Zasady wykonania walidacji metody analitycznej Walidacja metod badań zasady postępowania w LOTOS Lab 1. Metody badań stosowane w LOTOS Lab należą do następujących grup: 1.1. Metody zgodne z uznanymi normami krajowymi, albo międzynarodowymi, wykonywane w zakresie zastosowań i zgodnie z procedurą podaną w normie; 1.2. Metody opracowane przez uznanych producentów aparatury badawczej, albo opisane w renomowanych czasopismach naukowych, albo opracowane przez uznane instytuty branżowe, lub przez uczelnie wyższe i poddane walidacji przez opracowującego oraz stosowane w LOTOS Lab w zakresie objętym udokumentowanymi danymi z walidacji; 1.3. Metody generalnie zgodne z uznanymi normami krajowymi, albo międzynarodowymi lecz zmodyfikowane w LOTOS Lab i wykonywane w sposób skorygowany, albo w zmienionym zakresie zastosowania; 1.4. Metody opracowane, albo zaadoptowane przez LOTOS Lab i wykonywane zgodnie z procedurą opracowaną w Laboratorium. 2. Dla metod z grupy 1.1. i 1.2. może zostać wykonana uproszczona walidacja, natomiast zastosowanie do badań metod należących do grupy 1.3. i 1.4. wymaga wykonania, uprzednio, pełnej walidacji. Zgodnie, jednak, z wymaganiami p. 5.4.5.2. normy PN-EN ISO/IEC 17025:2001, "walidacja powinna być na tyle obszerna, na ile jest to konieczne przy danym zastosowaniu, albo obszarze zastosowania" metody badań. 2.1. Walidacja metod badań stosowanych w LOTOS Lab obejmuje, co najmniej, następujące etapy postępowania (p.2.1.1.) oraz wymaga zbadania następujących parametrów (p.2.1.2 - w przypadku walidacji uproszczonej i p.2.1.2 oraz 2.1.3. w przypadku walidacja pełnej). 2.1.1. Etapy postępowania walidacyjnego: Określenie zakresu stosowania metody badań, tzn. określenie zakresu zmienności parametrów badanych próbek oraz zakresu zmienności tzw. "matrycy" badanych próbek; Opracowanie programu badań walidacyjnych z podaniem odpowiednich wartości kryterialnych, wymaganych dla walidowanej metody badań; Zatwierdzenie programu walidacji przez Dyrektora LOTOS Lab; Wykonanie badań walidacyjnych zgodnie z zatwierdzonym programem walidacji; Opracowanie wyników badań walidacyjnych i przygotowanie pisemnego raportu walidacji, uwzględniającego przede wszystkim stwierdzenia dotyczące spełnienia wymagań, określonych w programie walidacji; Zatwierdzenie raportu walidacji przez Dyrektora LOTOS Lab, równoznaczne z wprowadzeniem metody do bieżącego stosowania w Laboratorium. 2.1.2. Parametry i właściwości metody badań, które powinny zostać zbadane podczas walidacji uproszczonej: Laboratoryjna precyzja metody badań (odchylenie standardowe pojedynczego wyniku, odchylenie standardowe wartości średniej, przedział ufności wartości średniej dla poziomu ufności 0.95), określona dla zakresu stosowania metody badań w laboratorium, Strona 1 z 6
tzn. dla przeciętnych, najniższych i najwyższych wartości mierzonego parametru / właściwości badanych próbek; Laboratoryjna powtarzalność metody badań, wyznaczona na poziomie ufności 0.95, z zastosowaniem rezultatów otrzymanych przy wyznaczaniu laboratoryjnej precyzji, z uwzględnieniem założenia, że z reguły będą wykonywane dwa kolejne oznaczenia badanego parametru i obliczona zgodnie z zasadą opisaną w "Zapewnienie jakości analiz chemicznych", IMP 1998, pod red. M. Dobeckiego. Obliczenie laboratoryjnej powtarzalności może też zostać wykonane z zastosowaniem wszystkich kombinacji hipotetycznych rozstępów między poszczególnymi wynikami otrzymanymi w serii oznaczeń, po odrzuceniu - z zastosowaniem testu Q - Dixona - wyników obarczonych błędem grubym. Laboratoryjna niepewność wyników badań, określona / oszacowana ilościowo poprzez wykorzystanie, co najmniej, jednej z poniżej wymienionych grup parametrów i metod postępowania: - Odchylenia standardowe i przedziały ufności pojedynczego wyniku, odchylenia standardowe i przedziały ufności wartości średniej oraz laboratoryjne powtarzalności metody; - Przedział ufności pojedynczego wyniku oraz przedział ufności wartości średniej, określone na podstawie rezultatów badań ; - Standardowa niepewność złożona certyfikowanego materiału odniesienia (CRM), albo materiału odniesienia Urzędu Miar, zbadana doświadczalnie z zastosowaniem walidowanej metody analitycznej; - Obliczenie (oszacowanie) "standardowej i rozszerzonej niepewności złożonej", według zasady "addytywności propagacji wariancji zdarzeń niezależnych". 2.1.3. Podczas walidacji pełnej powinny zostać zbadane i wyznaczone, dodatkowo, następujące parametry / właściwości metody badań dla zakresu przewidywanego stosowania metody w LOTOS Lab: - granica detekcji i granica oznaczalności, - zakres liniowości oraz parametry odpowiedniej linii / funkcji korelacyjnej, - selektywność i specyficzność, - wpływ zamierzonych i niezamierzonych zmian warunków pobierania próbek, zmian składu "matrycy' próbek oraz zmian warunków wykonywania badań na otrzymywane wyniki, ich precyzję, powtarzalność oraz na niepewność pomiarową, - korelacja wyników badań otrzymanych metodą walidowaną i ogólnie uznaną metodą / metodami odniesienia 3. Inne zasady postępowania oraz dodatkowe zalecenia 3.1. Każda walidacja powinna zostać poprzedzona analizą czynników wpływających na błąd pomiaru oraz dokonaniem na tej podstawie - w praktyce analitycznej w LOTOS Lab w takim zakresie, na ile to możliwe - minimalizacji czynników wpływających na wartość błędu wyników badania. 3.2. Sposoby wyznaczenia / szacowania niepewności pomiaru, podane w p. 2.1.2. mogą być traktowane na razie jako równoważne, jednak, należy w możliwie jak najkrótszym okresie czasu wyznaczyć dla poszczególnych metod badań niepewność złożoną, określoną wg zasady Strona 2 z 6
"propagacji wariancji zdarzeń niezależnych", z wyjątkiem tych metod badań, gdy można udokumentować z wysokim poziomem ufności, że inny spośród w/w sposobów określenia / oszacowania niepewności pomiaru jest dla tej metody bardziej właściwy. 3.3. W przypadku nie zautomatyzowanych metod badań, gdy stopień wyszkolenia pracownika i stopień staranności wykonania przez niego czynności laboratoryjnych ma wpływ na otrzymane wyniki, należy w ustalonym okresie czasu wyznaczyć laboratoryjną powtarzalność, z uwzględnieniem wykonywania pomiarów przez różnych pracowników Laboratorium. 3.4. Ważnymi danymi walidacji są wyniki badań tych samych próbek, wykonane różnymi metodami analitycznymi, szczególnie, gdy dotyczy to metod badań zakwalifikowanych do grupy 1.3. i 1.4. i istnieje uznana normowa metoda oznaczania odpowiedniego parametru. 3.5. Za wykonanie dla poszczególnych metod badań: "programu walidacji z określeniem wymaganych kryteriów", "analizy czynników wpływających na niepewność wyników badań", "minimalizacji czynników najważniejszych", "wykonanie badań walidacyjnych" oraz za "opracowanie wyników badań walidacyjnych, wraz z określeniem zgodności z przyjętymi kryteriami" odpowiada pracownik opiekujący się odpowiednią metodą badań (dawniej, "pracownik wiodący" w zakresie określonej metody badań). Ponieważ, jednak, wykonanie znacznej części walidacji metody badań jest skomplikowane, kierownicy odpowiednich Laboratoriów oraz Pracowni, a także Specjaliści zatrudnieni w LOTOS Lab są zobowiązani do udzielenia na bieżąco potrzebnej pomocy. Praca tego typu powinna być, jednocześnie, traktowana jako realizacja podstawowych obowiązków pracownika LOTOS Lab. Opracował: Zatwierdził: Zasady przygotowania programu walidacji metody badawczej Przykład instrukcji wykonania walidacji metody analitycznej znajduje się w Instrukcja walidacji metody analitycznej 1. Zakres zastosowań metody w laboratorium LOTOS Lab Metoda badawcza... (np. "Oznaczanie zawartości azotu całkowitego" w zakresie od..., do... mg/l ) ma w LOTOS Lab następujący zakres zastosowania: do oznaczania zawartości... w zakresie stężeń od..., do..., w rafineryjnych wodach i ściekach procesowych, w kontroli procesu oczyszczania ścieków rafineryjnych oraz w wodach powierzchniowych. Orientacyjny zakres zmienności składu matrycy badanych próbek, dla którego metoda jest właściwa, został podany w p..... 2. Zasada metody oznaczania Próbka badanej wody, po ewentualnym przygotowaniu na drodze usunięcia substancji przeszkadzających, zostaje dodana do naczynia zawierającego potrzebne reagenty i po ustalonym okresie czasu potrzebnym dla zakończenie chemicznych reakcji analitycznych, zostaje zmierzona absorbancja przy długości fali światła... nm, z zastosowaniem fotometru Strona 3 z 6
... Wartość absorbancji zostaje przeliczona na stężenie azotu całkowitego z zastosowaniem współczynnika kalibracyjnego zawartego w pamięci fotometru, albo wprowadzonego do pamięci przez użytkownika fotometru. Reakcja chemiczna, powodująca sygnał analityczny, polega na... 3. Powszechnie stosowana metoda / y odniesienia oraz najważniejsze wzajemne odniesienia między tymi metodami Za metodę odniesienia należy uznać metodę PN-ISO... Niniejsza, metoda badań, będąca przedmiotem walidacji powinna dawać rezultaty zgodne z wynikami, otrzymywanymi metodą.... W przypadku niektórych badanych próbek metoda walidowana powinna prowadzić do otrzymywania rezultatów bardziej poprawnych, ponieważ,.... Jednocześnie walidowana metoda powinna być bardziej precyzyjna i bardziej odporna na czynniki zakłócające od metody odniesienia. Albo temu podobne informacje dotyczące charakterystyki walidowanej metody badań i metody odniesienia. 4. Cel ogólny i cele szczegółowe walidacji Wykazać, na podstawie badań i poprzez zdobycie obiektywnych dowodów, że walidowana metoda badań jest właściwa w zastosowaniach podanych w p.1. W związku z tym dla zakresu zastosowań tej metody w LOTOS Lab postanowiono zbadać, wyznaczyć lub oszacować i ocenić jej: - Dokładność; - Precyzję; - Liniowość; - Dolną i górną granicą zakresu roboczego, albo zakresu liniowości; - Korelację rezultatów otrzymanych metodą walidowaną i metodą odniesienia (jeżeli taka istnieje i jest uznawana za poprawną); - Odporność na zmianę określonych parametrów i warunków wykonania badań (jeżeli mogą mieć wpływ na otrzymane wyniki i na niepewność pomiarową, albo uzasadnienie, że wykonywanie takich badań nie jest potrzebne) - Niepewność pomiarową. Za kryterium weryfikacji ocen statystycznych przyjmuje się poziom ufności 0.95, albo poziom istotności hipotez statystycznych 0.05. Do weryfikacji hipotez statystycznych przyjmuje się, z zasady tylko wyniki pomiarów nie obarczone błędem grubym (po weryfikacji surowych danych pomiarowych i po odrzuceniu wszystkich wyników nadmiernie odbiegających z zastosowaniem testu Q Dixona, albo innej odpowiedniej metody weryfikacji przynależności danych pomiarowych do określonej statystyki). W miarę możliwości, badania zostaną wykonane dla niskich, przeciętnych i wysokich zawartości analitu oraz dla ubogich, typowych i bogatych zawartości substancji w tzw. matrycy badanych próbek. Należy umotywować przyjęty do badań zakres zmienności składu matrycy próbek Badania powinny obejmować, co najmniej, 10 niezależnie przygotowanych próbek, korzystnie, przez kilku pracowników uprawnionych do badań. Strona 4 z 6
5. Program walidacji Program walidacji metody badawczej p.t. "... ", wymagane wartości parametrów walidacyjnych oraz kryteria akceptacyjne metody badań p.t. L.p. Element celu badań 1 Precyzja 2 Dokładność Badane parametry / właściwości metody badań / metody analitycznej Odchylenie standardowe oraz przedział ufności dla wyniku pojedynczego oznaczenia Odchylenie standardowe oraz przedział ufności wartości średniej Górna granica powtarzalności metody badania, wyznaczona w oparciu o rozstępy między wynikami pomiarów wykonanych przez tę samą osobę, dla tej samej próbki laboratoryjnej (lecz dla różnych próbek analitycznych), uzyskana w krótkim okresie czasu Górna granica odtwarzalności metody oznaczania Błąd bezwzględny i względny wartości średniej wyznaczony w laboratorium, odniesiony do wartości średniej materiału odniesienia o znanej wartości badanego parametru, wyznaczony doświadczalnie na podstawie wyników pomiarów wykonanych z zastosowaniem sprzętu pomiarowego posiadającego aktualne odniesienie do "oficjalnych" jednostek miar, ze znaną niepewnością Błąd bezwzględny i względny wartości średniej laboratorium odniesiony do wartości średniej z badań Błąd bezwzględny i względny wartości stopnia odzysku przy zastosowaniu metody dodatku wzorca 3 Liniowość Liniowość zakresu roboczego metody określona dla materiału odniesienia, albo / i na podstawie korelacji do rezultatów dla liniowej metody odniesienia: charakter korelacji oraz wartości współczynnika kierunkowego, wyrazu wolnego i współczynnika korelacji linii regresji 4 Granice roboczego zakresu metody Dolna granica oznaczalności, ewentualnie dolna granica detekcji oraz górna granica liniowości i ewentualnie górna granica oznaczalności Wymagania oraz kryteria akceptacji Wyznaczyć wartości parametrów i gdy istnieją odpowiednie dane - porównać z wartościami typowymi dla metody odniesienia. Wartości nie wyższe od typowych dla metody odniesienia - akceptacja metody badań, wartości wyższe - weryfikacja procedury analitycznej i powtórzenie walidacji. Zawieranie się całego przedziału ufności wartości średniej wyników laboratorium w przedziale standardowego błędu rozszerzonego materiału odniesienia, albo w przedziale ufności wartości średniej wyników badań, albo w przedziale odtwarzalności, a szczególnie powtarzalności, walidowanej metody badań - oznacza brak błędu systematycznego. Częściowe rozbieżności w/w przedziałów wymagają weryfikacji hipotezy o niezgodności wartości średnich oraz wariancji. Należy stwierdzić brak błędu systematycznego, albo wyznaczyć wartości poprawek. Średnia wartość stopnia odzysku w zakresie 0.98 do 1.02 i symetria przedziału ufności wartości średniej stopnia odzysku oznacza brak błędu systematycznego. Inne rezultaty wymagają zbadania wartości błędu systematycznego metody badań i wyznaczenia poprawek Wyższa do 0.995 wartość współczynnika korelacji (R) oznacza liniowość i określa liniowy zakres roboczy metody badań. Niższe od 0.97 i wyższe od 1.03 wartości wykładnika funkcji S=kc x (log S= x (log c) + log k, wyznaczają granice liniowości, gdzie S sygnał pomiarowy c wartość mierzona Jako dolna granica detekcji - trzykrotna wartość średnia dla ślepej próby, albo trzykrotna wartość poziomu szumów wyznaczonego w jednostkach badanego parametru, a jako dolna granica oznaczalności, odpowiednio, pięcio-krotność Badane próbki i zakres zmienności warunków analitycznych Z wykorzystaniem materiałów odniesienia o typowej i o "skrajnych" właściwościach matrycy Zakres zmienności badań Materiał / y odniesienia o niskich, wysokich i typowych wartościach badanego parametru oraz o typowej, ubogiej i bogatej matrycy W zakresie zmienności próbek z badań i ich parametrów statystycznych Dla niskich, wysokich i typowych wartości dodatku oraz dla typowej, ubogiej i bogatej matrycy Z użyciem materiałów odniesienia o odpowiednim zakresie zmienności badanego parametru, dla ubogiej, typowej i bogatej matrycy Uwagi Określić górną granicę powtarzalności dla wykonywania dwu-, albo jednokrotnego oznaczania próbki analitycznej Wyniki badań Sposoby, stosowane alternatywnie, albo łącznie Wartość współczynnika kierunkowego linii regresji określa czułość metody Strona 5 z 6
L.p. 5 Element celu badań Korelacja rezultatów w stosunku do metody odniesienia Badane parametry / właściwości metody badań / metody analitycznej Charakter korelacji, wartości współczynnika kierunkowego i wyrazu wolnego oraz współczynnika korelacji linii regresji, o ile możliwe, w całym zakresie roboczym metody analitycznej Wymagania oraz kryteria akceptacji Wyznaczyć parametry linii regresji oraz ocenić stopień zgodności rezultatów otrzymywanych walidowaną metodą badań oraz metodą odniesienia Badane próbki i zakres zmienności warunków analitycznych Z użyciem materiałów odniesienia o odpowiednim zakresie zmienności badanego parametru, dla ubogiej, typowej i bogatej matrycy Uwagi Zbadać, gdy metoda odniesienia jest ogólnie uznana za poprawną 6 Odporność metody na zamierzone i nie zamierzone zmiany warunków wykonania badania 7 Niepewność pomiarowa metody badań Wpływ zmienności właściwości odczynników, materiałów pomocniczych, gazów, kolumn, stosowanych do badań, osoby wykonującej badania, czasu przechowywania próbki itp. czynników na otrzymane wyniki badań i na niepewność pomiarową Odchylenie standardowe i przedział ufności pojedynczego wyniku oraz odchylenie standardowe i przedział ufności wartości średniej wyznaczone w laboratorium (jak w p. 1.); Przedział ufności pojedynczego wyniku oraz przedział ufności wartości średniej określone w czasie badaniach Standardowa niepewność złożona certyfikowanego materiału odniesienia (CRM), albo materiału odniesienia Urzędu Miar, gdy były badane walidowaną metodą analityczną Obliczona (oszacowana) "standardowa i rozszerzona niepewność złożona", według zasady "addytywnej propagacji wariancji zdarzeń niezależnych". 8 Selektywność Stosunek wartości sygnału analitycznego Sy od badanego parametru do sygnału analitycznego Sx od określonego wybranego składnika matrycy próbki (Sel=Sy/Sx) 9 Specyficzność Wpływ zmian łącznego składu matrycy na wartość sygnału analitycznego Wyznaczyć wartości średnie i rozstępy między średnimi wartościami wyników badań tej samej próbki materiału odniesienia, badanej w różnych warunkach. Wartości średnie wraz z przedziałem ufności wartości średniej powinny być zawarte w zakresie rozszerzonego błędu standardowego wartości średniej materiału odniesienia, a rozstępy między wartościami średnimi - w przedziale górnej granicy powtarzalności metody badań Wyznaczyć odpowiednie wartości statystyczne, albo oszacowania i podać je w raporcie walidacji. Porównać z odpowiednimi wartościami dla metody odniesienia. Otrzymanie dla walidowanej metody badań wartości niższych od wyznaczonych dla metody odniesienia jest dodatkowym argumentem dla poprawności wyboru walidowanej metody badań Wartość Sel > 1000 oznacza metodę selektywną, Sel>10000 metodę wysoce selektywną, a wartość Sel<100 metodę nie selektywną Metoda jest specyficzna, gdy składniki obecne potencjalnie w matrycy badanych próbek nie powodują zmiany sygnału analitycznego powyżej 1% względnego. Gdy wpływ składników matrycy jest wyższy, należy przed wykonaniem analizy zastosować odpowiednie metody przygotowania próbki, w celu usunięcia składników zakłócających Z użyciem materiałów odniesienia o typowej wartości badanego parametru oraz dla typowej matrycy Dla niskich, typowych i wysokich wartości badanego parametru, z uwzględnieniem matrycy ubogiej, typowej i bogatej Stężenie składników, dla których jest badana selektywność metody w typowym dla niej zakresie Dla niskich, typowych i wysokich wartości badanego parametru, z uwzględnieniem matrycy ubogiej, typowej i bogatej oraz metody dodatku do próbki składników matrycy mających potencjalnie wpływ na wartość sygnału analit. Wykonać w zakresie niezbędnym, gdy nie można wykluczyć wpływu zmienności warunków badań na wyniki oznaczania Alternatywne sposoby postępowania, o ile możliwe należy zastosować co najmniej dwa, preferując metodę addytywnej propagacji wariancji Wykonywać tylko dla substancji należących do prawdopodobnych składników matrycy Zbadać tylko wtedy, gdy jest określone prawdopodobieństwo obecności w matrycy próbek składników, dla których metoda badań jest niespecyficzna W przypadku niektórych metod analitycznych, opisanych w normach, farmakopei, albo w literaturze naukowej i poddanych uprzednio walidacji, wykonanie pełnego programy nie jest konieczne i wystarczy walidację ograniczyć do pierwszych pozycji powyższej tabeli. Strona 6 z 6