynik wątpliwy w teście immunoblot). Swoistość dla potencjalnie interferujących próbek Oznaczono 429 próbek, mogących indukować krzyżową reaktywność w teście immunoenzymatycznym. Próbki pochodziły od: 9

10 Pacjentów z innymi chorobami zakaźnymi, jak zapalenie wątroby typu B, typu A, różyczka, toksoplazmoza, świnka, odra, CMV, HSV, EBV, VZV, HTLV I, HIV, choroba Chagasa, Flavivirus, oraz od pacjentów szczepionych przeciw grypie Pacjentów z dodatnim czynnikiem reumatoidalnym, Pacjentów z chorobą autoimmunologiczną (SLE), szpiczakiem, dodatnich pod względem przeciwciał przeciwjądrowych HAMA i ANA Kobiet w ciąży, pacjentów z marskością wątroby, przewlekłą niewydolnością nerek i chorych dializowanych. Wśród tych 429 próbek, 1 była dodatnia po powtórzeniu w teście Monolisa HCV Ag-Ab ULTRA oraz dodatnia w teście HCV Ab zarejestrowanym w UE. Swoistość testu dla tej grupy próbek wynosiła 100% (428/428). B - CZUŁOŚĆ Badania czułości polegały na testowaniu dużych serii próbek dodatnich pod względem HCV, z komercyjnych paneli serokonwersyjnych, z kolekcji Bio-Rad i z ośrodka referencyjnego. Przedstawiono podsumowanie tych badań: Czułość dla próbek dodatnich pod względem HCV Badano 646 próbek dodatnich od przewlekłych nosicieli wirusa HCV (obecność przeciwciał anty-hcv) z czego dla 405 oznaczono genotyp. Dla wszystkich 646 próbek uzyskano wynik wysoce dodatni w teście Monolisa HCV Ag-Ab ULTRA, co pozwoliło określić czułość testu na 100%. 25 dodatkowych próbek pozytywnych, Świerzych ( 1 dzień po pobraniu) były testowane i wszystkie wyniki były pozytywne. Czułość dla genotypowanych próbek dodatnich pod względem HCV Oznaczono ogółem 405 próbek genotypowanych: 133 pochodziły z różnych źródeł i 272 z laboratoriów szpitalnych Rozkład testowanych genotypów: Genotyp 1a 1b 1c 1d 1a/b 2 2a 2b 2c 2i 2a/c 3 3a 3b Liczba Genotyp 3a/b 4 4a 4c 4d 4h 4k 4f 4c/d 5a 6a 6d 1b,2a/2 1a/b,2a/c Ogółem Liczba Wszystkie badane próbki oznaczono jako dodatnie: 100% czułości. Próbki od pacjentów z ostrym zakażeniem Czułość testu określono także dla próbek pobranych w ostrej fazie zakażenia HCV (początek zakażenia). Ogółem oznaczono w teście Monolisa HCV Ag-Ab ULTRA 53 panele serokonwersyjne, zawierające 421 próbek i porównano wyniki z uzyskanymi w teście do wykrywania przeciwciał anty-hcv, zarejestrowanym w U.E. Za pomocą testu Monolisa HCV Ag-Ab ULTRA zakażenie wykryto wcześniej w przypadku praktycznie wszystkich paneli: wykryto 119 dodatkowych próbek w porównaniu z testem do wykrywania przeciwciał anty- HCV. 53 panele serokonwersyjne Test anty-hcv Monolisa HCV Ag-Ab ULTRA (421 próbek) Liczba próbek dodatnich Z 53 oznaczanych paneli serokonwersyjnych, 11 zaczyna się od próbki nie-wiremicznej, umożliwiając dokładniejsze określenie okresu okna serologicznego, gdy nie występują przeciwciała anty-hcv). Panel Genotyp Czas potrzebny do uzyskania wyniku dodatniego od pierwszego pobrania (dni) HCV RNA** Test anty-hcv Monolisa HCV Ag-Ab ULTRA Różnica między testem anty-hcv i Monolisa HCV Ag-Ab ULTRA (dni) BCP a BCP a BCP a BCP a BCP a BCP a BBI-PHV919 1a BCP a BCP-9055 NG* BCP-6216 NG*

11 NABI-SC90 NG* Średnia w dniach * Nie oznaczono genotypu ** Wynik testu RNA podany przez producenta panelu. W przypadku oznaczonych 11 paneli, w teście Monolisa HCV Ag-Ab ULTRA wykryto zakażenie średnio 24 dni wcześniej niż w teście anty-hcv. Jest to spowodowane zdolnością wykrywania antygenu kapsydowego wirusa w teście Monolisa HCV Ag-Ab ULTRA. Czułość detekcji antygenu Czułość detekcji antygenu HCV również oceniano przy pomocy paneli serokonwersyjnych, np. panelu BBI 917. Wykres przedstawia porównanie czułości testu Monolisa HCV Ag-Ab ULTRA z konkurencyjnym HCV Ab EIA. Powtarzalność Powtarzalność wewnątrz- i pomiędzy-testową określono, oznaczając 7 próbek: jedną ujemną, 3 dodatnie pod względem przeciwciał anty-hcv i 3 dodatnie pod względem antygenu HCV. W badaniu powtarzalności wewnątrz-testowej, oznaczono te próbki 30 razy w tym samym teście. W badaniu powtarzalności pomiędzy-testowej, próbki oznaczało 2 techników przez 20 dni (Stosując procedurę NCCLS EP5) Średni stosunek OD/cut-off, odchylenie standardowe i współczynnik zmienności przedstawiają tabele: Tabela 1: Powtarzalność wewnątrz-testowa Próbki OD/cut-off SD CV% Ujemna HCV Ab nisko dodatnia HCV Ab średnio dodatnia HCV Ab wysoko dodatnia HCV Ag nisko dodatnia HCV Ag średnio dodatnia HCV Ag wysoko dodatnia Współczynnik zmienności uzyskany dla 6 próbek dodatnich wynosił poniżej 10%. Tabela 2: Powtarzalność pomiędzy-testowa Próbki OD/cut-off SD CV% Ujemna HCV Ab nisko dodatnia HCV Ab średnio dodatnia HCV Ab wysoko dodatnia HCV Ag nisko dodatnia HCV Ag średnio dodatnia HCV Ag wysoko dodatnia Współczynnik zmienności uzyskany dla 6 próbek dodatnich wynosił poniżej 15%. 11

12 14 - OGRANICZENIA TESTU Ze względu na zróżnicowanie reakcji immunologicznych, występujących u pacjentów zakażonych wirusem zapalenia wątroby typu C (szczególnie w trakcie serokonwersji), mogą wystąpić pewne różnice w wykrywaniu przeciwciał za pomocą testów opartych na różnych antygenach białkowych wirusa. Wynik ujemny w teście przesiewowym nie wyklucza możliwości ekspozycji na HCV. We wszystkich testach ELISA można uzyskać wyniki fałszywie dodatnie. Zaleca się zweryfikowanie swoistości reakcji w przypadku próbek dodatnich po powtórzeniu, zinterpretowanych zgodnie z kryteriami testu Monolisa HCV Ag-Ab ULTRA, odpowiednią metodą: testem przesiewowym ELISA do wykrywania przeciwciał anty-hcv lub testem immunoblot do wykrywania przeciwciał anty-hcv. W razie konieczności, można zastosować test do wykrywania genomu HCV lub test na swoisty antygen HCV w połączeniu z testem neutralizacji. Podczas weryfikacji pipetowania metodą kolorymetryczną nie można oznaczyć objętości dodanej próbki, koniugatu i substratu, lecz jedynie potwierdzić ich obecność w studzienkach. Poziom błędu tej metody jest ściśle związany z dokładnością używanego systemu (łączny współczynnik zmienności nanoszenia i odczytu wynoszący ponad 10% znacznie obniża jakość weryfikacji) LITERATURA Busch MP, Kleinman SH. Committee report: nucleic acid amplification testing of blood donors for transfusion-transmitted infectious diseases. Report of the Interorganizational Task Force on Nucleic Acid Amplification Testing on Blood Donors. Transfusion. 2000, 40: Busch MP, Kleinman, SH, Nemo GJ. Current and emerging infectious risks of blood transfusions. JAMA. 2003, 289: Bouvier-Alias M, Patel K, Dahari H, Beaucourt S, Larderie P, Blatt L, Hezode C, Picchio G et al. Clinical utility of total core HCV core antigen quantification: a new indirect marker of HCV replication. Hepatology. 2002, vol 36: Jackson BR, Busch MP, Stramer SL, AuBuchon JP. The cost-effectiveness of NAT fot HIV, HCV and HBV in whole blood donations. Transfusion. 2003, 43: Lambert N, Vermet L, Bordier M, Clément A, Costaille M, Prigent V, Flecheux O, Sanjuan A et al. Performance features of the new Bio-Rad HCV antigen and antibody assay: MonolisaTM HCV Ag- Ab ULTRA. Vox sanguinis. 2004, 87 (suppl 3): Laperche S, Le Marrec N, Simon N, Bouchardeau F, Defer C, Maniez-Montreuil M, Levayer T, Zappitelli JP, Lefrère JJ. A new HCV core antigen assay based on disassociation of immune complexes: an alternative to molecular biology in the diagnosis of early HCV Infection. Transfusion. 2003, 43: Nübling CM, Unger G, Chudy M, Raia S, Löwer J. Sensitivity of HCV core antigen and HCV RNA detection in the early infection phase. Transfusion : Masalova OV, Atanadze SN, Samokhvalov EI, Petrakova NV, Kalinina TI, Smirnov VD, Khudyakov YE, Fields HA, Kushch AA. Detection of hepatitis C virus core protein circulating within different virus particle populations. Journal of Medical Virology. 1998, 55: 1-6. Pawlotsky JM. Use and interpretation of virological tests for hepatitis C. Hepatology. 2002, 36: Pillonel J, Laperche S, Saura C, Desenclos JC, Couroucé AM et al.. Trends in residual risk of transfusiontransmitted viral infections in France between 1992 and Transfusion. 2002, 42: Simmonds P. HCV heterogeneity: the science and the practice. In Hepatitis C Yanamouchi Europe BV Ed. p Strader DB, Wright T, Thomas DL, Seeff LB. Diagnosis, management and treatment of Hepatitis C. AASLD Practice Guideline. Hepatology. 2004, 39: Centers for Disease Control. Guidelines for Laboratory testing and result reporting of antibody to hepatitis C virus. MMWR 2003, 52: RR-3. EASL International Consensus Conference on Hepatitis C. Consensus Statement. Journal of Hepatology. 1999, 30: NIH Consensus Statement on Management of hepatitis C: NIH Consensus and State-ofthe-Science Statements. 2002, 19 N 3. 46p. 13

13 CE marking (European directive 98/79/CE on in vitro diagnostic medical devices) Znak CE (Dyrektywa Parlamentu Europejskiego i Rady nr 98/79/CE o wyrobach diagnozy medycznej in vitro) For in vitro diagnostic use Wyrób do diagnostyki in vitro Catalogue number Numer katalogowy Manufacturer Wytwórca Authorised Representative Autoryzowany przedstawiciel Batch code Kod partii Expiry date YYYY/MM/DD U y przed RRRR/MM/DD Storage temperature limitation Przestrzega zakresu temperatur Consult Instruction for use Sprawd w instrukcji obsługi Bio-Rad 3, Bd Raymond Poincaré Marnes-la-Coquette France Tél. : 33 (0) Fax.: 33 (0) /2010 nr