AUTOREFERAT. b) Autorzy, rok wydania, tytuły publikacji, nazwa wydawnictwa:

AUTOREFERAT 1. Imię i Nazwisko: Ewa Stelmańska 2. Posiadane dyplomy i stopnie naukowe: 2004 rok stopień doktora nauk medycznych w zakresie biologii medycznej uzyskany w Katedrze i Zakładzie Biochemii Gdańskiej Akademii Medycznej na podstawie pracy: Wpływ ograniczonej podaży pokarmu na ekspresję genu enzymu jabłczanowego w tkance tłuszczowej i niektórych narządach szczura ; Promotor: prof. dr hab. Julian Świerczyński. 1995 rok tytuł magistra biologii, specjalizacja biologia molekularna, uzyskany w Katedrze Biochemii na Wydziale Biologii Geografii i Oceanologii Uniwersytetu Gdańskiego. 3. Informacje o dotychczasowym zatrudnieniu w jednostkach naukowych: 1995-2006 r. asystent, Katedra i Zakład Biochemii, Wydział Lekarski, Akademia Medyczna w Gdańsku; Od 2007 r. adiunkt, Katedra i Zakład Biochemii, Wydział Lekarski, Akademia Medyczna w Gdańsku (obecnie Gdański Uniwersytet Medyczny). 4. Wskazanie osiągnięcia wynikającego z art. 16 ust. 2 ustawy z dnia 14 marca 2003 r. o stopniach naukowych i tytule naukowym oraz o stopniach i tytule w zakresie sztuki (Dz. U. nr 65, poz. 595 ze zm.) a) Tytuł osiągnięcia naukowego: Wpływ progesteronu na metaboliczną i wydzielniczą funkcję tkanki tłuszczowej szczura b) Autorzy, rok wydania, tytuły publikacji, nazwa wydawnictwa: 1. E. Stelmanska, Z. Kmiec, J. Swierczynski, (2012), The gender- and fat depot-specific regulation of leptin, resistin and adiponectin genes expression by progesterone in rat, J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 132: 160-167. (IF = 3,984, MNiSW: 25) Mój wkład w powstanie tej pracy polegał na opracowaniu koncepcji badań, zaplanowaniu i wykonaniu wszystkich doświadczeń (z wyjątkiem analizy histologicznej wykonanej przez 1

prof. dr hab. Z. Kmiecia), analizie statystycznej, interpretacji i opracowaniu wyników badań, napisaniu części manuskryptu i opracowaniu rycin oraz redakcji tekstu. Mój udział procentowy szacuję na 70%. 2. E. Stelmanska, J. Swierczynski, (2013), Up-regulation of lipogenic enzyme genes expression in inguinal white adipose tissue of female rats by progesterone, J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 134: 37-44. (IF = 4,049, MNiSW: 25) Mój wkład w powstanie tej pracy polegał na opracowaniu koncepcji badań, zaplanowaniu i wykonaniu wszystkich doświadczeń, analizie statystycznej, opracowaniu rycin i tabel, napisaniu części manuskryptu i redakcji tekstu. Mój udział procentowy szacuję na 80%. 3. E. Stelmanska, E. Sucajtys-Szulc, (2014), Enhanced food intake by progesteronetreated female rats is related to changes in neuropeptide genes expression in hypothalamus, Endocrynol. Pol. 65: 46-56. (IF = 1,208, MNiSW: 15) Mój wkład w powstanie tej pracy polegał na opracowaniu koncepcji badań, zaplanowaniu i wykonaniu wszystkich doświadczeń (z wyjątkiem pobrania materiału biologicznego podwzgórza i izolacji RNA z podwzgórza, które wykonała mgr E. Sucajtys-Szulc), analizie statystycznej, interpretacji wyników badań, napisaniu całej pracy i redakcji tekstu. Mój udział procentowy szacuję na 90%. 4. E. Stelmanska, S. Szrok, J. Świerczyński, (2015), Progesterone-induced downregulation of hormone sensitive lipase (Lipe) and up-regulation of G0/G1switch 2 (G0s2) genes expression in inguinal adipose tissue of female rats is reflected by diminished rate of lipolysis J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 147: 31-39. (IF = 4,049, MNiSW: 25) Mój wkład w powstanie tej pracy polegał na opracowaniu koncepcji badań, zaplanowaniu i wykonaniu wszystkich doświadczeń (inkubacja skrawków WAT prowadzona przy współudziale z mgr S. Szrok), analizie statystycznej, interpretacji wyników badań, napisaniu części manuskryptu, wykonaniu rycin i tabeli oraz redakcji tekstu. Mój udział procentowy szacuję na 70%. Sumaryczny IF prac stanowiących osiągniecie naukowe: 13,29 Punktacja MNiSzW: 90 2

c) Omówienie celu naukowego ww. prac i osiągniętych wyników wraz z omówieniem ich ewentualnego wykorzystania Progesteron jest hormonem steroidowym produkowanym przez trofoblast łożyska i komórki ciałka żółtego oraz przez korę nadnerczy i gonady (jako prekursor innych hormonów steroidowych). Hormon ten ma złożone i wielokierunkowe działania, zarówno lokalne, jak i ogólnoustrojowe [1]. Główną funkcją tego związku jest przygotowanie błony śluzowej macicy do ciąży i jej utrzymania. W II trymestrze ciąży, kiedy stężenie progesteronu w osoczu jest ponad 100-krotnie wyższe niż w fazie folikularnej cyklu miesiączkowego kobiety [2], następuje najwyższy przyrost masy ciała ciężarnej spowodowany nie tylko rozwojem płodu, wzrostem objętości krwi, wód płodowych i masy łożyska, ale też przyrostem masy tkanki tłuszczowej matki. Sugeruje to, że progesteron może wpływać na metabolizm lipidów w tkance tłuszczowej kobiet. Jednak informacje na ten temat dostępne w piśmiennictwie są niekompletne, a często sprzeczne. Wykazano zarówno stymulujący [3], jak i hamujący [4] wpływ progesteronu na proces biosyntezy kwasów tłuszczowych z glukozy w tkance tłuszczowej samic zwierząt. Progesteron i jego analogi są stosowane jako leki w szeroko pojętej endokrynologii ginekologicznej [2] oraz w ciężkich stanach chorobowych w celu poprawienia stanu odżywienia pacjentów (np. octan megestrolu) [5]. Molekularne podstawy stosowania progesteronu w celu poprawy stanu odżywienia chorych (oraz osób starszych) nie są znane. Niewiele wiadomo również na temat wpływu progesteronu na syntezę i sekrecję adipokin białkowych lub peptydowych hormonów produkowanych i wydzielanych przez tkankę tłuszczową, które wykazując szereg wielokierunkowych działań, mają wpływ na metabolizm ogólnoustrojowy [6]. Celem naszych badań było poznanie wpływu progesteronu na metaboliczną funkcję tkanki tłuszczowej szczura oraz wpływ tego związku na syntezę i sekrecję ważniejszych adipokin związanych z regulacją masy tkanki tłuszczowej i masy ciała. Funkcja metaboliczna tkanki tłuszczowej polega przede wszystkim na magazynowaniu energii w postaci triacylogliceroli (TAG), gromadzonych w dużej centralnie ułożonej w adipocycie kropli lipidowej oraz na uwalnianiu substratów energetycznych kwasów tłuszczowych do krwi [7]. Kwasy tłuszczowe magazynowane w postaci TAG mogą pochodzić zarówno z pokarmu, jak również mogą być syntetyzowane de novo z glukozy w procesie zwanym lipogenezą. Metabolizm lipidów w tkance tłuszczowej sprowadza się więc głównie do syntezy kwasów 3

tłuszczowych i TAG oraz hydrolizy TAG w procesie zwanym lipolizą. Zarówno w procesy syntezy lipidów, jak i hydrolizy TAG zaangażowanych jest wiele enzymów oraz białek regulacyjnych [7,8]. W celu określenia wpływu progesteronu na metabolizm lipidów i wydzielniczą funkcję tkanki tłuszczowej szczura postanowiliśmy, u zwierząt traktowanych tym hormonem, zbadać: a) masę ciała, masę tkanki tłuszczowej i ilość zjadanego pokarmu; b) ekspresję genów kodujących białka uczestniczące w lipogenezie i syntezie TAG oraz biorące udział w regulacji tych procesów; c) przebieg i regulację procesu lipolizy; d) ekspresję genów kodujących adipokiny, których funkcja związana jest z regulacją masy ciała. W pracy opublikowanej w J. Steroid Biochem. Mol. Biol. (2012; praca nr 1) przedstawiliśmy wpływ progesteronu na ekspresję genów kodujących leptynę, adiponektynę i rezystynę w tkance tłuszczowej szczura. Spośród wielu adipokin produkowanych przez tkankę tłuszczową wybraliśmy te, które pełnią znaczącą rolę w regulacji masy ciała. Stężenie leptyny i adiponektyny we krwi jest zależne od masy ciała i masy tkanki tłuszczowej (leptyna jest dodatnio a adiponektyna ujemnie skorelowana z masą ciała i masą tkanki tłuszczowej) [9]. Leptyna odgrywa bardzo ważną rolę w regulacji metabolizmu energetycznego organizmu. Białko to reguluje masę ciała poprzez hamowanie apetytu (represja genów kodujących NPY i AGRP w podwzgórzu) i zwiększenie wydatku energetycznego. Ponadto, działając bezpośrednio lub poprzez układ współczulny, leptyna wpływa na metabolizm lipidów i węglowodanów w różnych tkankach organizmu [10]. Adiponektyna wpływa na szereg procesów biochemicznych, szczególnie na przemianę węglowodanów i kwasów tłuszczowych w wątrobie (np.: hamowanie glukoneogenezy) [11] i mięśniach (obniżenie akumulacji TAG i wzrost utleniania kwasów tłuszczowych) [12]. Rezystyna również pełni istotną funkcję w regulacji metabolizmu węglowodanów i lipidów zarówno w wątrobie i mięśniach szkieletowych, jak również w tkance tłuszczowej, gdzie m.in. bierze udział w regulacji adipogenezy [13]. Najważniejsze wyniki przedstawione w tej pracy, dotyczące wpływu progesteronu na ekspresję genów kodujących te adipokiny w WAT, można streścić następująco: 1. Podanie progesteronu samicom szczura prowadzi do wzrostu stężenia progesteronu we krwi, utrzymującego się do końca trwania doświadczenia. U samców mimo około 30-4

krotnego wzrostu stężenia progesteronu w krwi, jego stężenie osiąga wartość charakterystyczną dla samic kontrolnych. 2. Pod wpływem progesteronu dochodzi do wzrostu masy ciała oraz masy podskórnej tkanki tłuszczowej samic szczura. Wzrost masy tej tkanki był związany z hipertrofią adipocytów. 3. Progesteron powoduje wzrost ekspresji genów kodujących leptynę i rezystynę w podskórnej tkance tłuszczowej samic szczura. Stężenie obu białek w surowicy krwi badanych zwierząt pozostało jednak bez zmian. 4. Pod wpływem progesteronu dochodzi do obniżenia ekspresji genu kodującego adiponektynę w podskórnej tkance tłuszczowej samic szczura. Nie zaobserwowaliśmy zmian w stężeniu tego białka w surowicy krwi samic szczura traktowanych tym hormonem. 5. Podanie zwierzętom mifepristonu (antagonisty receptora progesteronu) prowadzi do zniesienia wpływu progesteronu na ekspresję badanych genów. 6. W przypadku samców szczura, podwyższenie stężenia progesteronu w surowicy krwi nie prowadzi do zmian w masie ciała i masie tkanki tłuszczowej tych zwierząt oraz ekspresji genów kodujących leptynę, adiponektynę i rezystynę w tkance tłuszczowej. 7. Poziom receptora progesteronu jest dużo wyższy w podskórnej tkance tłuszczowej samic szczura niż u samców. Ponadto, u samic ekspresja genu kodującego receptor progesteronu jest statystycznie istotnie wyższa w podskórnej tkance tłuszczowej niż w okołonerkowym skupisku tej tkanki. 8. Progesteron powoduje obniżenie ekspresji genu kodującego receptor progesteronu w podskórnej tkance tłuszczowej samic szczura. W omawianej pracy jako pierwsi wykazaliśmy, że podwyższone stężenie progesteronu w surowicy krwi prowadzi do wzrostu ekspresji genów kodujących leptynę i rezystynę oraz do obniżenia ekspresji genu kodującego adiponektynę w podskórnej tkance tłuszczowej samic szczura. Podanie mifepristonu samicom szczura całkowicie znosi efekt progesteronu, co wskazuje na specyficzne, zależne od receptora, działanie tego hormonu na ekspresję genów kodujących badane adipokiny. Zmiany w poziomie mrna leptyny, adiponektyny i rezystyny są związane ze wzrostem masy ciała i masy podskórnej tkanki tłuszczowej oraz wzrostem wielkości adipocytów. W surowicy krwi badanych zwierząt nie zaobserwowaliśmy zmian w stężeniu tych adipokin. Może być to spowodowane tym, że u szczurów głównym źródłem krążącej we krwi leptyny i adiponektyny jest okołonerkowa (samice) i okołonerkowa oraz zlokalizowana w okolicach najądrzy (samce) tkanka tłuszczowa [14]. W tych skupiskach tkanki tłuszczowej nie zaobserwowaliśmy zmian w poziomach mrna badanych adipokin u 5

szczurów traktowanych progesteronem. Również w brunatnej tkance tłuszczowej, zarówno samic, jak i samców szczura, którym podano progesteron, nie zaobserwowaliśmy zmian w ekspresji genów kodujących adipokiny w porównaniu do szczurów kontrolnych. Nasze badania dostarczają również ważnych informacji na temat ekspresji genu kodującego receptor progesteronu w tkance tłuszczowej. Jak wynika z piśmiennictwa, obecność tego receptora w tkance tłuszczowej jest wciąż kontrowersyjna [15,16]. Uzyskane przez nas wyniki potwierdzają, że w różnych skupiskach tkanki tłuszczowej samców szczura, receptor progesteronu (zarówno białko, jak i mrna) występuje na bardzo niskim (u niektórych osobników nawet nieoznaczalnym) poziomie. Jednocześnie jako pierwsi wykazaliśmy, że u samic poziom receptora progesteronu jest zdecydowanie wyższy w podskórnej tkance tłuszczowej niż w okołonerkowym skupisku tej tkanki. Wynik ten może tłumaczyć dlaczego obserwowane przez nas zmiany w ekspresji genów pod wpływem progesteronu są widoczne jedynie w podskórnej tkance tłuszczowej samic szczura. Brak efektów działania progesteronu u samców może wynikać zarówno z bardzo niskiego poziomu receptora progesteronu w WAT, jak również ze zbyt niskiego (mimo podania dużej dawki) stężenia tego hormonu w surowicy, osiągającego wartość charakterystyczną dla samic kontrolnych. Jako pierwsi wykazaliśmy również, że progesteron prowadzi do obniżenia poziomu mrna i białka receptora progesteronu w podskórnej tkance tłuszczowej. Podobne zjawisko zaobserwowano wcześniej w innych narządach i tkankach będących głównym miejscem działania progesteronu [17]. Wyniki zamieszczone w tej pracy dostarczają nowych ważnych informacji uzupełniających stan wiedzy na temat działania progesteronu w organizmie. Wykazaliśmy, że progesteron, podobnie jak inne hormony steroidowe, jest odpowiedzialny za obserwowane różnice w metabolizmie poszczególnych skupisk tkanki tłuszczowej. Nasze wyniki pokazały również, że nie tylko androgeny i estrogeny, ale również progesteron ma wpływ na obserwowane różnice w metabolizmie tkanki tłuszczowej pomiędzy osobnikami męskimi i żeńskimi. Zaobserwowaliśmy, że samice szczura, którym podano progesteron, spożywają więcej paszy niż zwierzęta kontrolne. Również inne badania wskazują, że zwierzęta, którym podano progesteron spożywają większe ilości paszy [18]. Mimo to, mechanizmy odpowiedzialne za to zjawisko nie zostały wyjaśnione. Powszechnie wiadomo, że w regulacji głodu i sytości bardzo istotną rolę odgrywają neuropeptydy podwzgórzowe [19]. Znany jest również fakt, że progesteron może przenikać do różnych rejonów mózgu, w tym do podwzgórza [20]. Celem kolejnej pracy doświadczalnej było więc sprawdzenie, czy obserwowane pod wpływem 6

progesteronu zmiany w ilości spożywanego pokarmu przez szczury mogą być związane ze zmianami ekspresji genów neuropeptydów w podwzgórzu. W pracy opublikowanej w Endokrynologii Polskiej (2014; praca nr 3), przedstawiliśmy najważniejsze wyniki, które mogą tłumaczyć to zjawisko. Wykazaliśmy, że podanie progesteronu samicom szczura powoduje wzrost ekspresji genu kodującego NPY i obniżenia ekspresji genu kodującego CART w podwzgórzu. NPY, uwalniany przez neurony jądra łukowatego podwzgórza, jest peptydem silnie pobudzającym łaknienie [21]. Natomiast CART, również uwalniany przez neurony jądra łukowatego, powoduje uczucie sytości i zmniejszenie apetytu [22]. Nasze wyniki wskazują więc, że zachodzący pod wpływem progesteronu wzrost ekspresji genu Npy i obniżenie ekspresji genu Cart w podwzgórzu samic szczura może prowadzić do stymulacji apetytu, co w konsekwencji wpływa na wzrost ilości spożywanego pokarmu, zwiększenie masy ciała i masy tkanki tłuszczowej. Warto również zaznaczyć, że jako pierwsi wykazaliśmy wpływ progesteronu na ekspresję genu Cart. Natomiast nieliczne, dostępne w piśmiennictwie wyniki badań dotyczących wpływu progesteronu na ekspresję genu Npy nie prowadzą do jednoznacznych wniosków [23]. Dlatego też nasze wyniki dostarczają nowych informacji na temat działania progesteronu w podwzgórzu. Również jako pierwsi wykazaliśmy, że progesteron prowadzi do obniżenia ekspresji genu receptora progesteronu w podwzgórzu samic szczura (podobnie jak ma to miejsce w podskórnej tkance tłuszczowej (praca nr1)). Obecność receptora progesteronu w podwzgórzu [24], jak również obecność elementów odpowiedzi na progesteron w rejonie promotorowym genu Npy i Cart (analizy opisane w pracy nr 3) oraz obniżenie ekspresji genu receptora progesteronu w podwzgórzu wskazują na bezpośredni udział progesteronu w regulacji ekspresji genów kodujących badane neuropeptydy. U samców podanie progesteronu nie ma wpływu na ekspresję badanych genów neuropeptydów i receptora progesteronu w podwzgórzu, co ma konsekwencje w braku zmian w ilości spożywanego pokarmu, masie ciała i masie tkanki tłuszczowej. Badania, których wyniki zostały opublikowane w J. Steroid Biochem. Mol. Biol. w 2013 roku (publikacja nr 2) i w 2015 roku (publikacja nr 4) dotyczą wpływu progesteronu na metaboliczną funkcję tkanki tłuszczowej. Wyniki badań przedstawione w publikacji nr 2, wskazują, że wzrost masy podskórnej tkanki tłuszczowej samic szczura pod wpływem progesteronu jest związany ze: - wzrostem poziomu mrna i aktywności enzymów lipogennych, takich jak: syntaza kwasów tłuszczowych (FASN), karboksylaza acetylo-coa 1 (ACACA), ATP-liaza cytrynianowa 7

(ACLY), enzym jabłczanowy (ME1), dehydrogenaza glukozo-6-fosforanowa (H6PD), dehydrogenaza 6-fosfoglukonianowa (PGD); - wzrostem poziomu mrna desaturazy stearoilo-coa 1 (SCD1, enzym uczestniczący w desaturacji kwasów tłuszczowych) i acylotransferazy diacyloglicerolowej (DGAT1, enzym uczestniczący w procesie syntezy TAG); - wzrostem ekspresji genu (mierzony poziomem mrna oraz białka) kodującego czynnik transkrypcyjny SREBF1 (znany również jako SREBP1), biorący udział w regulacji ekspresji genów enzymów lipogennych [25]; - wzrostem poziomu mrna S14 białka uczestniczącego w regulacji procesu lipogenezy [26]. Ekspresję genów kodujących wszystkie wyżej wymienione białka sprawdziliśmy również w okołonerkowej i przymacicznej tkance tłuszczowej samic szczura. W żadnym z tych skupisk WAT, jak również w wątrobie, nie zaobserwowaliśmy zmian w ekspresji badanych genów. Wykazaliśmy również, że podanie progesteronu samcom szczura nie ma wpływu na proces lipogenezy i syntezy TAG w trzech głównych skupiskach WAT (okołonerkowa, z okolic najądrzy i podskórna WAT) oraz w wątrobie tych zwierząt. Działanie mifepristonu przedstawiliśmy na przykładzie ekspresji genu Me1 i Srebf1, ukazując wpływ tego związku (u szczurów kontrolnych i traktowanych progesteronem) na poziom mrna (ME i SREBP) oraz poziom białka i aktywność ME1. Warto również wspomnieć, że poziom białka ME1 został zbadany metodą Western blotting z wykorzystaniem przeciwciał niekomercyjnych, uzyskanych przez autorkę. Chociaż mechanizm działania progesteronu w WAT nie został dokładnie wyjaśniony, nasze wyniki sugerują, że progesteron wiążąc się ze swoim receptorem prowadzi do wzrostu ekspresji genu Srebf1. Następstwem wzrostu poziomu mrna SREBF1 jest wzrost poziomu aktywnej formy SREBF1 (68kDa), posiadającej aktywność czynnika transkrypcyjnego, co z kolei może prowadzić do indukcji ekspresji badanych genów. Wpływ czynnika transkrypcyjnego SREBF1 na wzrost ekspresji genów enzymów lipogennych został potwierdzony w wielu różnych badaniach [27]. Wzrost ekspresji genu S14 dodatkowo wskazuje na stymulację lipogenezy w podskórnej tkance tłuszczowej pod wpływem progesteronu. Choć dokładna funkcja S14 nie została jeszcze określona, wykazano, że bierze ono udział w regulacji lipogenezy, możliwe że jako czynnik uczestniczący w ścieżce aktywacji SREBF1. Wykazano również wpływ progesteronu na wzrost ekspresji genu Srebf1 and Fasn w preadipocytach [28]. Niewykluczone jest jednak bezpośrednie oddziaływanie kompleksu progesteron- 8

receptor progesteronu z rejonem promotorowym badanych genów. Mimo że nasze wyniki sugerują genomowy mechanizm działania progesteronu, nie można wykluczyć również niegenomowej ścieżki działania tego hormonu w podskórnej tkance tłuszczowej samic szczura. Nasze wyniki mają nie tylko ważny aspekt poznawczy, ale również mogą mieć znaczenie praktyczne. Uzyskane informacje mogą wyjaśnić molekularny mechanizm działania progesteronu na ludzką tkankę tłuszczową oraz molekularne przyczyny efektów ubocznych (np.: przyrost masy ciała), obserwowanych w czasie stosowania progesteronu lub jego analogów. Powszechnie wiadomo, że podczas ciąży, kiedy stężenie progesteronu w krwi jest znacząco podwyższone, dochodzi do wzrostu masy ciała i tkanki tłuszczowej. Można więc przypuszczać, że u kobiet w ciąży progesteron może zwiększać ekspresję genów enzymów związanych z syntezą kwasów tłuszczowych i TAG w podobny sposób jak u samic szczura, którym podano ten hormon. Wzrost masy tkanki tłuszczowej może być uwarunkowany nie tylko wzrostem syntezy lipidów, ale również zahamowaniem procesu hydrolizy magazynowanych w adipocytach TAG. W celu sprawdzenia, czy progesteron ma wpływ na lipolizę, postanowiliśmy zbadać ekspresję genów kodujących dwa kluczowe enzymy tego procesu - ATGL (lipaza charakterystyczna dla tkanki tłuszczowe) i HSL (lipaza wrażliwa na hormony) [29] oraz białka uczestniczące w regulacji aktywności tych enzymów: perilipina 1, ABHD5 (abhydrolase domain containing 5), G0S2 (G0/G1switch 2) [30]. Model opisujący udział tych białek w regulacji lipolizy można streść następująco. Stymulacja lipolizy związana jest z fosforylacją perilipiny 1, występującej na powierzchni kropli lipidowej. Tak zmodyfikowana perilipina 1 wiąże ufosforylowaną (aktywną) HSL, umożliwiając jej umiejscowienie na powierzchni kropli lipidowej [7]. Jednocześnie fosforylacja perilipiny1 prowadzi do uwolnienia związanego z nią białka ABHD5, które wiążąc się z ATGL prowadzi do wzrostu jej aktywności [31]. ATGL hydrolizuje głównie TAG do DAG i kwasu tłuszczowego, następnie HSL prowadzi do rozpadu DAG na MAG i wolny kwas tłuszczowy [32]. Kolejna lipaza hydrolizuje MAG do glicerolu i kwasu tłuszczowego. Produkty procesu lipolizy (glicerol i wolne kwasy tłuszczowe) są uwalniane z adipocytów do krwi. Oprócz ABHD5, na aktywność ATGL ma wpływ niedawno odkryty, naturalny inhibitor tego enzymu białko G0S2 [33]. Wykazano, że G0S2 hamuje aktywność ATGL nawet w obecności jego aktywatora ABHD5 [34]. 9

Wyniki dotyczące procesu lipolizy przedstawiliśmy w pracy opublikowanej w 2015 roku w J. Steroid Biochem. Mol. Biol. (praca nr 4). Wykazaliśmy, że pod wpływem progesteronu w podskórnej tkance tłuszczowej samic szczura dochodzi do: a) obniżenia poziomu mrna oraz białka HSL; b) wzrostu poziomu mrna i białka G0S2; c) wzrostu poziomu mrna i białka ABHD5; d) braku zmian w poziomie ekspresji genu kodującego ATGL; e) braku zmian w poziomie mrna i białka perilipiny 1. Podanie zwierzętom mifepristonu prowadzi do zniesienia wpływu progesteronu na ekspresję badanych genów, co sugeruje że obserwowane pod wpływem tego hormonu zmiany w procesie lipolizy są związane z aktywacją receptora progesteronu w podskórnej tkance tłuszczowej. Również obecność sekwencji wiążących receptor progesteronu w rejonie promotorowym genów kodujących HSL, ABHD5 i G0S2 (bioinformatyczne analizy przedstawione w pracy) świadczy o możliwości bezpośredniego udziału receptora progesteronu w regulacji ekspresji tych genów. Jako pierwsi wykazaliśmy również, że podanie progesteronu samicom szczura prowadzi do obniżenia stymulowanej lipolizy. Szybkość tego procesu mierzyliśmy ilością uwalnianych kwasów tłuszczowych i glicerolu przez eksplanty podskórnej tkanki tłuszczowej pochodzącej od zwierząt traktowanych hormonem, inkubowane w obecności forskoliny lub dibutyrylo-camp (stymulacja lipolizy). Udowodniliśmy na modelu zwierzęcym, że wywołane progesteronem obniżenie tempa stymulowanej lipolizy w podskórnej tkance tłuszczowej samic szczura jest prawdopodobnie związane z obniżeniem ekspresji genu Hsl i wzrostem ekspresji genu G0s2, kodującego inhibitor ATGL. Oba kluczowe enzymy procesu lipolizy mogą być więc celem działania progesteronu. Warto również dodać, że wykazaliśmy, iż poziom ufosforylowanej formy HSL nie zmienia się pod wpływem progesteronu w podskórnej tkance tłuszczowej samic. Wzrost ekspresji genu Abhd5, kodującego aktywator ATGL nie prowadzi do wzrostu procesu lipolizy. Możliwe, że wzrost ekspresji tego genu związany jest z innymi funkcjami tego białka w komórce (wykazano, że ABHD5 ma również aktywność acylotransferazy kwasu lizososfatydowego [35]). W przypadku innych skupisk WAT u samic, jak również we wszystkich badanych skupiskach WAT u samców, nie zaobserwowaliśmy zmian w szybkości stymulowanej lipolizy i ekspresji badanych genów pod wpływem progesteronu. Nasze badania dotyczące wpływu progesteronu na aktywność lipolityczną tkanki tłuszczowej potwierdzają istnienie tkankowo-specyficznego i zależnego od płci efektu progesteronu na 10

ekspresję różnych genów. Zależne od anatomicznej lokalizacji WAT działanie progesteronu może mieć znaczenie w regulacji metabolizmu ogólnoustrojowego. Ostatnio opublikowane dane wskazują, że częściowe hamowanie lipolizy (ograniczone jedynie do danych skupisk tkanki tłuszczowej) może wywierać korzystny wpływ na metabolizm glukozy i wrażliwość na insulinę [36]. Podobnie jak w przypadku wyżej omawianych prac, wyniki przedstawione w tej publikacji mogą mieć znaczenie nie tylko poznawcze, ale również praktyczne. Wskazują one, że obniżenie tempa lipolizy pod wpływem progesteronu może być ważnym czynnikiem prowadzącym do wzrostu ilości TAG gromadzonych w adipocytach u kobiet podczas ciąży. W omawianej pracy zamieściliśmy również wyniki nie związane bezpośrednio z procesem lipolizy, ale wzbogacające stan wiedzy na temat wpływu progesteronu na metabolizm adipocytów. Wykazaliśmy brak wpływu progesteronu na ekspresję genu Cidec, kodującego specyficzne dla tkanki tłuszczowej białko występujące na powierzchni kropli lipidowej. Nie zaobserwowaliśmy również istotnych statystycznie zmian w poziomie mrna LPL (lipaza lipoproteinowa) i PPARG (jądrowy receptor aktywowany przez proliferatory peroksysomów gamma) w tkance tłuszczowej samic i samców szczura traktowanych progesteronem w porównaniu do zwierząt kontrolnych. Wyniki przedstawione w obu pracach dotyczących wpływu progesteronu na metaboliczną funkcję tkanki tłuszczowej sugerują, że zależna od anatomicznej lokalizacji oraz płci zwiększona synteza lipidów i hamowanie stymulowanej lipolizy są głównymi czynnikami odpowiedzialnymi za wzrost masy podskórnej tkanki tłuszczowej. Przedstawione na modelu zwierzęcym, molekularne mechanizmy działania progesteronu prowadzące do wzrostu magazynowania TAG w podskórnej tkance tłuszczowej mogą sugerować, w jaki sposób progesteron może działać u kobiet w ciąży lub osób stosujących duże dawki progesteronu lub jego analogu w ramach hormonalnej terapii zastępczej lub leczenia. Podsumowując wyniki przedstawione w wyżej opisanych pracach można stwierdzić, że długotrwale podwyższone stężenie progesteronu w surowicy krwi samic szczura prowadzi do zmian w ekspresji genów związanych z metabolizmem lipidów i syntezą adipokin w podskórnej tkance tłuszczowej oraz genów związanych z regulacją procesu łaknienia w podwzgórzu (Ryc. 1). Najważniejsze efekty działania progesteronu u samic szczura to: 1. wzrost masy ciała i masy podskórnej tkanki tłuszczowej; 2. wzrost ilości spożywania pokarmu związany z obniżeniem ekspresji genu Cart i wzrostem ekspresji genu Npy w podwzgórzu; 11

3. wzrost ekspresji genów związanych z syntezą kwasów tłuszczowych i TAG oraz regulacją tych procesów w podskórnej tkance tłuszczowej; 4. obniżenie ekspresji genu Hsl i wzrost ekspresji genu G0s2 (kodującego inhibitor ATGL), czego skutkiem jest zmniejszenie tempa stymulowanej lipolizy w podskórnej tkance tłuszczowej; 5. wzrost ekspresji genów kodujących leptynę i rezystynę oraz obniżenie ekspresji genu kodującego adiponektynę w podskórnej tkance tłuszczowej; 6. obniżenie ekspresji genu kodującego receptor progesteronu w podskórnej tkance tłuszczowej i podwzgórzu; Bardzo istotnym i jednocześnie oryginalnym osiągnięciem wyżej przedstawionych badań było wykazanie, że progesteron (obok innych hormonów steroidowych) jest odpowiedzialny nie tylko za różnice w metabolizmie wynikające z płci biologicznej, ale również za różnice obserwowane w metabolizmie poszczególnych skupisk tkanki tłuszczowej. Ryc. 1. Podsumowanie głównych efektów działania progesteronu u samic szczura, które zostały przedstawione w czterech opisanych wyżej pracach. 12

Piśmiennictwo: [1] J.D. Graham, C.L. Clarke, Physiological action of progesterone in target tissues. Endocr. Rev. 1997, 18: 502-519. [2] A. Warenik-Szymankiewicz, B. Meczekalski, Progesteron mikronizowany. Jego właściwości oraz zastosowanie w ginekologii i położnictwie. Przegląd Menopauzalny 2005, 1:15-19. [3] D. Shirling, J.P. Ashby, J.D. Baird, Effect of progesterone on lipid metabolism in the intact rat. Journal of Endocrinology 1981, 90: 285-294. [4] M. Lorenzo, T. Caldes, M. Benito and J. M. Medina, Lipogenesis in vivo in maternal and foetal tissues during late gestation in the rat. Biochem. J. 1981, 198: 425-428. [5] C.L. Loprinzi, D.J. Schaid, A.M. Dose, N.L. Burnham, M.D. Jensen, Body-composition changes in patients who gain weight while receiving megestrol acetate. Journal of Clinical Oncology 1993, 11: 152-154. [6] E.E. Kershaw, J.S. Flier, Adipose tissue as an endocrine organ. J. Clin. Endocrinol. Metab. 2004, 89: 2548-2556. [7] T.C. Walther, R.V. Farese Jr., Lipid droplets and cellular lipid metabolism. Annu. Rev. Biochem. 2012, 81: 687-714. [8] J. Girard, D. Perdereau, F. Foufelle, C. Prip-Buus, P. Ferre, Regulation of lipogenic enzyme gene expression by nutrients and hormones. The FASEB Journal 1994, 8: 36-42. [9] N. Satoh, M. Naruse, T. Usui, T. Tagami, T. et al, Leptin-to-adiponectin ratio as a potential atherogenic index in obese type 2 diabetic patients. Diabetes Care 2004, 27: 2488-90. [10] Y. Zhang, R. Proenca, M. Maffei, M. Barone, et al, Positional cloning of the mouse obese gene and its human homologue. Nature 1994, 372: 425-432. [11] T.P. Combs, A.H. Berg, S. Obici, P.E. Scherer, L. Rossetti, Endogenous glucose production is inhibited by the adipose-derived protein Acrp30. J. Clin. Invest. 2001, 108: 1875-1881. [12] T. Yamauchi, J. Kamon, H. Waki, Y. Terauchi, N. Kubota, et al, The fat-derived hormone adiponectin reverses insulin resistance associated with both lipoatrophy and obesity. Nat. Med. 2007, 7: 941-946. [13] C.M. Steppan, M.A. Lazar, The current biology of resistin. J. Intern. Med. 2004, 255: 439-447. [14] F. Machinal, M.N. Dieudonne, M.C. Leneveu, R. Pecquery, Y. Giudicelli, In vivo and in vitro ob gene expression and leptin secretion in rat adipocytes: evidence for a regional specific regulation by sex steroid hormones. Endocrinology 1999, 140: 1567-1574. [15] J.M. Gray, G.N. Wade, Cytoplasmic progestin binding in rat adipose tissues. Endocrinology 1979, 104: 1377-1382. [16] J.M. Gray, G.N. Wade, Cytoplasmic estrogen, but not progestin, binding sites in male rat adipose tissues. Am. J. Physiol. 1980, 239: E237-E241. [17] B.S. Katzenellenbogen, Dynamics of steroid hormone receptor action. Annu. Rev. Physiol. 1980, 42: 17-35. [18] E. Grueso, M. Rocha, M. Puerta, Plasma and cerebrospinal fluid leptin levels are maintained despite enhanced food intake in progesterone-treated rats. Eur J Endocrinol 2001, 144: 659-665. 13

[19] J.P. Wilding, Neuropeptides and appetite control, Diabet. Med. 2002, 19: 619-27. [20] N. Ducharme, W.A. Banks, J.E. Morley et al. Brain distribution and behavioral effects of progesterone and pregnenolone after intranasal or intravenous administration. Eur J Pharmacol 2010, 641: 128-134. [21] P. Magni, Hormonal control of the neuropeptide Y system, Curr. Prot. Pept. Sci. 2003, 4: 45-57. [22] J. Lau, H. Herzog, CART in the regulation of appetite and energy homeostasis. Front Neurosci. 2014, 8: 313. [23] M.L. Trujillo, C. Spuch, E. Carro, R. Senaris, Hyperphagia and central mechanisms for leptin resistance during pregnancy. Endocrinology 2011, 152: 1355-1365. [24] G.E. Carrillo-Martinez, P. Gomora-Arrati, A. Gonzalez-Arenas, S. Morimoto, I. Camacho-Arroyo, O. Gonzalez-Flores, Role of progesterone receptors during postpartum estrus in rats. Horm Behav 2011, 59: 37-43. [25] J.D. Horton, J.L. Goldstein, M.S. Brown, SREBPs: activators of the complete program of cholesterol and fatty acid synthesis in the liver. Journal of Clinical Investigation 2002, 109: 1125-1131. [26] L.T. LaFave, L.B. Augustin, C.N. Mariash, S14: insights from knockout mice. Endocrinology 2006, 147: 4044-4047. [27] A.K. Stoeckman, H.C. Towle, The role of SREBP-1c in nutritional regulation of lipogenic enzyme gene expression. J. Biol. Chem. 2002, 277: 27029-27035. [28] D. Lacasa, X. Le Liepvre, P. Ferre, I. Dugail, Progesterone stimulates adipocyte determination and differentiation 1/sterol regulatory element-binding protein 1c gene expression. Potential mechanism for the lipogenic effect of progesterone in adipose tissue. J. Biol. Chem. 2001, 276: 11512-11516. [29] P. Arner, D. Langin, The role of neutral lipases in human adipose tissue lipolysis. Curr. Opin. Lipidol. 2007, 18: 246-250. [30] A. Girousse, D. Langin, Adipocyte lipases and lipid droplet-associated proteins: insight from transgenic mouse models. Int. J. Obes. (Lond.) 2012, 36: 581-594. [31] H. Wang, M. Bell, U. Sreenivasan, H. Hu, J. Liu et al, Unique regulation of adipose triglyceride lipase (ATGL) by perilipin 5, a lipid droplet-associated protein. J. Biol. Chem. 2011, 286: 15707-15715. [32] R. Zechner, R. Zimmermann, T.O. Eichmann, S.D. Kohlwein, G. Haemmerle, A. Lass, F. Madeo, FAT SIGNALS lipases and lipolysis in lipid metabolism and signaling. Cell Metab. 2012, 15: 279-291. [33] A. Lass, R. Zimmermann, M. Oberer, R. Zechner, Lipolysis - a highly regulated multi-enzyme complex mediates the catabolism of cellular fat stores, Prog. Lipid. Res. 2011, 50: 14-27. [34] G. Haemmerle, R. Zimmermann, M. Hayn, C. Theussl, G. Waeg, E. Wagner, W. Sattler, T.M. Magin, E.F. Wagner, R. Zechner, Hormone-sensitive lipase deficiency in mice causes diglyceride accumulation in adipose tissue, muscle, and testis, J. Biol. Chem. 2002, 277: 4806-4815. [35] A.K. Ghosh, G. Ramakrishnan, C. Chandramohan, R. Rajasekharan, CGI-58, the causative gene for Chanarin- Dorfman syndrome, mediates acylation of lysophosphatidic acid. J. Biol. Chem. 2008, 283: 24525-24533. [36] A. Girousse, G. Tavernier, C. Valle, C. Moro, N. Mejhert, et al, Partial inhibition of adipose tissue lipolysis improves glucose metabolism and insulin sensitivity without alteration of fat mass, PLoS. Biol. 2013, 11 e1001485. 14

5. Omówienie pozostałych osiągnięć naukowo-badawczych 1. Stelmanska E, Sledzinski T, Turyn J, Presler M, Korczynska J, Swierczynski J. Chemerin gene expression is regulated by food restriction and food restrictionrefeeding in rat adipose tissue but not in liver. Regul Pept. 2013; 181:22-9. 2. Sledzinski T, Turyn J, Stelmanska, E Presler M, Klimek J, Swierczynski J. Chronic food restriction up-regulates 11-β-hydroxysteroid dehydrogenase. Centr. Eur. J. Biol. 2011; 6:312-319. 3. Sucajtys-Szulc E, Turyn J, Goyke E, Korczynska J, Stelmanska E, Slominska E, Smolenski RT, Rutkowski B, Swierczynski J. Differential effect of prolonged food restriction and fasting on hypothalamic malonyl-coa concentration and expression of orexigenic and anorexigenic neuropeptides genes in rats. Neuropeptides. 2010; 44:17-23. 4. Nogalska A, Stelmanska E, Sledzinski T, Swierczynski J. Surgical removal of perirenal and epididymal adipose tissue decreases serum leptin concentration and increases lipogenic enzyme activities in remnant adipose tissue of old rats. Gerontology. 2009; 55:224-8. 5. Sucajtys-Szulc E, Goyke E, Korczynska J, Stelmanska E, Rutkowski B, Swierczynski J. Refeeding after prolonged food restriction differentially affects hypothalamic and adipose tissue leptin gene expression. Neuropeptides. 2009; 43:321-5. 6. Adrych K, Smoczynski M, Stelmanska E, Swierczynski J. Adipocytokine levels in chronic pancreatitis: reply. Pancreas 2009; 38:471. 7. Adrych K, Smoczynski M, Stelmanska E, Swierczynski J. The role of leptin in idiopathic chronic pancreatitis?: reply. Pancreas 2009; 38:469-470. 8. Stelmanska E. The important role of GLUT2 in intestinal sugar absorption. Postępy Biochem. 2009; 55:385-7. 9. Turyn J, Korczynska J, Presler M, Stelmanska E, Goyke E, Swierczynski J. Upregulation of rat adipose tissue adiponectin gene expression by long-term but not by short-term food restriction. Mol Cell Biochem. 2008; 312:185-91. 10. Sucajtys-Szulc E, Goyke E, Korczynska J, Stelmanska E, Rutkowski B, Swierczynski J. Chronic food restriction differentially affects NPY mrna level in neurons of the hypothalamus and in neurons that innervate liver. Neurosci Lett. 2008; 433:174-7. 11. Adrych K, Smoczynski M, Stelmanska E, Korczynska J, Goyke E, Swierczynski J. Serum adiponectin and leptin concentrations in patients with chronic pancreatitis of alcoholic and nonalcoholic origin. Pancreas. 2008; 36:120-4. 12. Szolkiewicz M, Chmielewski M, Nogalska A, Stelmanska E, Swierczynski J, Rutkowski B. The potential role of sterol regulatory element binding protein transcription factors in renal injury. J Ren Nutr. 2007; 17:62-5. 15

13. Adrych K, Smoczynski M, Goyke E, Stelmanska E, Swierczynski J. Decreased serum leptin concentration in patients with chronic pancreatitis. Pancreas. 2007; 34:417-22. 14. Stelmanska E. Regulacja ekspresji genu cytosolowego enzymu jabłczanowego w narządach lipogennych. Postepy Hig Med Dosw. 2007; 61:664-71. 15. Stelmanska E, Sucajtys-Szulc E, Korczynska J, Adrych K, Swierczynski J. Diversity of SREBP-1 gene expression in rat adipose tissue depots in response to refeeding after food restriction. Biochim Biophys Acta. 2005; 1733:130-6. 16. Szolkiewicz M, Sucajtys E, Wolyniec W, Rutkowski P, Stelmanska E, Korczynska J, Swierczynski J, Rutkowski B. Mechanisms of enhanced carbohydrate and lipid metabolism in adipose tissue in uremia. J Ren Nutr. 2005; 15:166-72. 17. Stelmanska E, Korczynska J, Swierczynski J. Tissue-specific effect of refeeding after short- and long-term caloric restriction on malic enzyme gene expression in rat tissues. Acta Biochim Pol. 2004; 51:805-14. 18. Korczynska J, Stelmanska E, Nogalska A, Szolkiewicz M, Goyke E, Swierczynski J, Rutkowski B. Upregulation of lipogenic enzymes genes expression in white adipose tissue of rats with chronic renal failure is associated with higher level of sterol regulatory element binding protein-1. Metabolism. 2004; 53:1060-5. 19. Rutkowski B, Szolkiewicz M, Korczynska J, Sucajtys E, Stelmanska E, Nieweglowski T, Swierczynski J. The role of lipogenesis in the development of uremic hyperlipidemia. Am J Kidney Dis. 2003; 41:84-8. 20. Korczynska J, Stelmanska E, Swierczynski J. Differential effect of long-term food restriction on fatty acid synthase and leptin gene expression in rat white adipose tissue. Horm Metab Res. 2003; 35:593-7. 21. Rutkowski B, Łososowska R, Król E, Kisielnicka E, Zdrojewski Z, Szołkiewicz M, Niewegłowski T, Chmielewski M, Sucajtys E, Swierczyński J, Korczyńska J, Stelmańska E, Goyke E, Bogusławski W. Patomechanizm hiperlipoproteinemii w przewlekłej niewydolności nerek. Pol Merkur Lekarski. 2003; 15:322-3. 22. Szolkiewicz M, Nieweglowski T, Korczynska J, Sucajtys E, Stelmanska E, Goyke E, Swierczynski J, Rutkowski B. Upregulation of fatty acid synthase gene expression in experimental chronic renal failure. Metabolism. 2002; 51:1605-10. 23. Korczynska J, Stelmanska E, Nieweglowski T, Szołkiewicz M, Rutkowski B, Swierczyński J.Effect of clofibrate on plasma lipid concentration and liver malic enzyme gene expression in rats with experimental chronic renal failure. Pol J Pharmacol. 2000; 52:291-7. 16

24. Wojciechowska I, Kochanska B, Stelmanska E, Knap N, Mackiewicz Z, Kupryszewski G. Statherin and its shortened analogues. Pol. J. Chem. 1998;72: 2098-2102. 25. Wojciechowska I, Kochańska B, Stelmańska E, Maćkiewicz Z, Kupryszewski G. Statherin and its shortened analogues. Peptides. 1998; 532-533. Moje powyższe prace, niewchodzące w skład osiągnięcia naukowego z pkt. 4, dotyczą trzech głównych tematów: A. Wpływ diety redukcyjnej na metabolizm lipidów: a) Wpływ diety redukcyjnej na regulację ekspresji genu enzymu jabłczanowego w narządach szczura b) Wpływ diety redukcyjnej na regulację ekspresji genów kodujących enzymy lipogenne, neuropeptydy, niektóre adipokiny oraz inne białka związane z metabolizmem lipidów w narządach szczura B. Badania nad adipokinami w przewlekłym zapaleniu trzustki C. Biosynteza lipidów w przewlekłej doświadczalnej niewydolności nerek A. Wpływ diety redukcyjnej na metabolizm lipidów a) Wpływ diety redukcyjnej na regulację ekspresji genu enzymu jabłczanowego w narządach szczura Cykl prac (5.14, 5.15, 5.17) dotyczących tego tematu stanowił podstawę i był jednocześnie rozszerzeniem mojej pracy doktorskiej. Cytosolowy enzym jabłczanowy (ME1) występuje w wielu narządach ssaków. W wątrobie i tkance tłuszczowej dostarcza on równoważników redukcyjnych niezbędnych w procesie lipogenezy i syntezy cholesterolu. U szczurów głodzonych obserwuje się znaczne obniżenie aktywności ME1 w wątrobie i tkance tłuszczowej. Natomiast karmienie zwierząt dietą bogatą w węglowodany powoduje wielokrotny wzrost aktywności tego enzymu. Biorąc pod uwagę, że ograniczenie ilości spożywanego pokarmu jest często stosowane przez osoby odchudzające się, zbadanie wpływu diet redukcyjnych (ograniczenie ilości spożywanego pokarmu do 85, 70 lub 50%) i następującego po nich karmienia do syta na ekspresję genu Me1 było interesujące zarówno z poznawczego, jak i praktycznego punktu widzenia. Jako pierwsi wykazaliśmy, że 17

ograniczenie podaży pokarmu szczurom laboratoryjnym i następujące po nim karmienie ad libitum prowadzi do wzrostu ekspresji genu Me1 w tkankach lipogennych szczurów w porównaniu do zwierząt kontrolnych jedzących do syta (5.17). Ekspresję genu Me1 mierzyliśmy oznaczając poziom mrna, białka i aktywność enzymu jabłczanowego. Zmiany te są bardziej nasilone u zwierząt poddanych 30-dniowej diecie redukcyjnej i następnie karmionych ad libitum w porównaniu do zwierząt poddanych takim samym zmianom żywieniowym przez okres 3 dni. Zaobserwowaliśmy również, że efekt ten jest charakterystyczny tylko dla wątroby oraz białej i brunatnej tkanki tłuszczowej, gdyż dieta redukcyjna i następujące po niej karmienie ad libitum nie prowadzi do zmian ekspresji genu Me1 w sercu, mózgu, mięśniu szkieletowym i korze nerki. Wykazaliśmy również, że białko SREBP-1 (obecnie znane jako SREBF-1) może być jednym z czynników transkrypcyjnych odpowiedzialnych za zmiany w ekspresji genu Me1 w tkance tłuszczowej badanych zwierząt (praca 5.17 i 5.15), gdyż zmiany w ekspresji genu Srebp1 korelują ze zmianami aktywność ME1. Pokazaliśmy również, że poziom mrna SREBP-1 i formy prekursorowej (mikrosomalnej) tego białka jest wyższy w tzw. wewnętrznych skupiskach tkanki tłuszczowej (WAT okołonerkowy i z okolic najądrzy) niż w podskórnej tkance tłuszczowej szczurów kontrolnych i poddanych diecie restrykcyjnej. Również analiza ekspresji genu Me1 w tych trzech głównych skupiskach tkanki tłuszczowej wykazała, że najwyższy poziom ekspresji tego genu występuje w okołonerkowej tkance tłuszczowej tych szczurów (praca 5.15). Wyniki tych badań były prezentowane na kilku konferencjach krajowych i były finansowane przez Ministerstwo Nauki i Szkolnictwa Wyższego w ramach projektu promotorskiego, którego byłam głównym wykonawcą. Doświadczenie i wiedza zdobyte podczas realizacji tego projektu skłoniły mnie do napisania przeglądu na temat regulacji ekspresji genu Me1 (praca 5.14). Podsumowanie najważniejszych wyników 1. Dieta redukcyjna i następujące po niej karmienie ad libitum prowadzi do wzrostu ekspresji genu Me1 w tkankach lipogennych szczurów. 2. Zmiany ekspresji genu Srebp1 korelują ze zmianami ekspresji genu Me1 w tkance tłuszczowej badanych zwierząt. 3. Ekspresja genu Srebp1 i Me1 jest wyższa w tzw. wewnętrznych skupiskach tkanki tłuszczowej w porównaniu do podskórnej tkanki tłuszczowej. 18

b) Wpływ diety redukcyjnej na regulację ekspresji genów kodujących enzymy lipogenne, neuropeptydy, niektóre adipokiny oraz inne białka związane z metabolizmem lipidów w narządach szczura Opisany wyżej eksperymentalny model diety redukcyjnej rozszerzyliśmy o grupę zwierząt, które przez 30 dni były poddane diecie redukcyjnej i nie były następnie karmione ad libitum. Ta grupa zwierząt miała symulować zachowanie się osób, które racjonalnie stosują diety redukcyjne. Wykonaliśmy szereg analiz w obu grupach zwierząt (poddanych tylko diecie redukcyjnej oraz diecie redukcyjnej zakończonej 48 godzinnym karmieniem do syta), które zaowocowały powstaniem kilku prac. Wykazaliśmy, że podobnie jak w przypadku ME1, ekspresja genów kodujących inne enzymy lipogenne wzrasta w tkance tłuszczowej szczurów poddanych zarówno diecie redukcyjnej, jak i diecie redukcyjnej zakończonej karmieniem ad libitum. Przy czym wzrost ekspresji tych genów (podobnie jak szybkość procesu lipogenezy in vivo) był wyższy u szczurów karmionych ad libitum po zakończeniu diety niż u zwierząt poddanych tylko diecie redukcyjnej. Część z tych wyników dotycząca kluczowego enzymu lipogennego syntazy kwasów tłuszczowych (FAS) została opublikowana w Horm Metab Res (praca 5.20). W latach 2006-2009 uczestniczyłam w projekcie badawczym zatytułowanym: Regulacja ekspresji genów enzymów metabolizujących malonylo-coa oraz stężenie malonylo-coa w podwzgórzu szczurów karmionych dietą redukcyjną. Zasadniczym celem projektu było wyjaśnienie roli enzymów lipogennych w regulacji łaknienia w podwzgórzu szczurów poddanych diecie redukcyjnej oraz szczurów poddanych diecie redukcyjnej i następnie karmionych ad libitum. Uzyskane przez nas wyniki (opublikowane w renomowanych czasopismach) wskazują, że dieta redukcyjna oraz dieta redukcyjna i następujące po niej karmienie ad libitum nie mają wpływu na aktywność syntazy kwasów tłuszczowych, karboksylazy acetylo-coa oraz na intensywność lipogenezy (mierzonej in vivo) w podwzgórzu szczurów (praca 5.3). Natomiast w wątrobie i tkance tłuszczowej tych samych szczurów, dieta redukcyjna oraz dieta redukcyjna i następujące po niej karmienie do syta powoduje odpowiednio około dwukrotny i wielokrotny wzrost ekspresji badanych genów. W wyniku stosowania diety redukcyjnej intensywność lipogenezy nie ulega zmianie w tkance tłuszczowej, natomiast obniża się w wątrobie. Dieta redukcyjna i następujące po niej karmienie ad libitum powoduje wielokrotny wzrost intensywności lipogenezy zarówno w wątrobie jak i w tkance tłuszczowej. Wyniki tych badań sugerują, że lipogeneza w 19

podwzgórzu, w odróżnieniu od lipogenezy w wątrobie i tkance tłuszczowej, jest niewrażliwa na zmiany diety. Wykazaliśmy również, że dieta redukcyjna powoduje wzrost ekspresji genów kodujących NPY i AgRP (neuropeptydy stymulujące łaknienie) oraz obniżenie ekspresji genów kodujących CART i POMC (neuropeptydy hamujące łaknienie). Natomiast dieta redukcyjna i następujące po niej karmienie powodują obniżenie ekspresji genu kodującego NPY i nie wpływają w porównaniu z dietą redukcyjną na ekspresję genu kodującego AgRP i CART oraz powodują nieznaczne obniżenie ekspresji genu kodującego POMC. Wyniki naszych badań wskazują na brak zależności pomiędzy ekspresją genów kodujących kluczowe enzymy lipogenne w podwzgórzu a ekspresją genów kodujących neuropeptydy regulujące łaknienie u szczurów poddanych diecie redukcyjna oraz diecie redukcyjnej i karmieniu ad libitum. Warto również zaznaczyć, ze jako pierwsi wykazaliśmy, że dieta redukcyjna oraz następujące po niej karmienie ad libitum powodują nieznaczny, ale statystycznie znamienny wzrost stężenia malonylo-coa w podwzgórzu (praca 5.3). Zmiany stężenia malonylo-coa nie są jednak związane ze zmianami aktywności karboksylazy acetylo-coa, syntazy kwasów tłuszczowych, aktywnością lipogenną oraz ekspresją genów neuropeptydów w podwzgórzu. W ramach realizacji tego projektu wykazaliśmy również, że dieta redukcyjna powoduje obniżenie ekspresji genu leptyny w podwzgórzu i tkance tłuszczowej oraz obniżenie stężenia leptyny w surowicy. Karmienie ad libitum po zakończeniu diety redukcyjnej nie wpływa na ekspresję genu leptyny w podwzgórzu, natomiast stymuluje jego ekspresję w tkance tłuszczowej i powoduje wzrost stężenia leptyny w surowicy. Nie osiąga ona jednak wartości charakterystycznej dla szczurów kontrolnych (prace 5.3, 5.5, 5.10, 5.20). Wykazaliśmy, że dieta redukcyjna prowadzi w tkance tłuszczowej do obniżenia ekspresji genu leptyny i jednocześnie do indukcji ekspresji genów enzymów lipogennych. Wyniki te wyraźnie wskazują na istnienie odwrotnej zależności pomiędzy poziomem leptyny a poziomem enzymów zaangażowanych w syntezę kwasu palmitynowego. Zaobserwowano również, że z wiekiem stężenie leptyny w surowicy szczurów rośnie, czemu towarzyszy obniżenie aktywności enzymów lipogennych w tkance tłuszczowej. Sugeruje to, że leptyna może wpływać hamująco na ekspresję genów enzymów lipogennych. Aby zweryfikować tę hipotezę, opracowaliśmy model badawczy, który polegał na chirurgicznym usunięciu większości trzewnej tkanki tłuszczowej u 12-miesięcznych szczurów charakteryzujących się dużą masą tkanki tłuszczowej i wysokim stężeniem leptyny we krwi. Badania te wykazały obniżenie stężenia leptyny w surowicy oraz wzrost aktywności enzymów lipogennych w tkance tłuszczowej pobranej od zwierząt dwa miesiące po zabiegu. 20

Wyniki te potwierdzają hipotezę o hamującym wpływie leptyny na ekspresję genów enzymów lipogennych w tkance tłuszczowej starych szczurów (praca 5.4). Kontynuując badania dotyczące wpływu diety redukcyjnej na poziom adipokin, zbadaliśmy ekspresję genu kodującego adiponektynę i chemerynę w tkance tłuszczowej szczurów poddanych tej diecie. Wykonane przeze mnie doświadczenia pomiaru poziomu mrna metodą PCR w czasie rzeczywistym, zamieszczone w pracy opublikowanej w Mol Cell Biochem (2008), wykazały, że 30-dniowa dieta redukcyjna prowadzi do wzrost ekspresji genu kodującego adiponektynę w tkance tłuszczowej, czego konsekwencją jest wzrost stężenia tego białka w krwi. Towarzyszy temu obniżenie masy ciała oraz masy tkanki tłuszczowej zwierząt. Na podstawie wyników zamieszczonych w tej pracy zasugerowaliśmy, że korzystny wpływ diety redukcyjnej na organizm człowieka może wynikać ze wzrostu ekspresji genu adiponektyny w tkance tłuszczowej, a w konsekwencji ze wzrostu stężenia adiponektyny we krwi (praca 5.9). Chemeryna jest z kolei adipokiną, która odgrywa istotną rolę w regulacji różnicowania i metabolizmu adipocytów. Poziom krążącej chemeryny koreluje z wieloma cechami charakterystycznymi dla zespołu metabolicznego, takimi jak: wysoki poziom triacylogliceroli, wysoki wskaźnik BMI czy podwyższone ciśnienie tętnicze krwi. Białko to odgrywa także istotną rolę w procesie chemotaksji. Co więcej, wykazano, że białko to bierze udział w regulacji lipogenezy. Nie wiele wiadomo jednak na temat wpływu diety na regulację ekspresji genu chemeryny. Wykonane przeze mnie doświadczenia, opublikowane w Regul Pept (2013), wykazały, że 30-dniowa dieta redukcyjna prowadzi u szczurów do obniżenia poziomu chemeryny w surowicy i ekspresji genu chemeryny (poziom mrna i białka) w tkance tłuszczowej, natomiast nie wpływa na poziom ekspresji genu chemeryny w wątrobie. Natomiast 48-godzinne karmienie ad-libitum po 30-dniowej diecie redukcyjnej spowodowało znaczny wzrost ekspresji genu chemeryny w tkance tłuszczowej w porównaniu do grupy kontrolnej (zwierzęta karmione ad libitum). Towarzyszył temu wzrost stężenia chemeryny w surowicy do poziomu zbliżonego do grupy kontrolnej. Karmienie ad libitum po diecie redukcyjnej nie miało wpływu na poziom ekspresji genu chemeryny w wątrobie. Wykonane przez współautorów pracy badania na pierwotnych hodowlach szczurzych adipocytów wykazały, że insulina prowadzi do indukcji genu kodującego chemerynę. Warto również dodać, że profil zmian stężenia insuliny w surowicy szczurów poddanych diecie redukcyjnej oraz diecie z następującym po niej karmieniem ad libitum koreluje z profilem zmian poziomy mrna chemeryny w WAT. Podobne wyniki, jak w przypadku diety redukcyjnej, 21