steroidów, jest zaangażowana w te skomplikowane i nadal najmniej poznane procesy zachodzące na wczesnym etapie ciąży u świni.

Transkrypt

1 dr hab. Katarzyna Knapczyk-Stwora Zakład Endokrynologii Katedra Fizjologii Zwierząt Instytut Zoologii i Badań Biomedycznych Uniwersytet Jagielloński w Krakowie Ocena pracy doktorskiej mgr. Kamila Dobrzynia pt. Wpływ hormonów steroidowych i prostaglandyn na system adiponektynowy w macicy świni domowej (Sus scrofa domestica) podczas wczesnej ciąży Odkryta w 1996 roku adiponektyna jest jedną z najbardziej obficie wydzielanych przez tkankę tłuszczową adipokin. W ostatnich latach wykazano również ekspresję tego hormonu w tkankach rozrodczych oraz w rozwijającym się płodzie. Występowanie adiponektyny wskazuje na jej plejotropowe działanie, które polega głównie na regulacji homeostazy energetycznej organizmu, a zależność między stanem odżywienia i sukcesem reprodukcyjnym u zwierząt znana jest od dawna. Stąd hormon ten jest jednym z elementów systemu nadzorującego status metaboliczny i funkcjonowanie układu rozrodczego. Badania dotyczące ekspresji adiponektyny i jej receptorów, jak również udziału systemu adiponektynowego w kontroli funkcji macicy oraz rozwoju zarodków i trofoblastów świni domowej w okresie wczesnej ciąży były prowadzone w Katedrze Fizjologii Zwierząt UWM przez Promotora pracy, dr hab. Ninę Smolińską. Przedstawiona mi do recenzji rozprawa doktorska Pana mgr. Kamila Dobrzynia dotycząca wpływu hormonów steroidowych i prostaglandyn na system adiponektynowy w macicy świni domowej podczas wczesnej ciąży jest kontynuacją tych badań. Problematyka ta jest interesująca, gdyż wczesna ciąża jest okresem krytycznym dla przeżycia zarodków. U świni, aż do 40% embrionów jest tracona w okresie matczynego rozpoznania ciąży i następującej po nim implantacji. Są to równocześnie jedne z najbardziej skomplikowanych i najmniej poznanych procesów zachodzących podczas wczesnej ciąży u ssaków, dlatego zagadnienia poruszane przez Doktoranta są jak najbardziej aktualne i godne uwagi. Przedstawiona do oceny rozprawa mgr. Kamila Dobrzynia ma formę spójnego tematycznie zbioru trzech artykułów opublikowanych w latach w recenzowanych, międzynarodowych czasopismach naukowych, indeksowanych w bazie JCR (Journal Citation Reports), o sumarycznym

2 współczynniku oddziaływania (Impact Factor; IF) 5,987. Dwie z oryginalnych prac, opublikowane w Therigenology i Reproduction, Fertility and Development, zawierają również dane uzupełniające do artykułów (tzw. Supplementary data), co wskazuje na ogrom otrzymanych wyników oraz ich szczegółowe i kompleksowe opracowanie. Powyższe publikacje stanowią cykl powiązanych tematycznie badań, których celem było potwierdzenie hipotezy o wpływie hormonów steroidowych (P4, E1, E2) i prostaglandyn (PGE2 i PGF2α) na ekspresję systemu adiponektyny w macicy podczas wczesnej ciąży u świni domowej. Każda z prac wchodzących w skład dysertacji ma bardzo podobny układ doświadczalny. W każdej z nich badano sekrecję adiponektyny oraz ekspresję adiponektyny i jej receptorów na poziomie mrna i białka w inkubowanych in vitro skrawkach błony śluzowej i mięśniowej macicy świni w okresie wczesnej ciąży, pod wpływem odpowiednich steroidów i prostaglandyn. Wszystkie powyższe prace są wieloautorskie liczą od sześciu do siedmiu współautorów. Należy zaznaczyć, że Doktorant jest pierwszym autorem we wszystkich artykułach. Do rozprawy doktorskiej dołączono oświadczenia wszystkich współautorów publikacji, z których wynika, że Doktorant miał udział w opracowaniu koncepcji oraz metodyki badań, wykonaniu analiz laboratoryjnych, opracowaniu wyników i przygotowaniu publikacji do druku. Aczkolwiek trudno określić procentowy udział Doktoranta w powstaniu prac. Oryginalne prace badawcze, które składają się na rozprawę i były poddane wcześniejszej ocenie przez redakcje czasopism i niezależnych recenzentów, zostały opatrzone 27. stronnicowym autorskim opracowaniem w języku polskim. Ta część rozprawy składa się ze streszczeń w języku polskim i angielskim, spisu publikacji składających się na rozprawę doktorską, wstępu, celu i zakresu badań, opisu materiałów i metod, wyników, podsumowania i wniosków oraz wykazu wybranych pozycji piśmiennictwa w liczbie 53. W krótkim wstępie autor dokonuje przeglądu dotychczasowej wiedzy na temat adiponektyny i jej udziału w kontroli funkcji układu rozrodczego i prowadzi do klarownie zdefiniowanego celu pracy, czyli weryfikacji hipotezy badawczej, zakładającej wpływ hormonów steroidowych (P4, E1, E2) i prostaglandyn (PGE2 i PGF2α) na ekspresję systemu adiponektynowego w macicy świni domowej podczas wczesnej ciąży. Doktorant zwraca uwagę na, jak dotąd słabo poznaną, rolę czynników regulujących funkcjonowanie systemu adiponektyny w macicy oraz brak doniesień dotyczących wpływu prostaglandyn na ten system. Badania prowadzone w inkubowanych in vitro skrawkach błony śluzowej i mięśniowej macicy w okresie wczesnej ciąży miały potwierdzić postawioną hipotezę badawczą. Badania prowadzono w następujących dniach

3 ciąży: (migracja embrionów w macicy), (matczyne rozpoznanie ciąży), (implantacja) i (zakończenie implantacji), oraz w dniu cyklu rujowego (okresie pełnej funkcjonalności ciałka żółtego). Bardzo dokładny opis metodyki prowadzonych badań zajmuje aż 6 stron. Stosowane metody to: inkubacje in vitro skrawków błony śluzowej i mięśniowej macicy, reakcja real-time PCR, metoda immunoenzymatyczna (ELISA), Western blotting oraz analiza statystyczna. Wydaje się, że w wielu miejscach wystarczyłoby odesłanie czytelnika do odpowiednich publikacji, w których zawarte są szczegółowe opisy poszczególnych metod. Natomiast zabrakło mi wyjaśnienia dlaczego zastosowano takie stężenia steroidów i prostaglandyn do inkubacji, i jak odnoszą się one do warunków fizjologicznych. Częściowo odpowiedź na to pytanie można znaleźć w dołączonych publikacjach, ale uważam, że informacja ta jest istotna i powinna znaleźć się również w opisie materiałów i metod dołączonego opracowania. Po przeczytaniu tej części nasuwa się kilka pytań. Bardzo prosiłabym Doktoranta o wyjaśnienie dlaczego w przypadku adiponektyny i receptora typu pierwszego adiponektyny stosowano różne stężenia starterów sensownego i antysensownego w reakcji real-time PCR (dla adiponektyny użyto 3-krotnie mniejszego stężenia startera antysensownego, a dla receptora 6-krotnie mniejszego stężenia)? W cytowanych publikacjach, o które oparta jest sekwencja starterów, autorzy stosowali takie samo stężenie dla obu starterów, sensownego i antysensownego. Z jakiego powodu wybrano do detekcji fluorescencji SyberGreen a nie specyficzne sondy TaqMan? Natomiast jeśli chodzi o izolację białka, w jakim buforze lizującym homogenizowano tkanki? Ponadto, w niektórych miejscach Doktorant pisze o hodowli, a w innych o inkubacji in vitro skrawków macicy, podczas gdy nie powinno się używać tych określeń naprzemiennie. W rozdziale Wyniki podsumowano w skondensowanej formie wyniki zawarte w trzech pracach stanowiących rozprawę doktorską. Przy tak dużej ilości wyników praca zyskałaby jeszcze bardziej na przejrzystości gdyby Doktorant zamieścił tabelę, w której zostałyby zebrane wyniki dotyczące zmiany ekspresji mrna i białka adiponektyny i jej receptorów pod wpływem steroidów i prostaglandyn w badanych, różnych okresach wczesnej ciąży i cyklu rujowego. Mam jeszcze uwagę dotyczącą stosowanego przez Doktoranta określenia endometrium i miometrium. Moim zdaniem w języku polskim powinno używać się określenia, odpowiednio, błona śluzowa i błona mięśniowa macicy.

4 Uzyskane przez Doktoranta wyniki wskazują dynamiczne zmiany i różnice w ekspresji mrna i białka dla systemu adiponektynowego pod wpływem badanych czynników. Analizując wyniki w wielu przypadkach uderza brak zgodności między poziomem mrna i białka. Wyjaśnienie znalazłam w dwóch publikacjach, jednak dobrze byłoby, gdyby podobny komentarz znalazł się w opracowaniu. Ogólnym niedociągnięciem opracowania jest właśnie brak komentarza podsumowującego wszystkie trzy publikacje, w którym Doktorant mógłby w pełni wykazać się dojrzałością naukową i umiejętnością kompleksowej interpretacji uzyskanych wyników. Wnioski zamykające polskojęzyczne opracowanie w jednoznaczny sposób pokazują na zrealizowanie postawionych celów pracy i stanowią istotny wkład w dotychczasową wiedzę na temat funkcjonowania systemu adiponektyny w układzie rozrodczym świni. Za najważniejsze osiągnięcie rozprawy doktorskiej Pana mgr. Kamila Dobrzynia uznaję wykazanie, że hormony steroidowe i prostaglandyny, w zależności od zastosowanego stężenia, wpływają na ekspresję genów i koncentrację białek adiponektyny i jej receptorów w macicy świń w okresie wczesnej ciąży, jednak zależne jest to od rodzaju badanej tkanki i okresu ciąży. Jak podsumowuje to sam Doktorant, wyniki te sugerują, że adiponektyna może być jednym z elementów kompleksowego systemu zaangażowanego w regulację procesów matczynego rozpoznania ciąży i implantacji. PODSUMOWANIE Po przeczytaniu pracy doktorskiej nie mam żadnych wątpliwości, że Doktorant uzyskał nowe, interesujące, pionierskie i kompleksowe wyniki, które przynoszą ciekawe informacje dotyczące wpływu hormonów steroidowych i prostaglandyn na system adiponektyny w macicy świni we wczesnym okresie ciąży. Wszystkie powyższe sformułowane przeze mnie uwagi, wynikające z obowiązku recenzenta, nie umniejszają wartości pracy. Wysoko oceniam wartość merytoryczną badań, ich wykonanie i interpretację. Oceniana rozprawa nie tylko dostarcza danych, które wzbogacają już istniejącą wiedzę o nowe informacje, ale również prezentowane wyniki stanowią podstawę do dalszych badań, zmierzających do pełniejszego poznania funkcji adiponektyny podczas wczesnej ciąży. Na tym etapie dochodzi do molekularnego dialogu między zarodkiem a matką prowadzącego do rozpoznania ciąży i implantacji. Badania mgr. Kamila Dobrzynia wskazują, że adiponektyna, obok mikrorna, cząsteczek adhezyjnych, czynników wzrostu i

5 steroidów, jest zaangażowana w te skomplikowane i nadal najmniej poznane procesy zachodzące na wczesnym etapie ciąży u świni. WNIOSEK KOŃCOWY Przedstawiona do oceny rozprawa doktorska mgr. Kamila Dobrzynia: Wpływ hormonów steroidowych i prostaglandyn na system adiponektynowy w macicy świni domowej (Sus scrofa domestica) podczas wczesnej ciąży spełnia warunki określone w artykule 13 Ustawy 1 z dnia 14 marca 2003 r. o stopniach naukowych i tytule naukowym oraz stopniach i tytule w zakresie sztuki (Dz. U. Nr 65, poz. 595; z późniejszymi zmianami) stawiane pracom doktorskim i w związku z powyższym zwracam się do Wysokiej Rady Wydziału Biologii i Biotechnologii Uniwersytetu Warmińsko-Mazurskiego w Olsztynie z wnioskiem o dopuszczenie mgr. Kamila Dobrzynia do dalszych etapów przewodu doktorskiego. Jednocześnie proponuję wyróżnienie recenzowanej przeze mnie rozprawy doktorskiej stosowna nagrodą. Kraków

6 dr hab. Katarzyna Knapczyk-Stwora Zakład Endokrynologii Katedra Fizjologii Zwierząt Instytut Zoologii i Badań Biomedycznych Uniwersytet Jagielloński w Krakowie Ocena pracy doktorskiej mgr. Kamila Dobrzynia pt. Wpływ hormonów steroidowych i prostaglandyn na system adiponektynowy w macicy świni domowej (Sus scrofa domestica) podczas wczesnej ciąży Odkryta w 1996 roku adiponektyna jest jedną z najbardziej obficie wydzielanych przez tkankę tłuszczową adipokin. W ostatnich latach wykazano również ekspresję tego hormonu w tkankach rozrodczych oraz w rozwijającym się płodzie. Występowanie adiponektyny wskazuje na jej plejotropowe działanie, które polega głównie na regulacji homeostazy energetycznej organizmu, a zależność między stanem odżywienia i sukcesem reprodukcyjnym u zwierząt znana jest od dawna. Stąd hormon ten jest jednym z elementów systemu nadzorującego status metaboliczny i funkcjonowanie układu rozrodczego. Badania dotyczące ekspresji adiponektyny i jej receptorów, jak również udziału systemu adiponektynowego w kontroli funkcji macicy oraz rozwoju zarodków i trofoblastów świni domowej w okresie wczesnej ciąży były prowadzone w Katedrze Fizjologii Zwierząt UWM przez Promotora pracy, dr hab. Ninę Smolińską. Przedstawiona mi do recenzji rozprawa doktorska Pana mgr. Kamila Dobrzynia dotycząca wpływu hormonów steroidowych i prostaglandyn na system adiponektynowy w macicy świni domowej podczas wczesnej ciąży jest kontynuacją tych badań. Problematyka ta jest interesująca, gdyż wczesna ciąża jest okresem krytycznym dla przeżycia zarodków. U świni, aż do 40% embrionów jest tracona w okresie matczynego rozpoznania ciąży i następującej po nim implantacji. Są to równocześnie jedne z najbardziej skomplikowanych i najmniej poznanych procesów zachodzących podczas wczesnej ciąży u ssaków, dlatego zagadnienia poruszane przez Doktoranta są jak najbardziej aktualne i godne uwagi. Przedstawiona do oceny rozprawa mgr. Kamila Dobrzynia ma formę spójnego tematycznie zbioru trzech artykułów opublikowanych w latach w recenzowanych, międzynarodowych czasopismach naukowych, indeksowanych w bazie JCR (Journal Citation Reports), o sumarycznym

7 współczynniku oddziaływania (Impact Factor; IF) 5,987. Dwie z oryginalnych prac, opublikowane w Therigenology i Reproduction, Fertility and Development, zawierają również dane uzupełniające do artykułów (tzw. Supplementary data), co wskazuje na ogrom otrzymanych wyników oraz ich szczegółowe i kompleksowe opracowanie. Powyższe publikacje stanowią cykl powiązanych tematycznie badań, których celem było potwierdzenie hipotezy o wpływie hormonów steroidowych (P4, E1, E2) i prostaglandyn (PGE2 i PGF2α) na ekspresję systemu adiponektyny w macicy podczas wczesnej ciąży u świni domowej. Każda z prac wchodzących w skład dysertacji ma bardzo podobny układ doświadczalny. W każdej z nich badano sekrecję adiponektyny oraz ekspresję adiponektyny i jej receptorów na poziomie mrna i białka w inkubowanych in vitro skrawkach błony śluzowej i mięśniowej macicy świni w okresie wczesnej ciąży, pod wpływem odpowiednich steroidów i prostaglandyn. Wszystkie powyższe prace są wieloautorskie liczą od sześciu do siedmiu współautorów. Należy zaznaczyć, że Doktorant jest pierwszym autorem we wszystkich artykułach. Do rozprawy doktorskiej dołączono oświadczenia wszystkich współautorów publikacji, z których wynika, że Doktorant miał udział w opracowaniu koncepcji oraz metodyki badań, wykonaniu analiz laboratoryjnych, opracowaniu wyników i przygotowaniu publikacji do druku. Aczkolwiek trudno określić procentowy udział Doktoranta w powstaniu prac. Oryginalne prace badawcze, które składają się na rozprawę i były poddane wcześniejszej ocenie przez redakcje czasopism i niezależnych recenzentów, zostały opatrzone 27. stronnicowym autorskim opracowaniem w języku polskim. Ta część rozprawy składa się ze streszczeń w języku polskim i angielskim, spisu publikacji składających się na rozprawę doktorską, wstępu, celu i zakresu badań, opisu materiałów i metod, wyników, podsumowania i wniosków oraz wykazu wybranych pozycji piśmiennictwa w liczbie 53. W krótkim wstępie autor dokonuje przeglądu dotychczasowej wiedzy na temat adiponektyny i jej udziału w kontroli funkcji układu rozrodczego i prowadzi do klarownie zdefiniowanego celu pracy, czyli weryfikacji hipotezy badawczej, zakładającej wpływ hormonów steroidowych (P4, E1, E2) i prostaglandyn (PGE2 i PGF2α) na ekspresję systemu adiponektynowego w macicy świni domowej podczas wczesnej ciąży. Doktorant zwraca uwagę na, jak dotąd słabo poznaną, rolę czynników regulujących funkcjonowanie systemu adiponektyny w macicy oraz brak doniesień dotyczących wpływu prostaglandyn na ten system. Badania prowadzone w inkubowanych in vitro skrawkach błony śluzowej i mięśniowej macicy w okresie wczesnej ciąży miały potwierdzić postawioną hipotezę badawczą. Badania prowadzono w następujących dniach

8 ciąży: (migracja embrionów w macicy), (matczyne rozpoznanie ciąży), (implantacja) i (zakończenie implantacji), oraz w dniu cyklu rujowego (okresie pełnej funkcjonalności ciałka żółtego). Bardzo dokładny opis metodyki prowadzonych badań zajmuje aż 6 stron. Stosowane metody to: inkubacje in vitro skrawków błony śluzowej i mięśniowej macicy, reakcja real-time PCR, metoda immunoenzymatyczna (ELISA), Western blotting oraz analiza statystyczna. Wydaje się, że w wielu miejscach wystarczyłoby odesłanie czytelnika do odpowiednich publikacji, w których zawarte są szczegółowe opisy poszczególnych metod. Natomiast zabrakło mi wyjaśnienia dlaczego zastosowano takie stężenia steroidów i prostaglandyn do inkubacji, i jak odnoszą się one do warunków fizjologicznych. Częściowo odpowiedź na to pytanie można znaleźć w dołączonych publikacjach, ale uważam, że informacja ta jest istotna i powinna znaleźć się również w opisie materiałów i metod dołączonego opracowania. Po przeczytaniu tej części nasuwa się kilka pytań. Bardzo prosiłabym Doktoranta o wyjaśnienie dlaczego w przypadku adiponektyny i receptora typu pierwszego adiponektyny stosowano różne stężenia starterów sensownego i antysensownego w reakcji real-time PCR (dla adiponektyny użyto 3-krotnie mniejszego stężenia startera antysensownego, a dla receptora 6-krotnie mniejszego stężenia)? W cytowanych publikacjach, o które oparta jest sekwencja starterów, autorzy stosowali takie samo stężenie dla obu starterów, sensownego i antysensownego. Z jakiego powodu wybrano do detekcji fluorescencji SyberGreen a nie specyficzne sondy TaqMan? Natomiast jeśli chodzi o izolację białka, w jakim buforze lizującym homogenizowano tkanki? Ponadto, w niektórych miejscach Doktorant pisze o hodowli, a w innych o inkubacji in vitro skrawków macicy, podczas gdy nie powinno się używać tych określeń naprzemiennie. W rozdziale Wyniki podsumowano w skondensowanej formie wyniki zawarte w trzech pracach stanowiących rozprawę doktorską. Przy tak dużej ilości wyników praca zyskałaby jeszcze bardziej na przejrzystości gdyby Doktorant zamieścił tabelę, w której zostałyby zebrane wyniki dotyczące zmiany ekspresji mrna i białka adiponektyny i jej receptorów pod wpływem steroidów i prostaglandyn w badanych, różnych okresach wczesnej ciąży i cyklu rujowego. Mam jeszcze uwagę dotyczącą stosowanego przez Doktoranta określenia endometrium i miometrium. Moim zdaniem w języku polskim powinno używać się określenia, odpowiednio, błona śluzowa i błona mięśniowa macicy.

9 Uzyskane przez Doktoranta wyniki wskazują dynamiczne zmiany i różnice w ekspresji mrna i białka dla systemu adiponektynowego pod wpływem badanych czynników. Analizując wyniki w wielu przypadkach uderza brak zgodności między poziomem mrna i białka. Wyjaśnienie znalazłam w dwóch publikacjach, jednak dobrze byłoby, gdyby podobny komentarz znalazł się w opracowaniu. Ogólnym niedociągnięciem opracowania jest właśnie brak komentarza podsumowującego wszystkie trzy publikacje, w którym Doktorant mógłby w pełni wykazać się dojrzałością naukową i umiejętnością kompleksowej interpretacji uzyskanych wyników. Wnioski zamykające polskojęzyczne opracowanie w jednoznaczny sposób pokazują na zrealizowanie postawionych celów pracy i stanowią istotny wkład w dotychczasową wiedzę na temat funkcjonowania systemu adiponektyny w układzie rozrodczym świni. Za najważniejsze osiągnięcie rozprawy doktorskiej Pana mgr. Kamila Dobrzynia uznaję wykazanie, że hormony steroidowe i prostaglandyny, w zależności od zastosowanego stężenia, wpływają na ekspresję genów i koncentrację białek adiponektyny i jej receptorów w macicy świń w okresie wczesnej ciąży, jednak zależne jest to od rodzaju badanej tkanki i okresu ciąży. Jak podsumowuje to sam Doktorant, wyniki te sugerują, że adiponektyna może być jednym z elementów kompleksowego systemu zaangażowanego w regulację procesów matczynego rozpoznania ciąży i implantacji. PODSUMOWANIE Po przeczytaniu pracy doktorskiej nie mam żadnych wątpliwości, że Doktorant uzyskał nowe, interesujące, pionierskie i kompleksowe wyniki, które przynoszą ciekawe informacje dotyczące wpływu hormonów steroidowych i prostaglandyn na system adiponektyny w macicy świni we wczesnym okresie ciąży. Wszystkie powyższe sformułowane przeze mnie uwagi, wynikające z obowiązku recenzenta, nie umniejszają wartości pracy. Wysoko oceniam wartość merytoryczną badań, ich wykonanie i interpretację. Oceniana rozprawa nie tylko dostarcza danych, które wzbogacają już istniejącą wiedzę o nowe informacje, ale również prezentowane wyniki stanowią podstawę do dalszych badań, zmierzających do pełniejszego poznania funkcji adiponektyny podczas wczesnej ciąży. Na tym etapie dochodzi do molekularnego dialogu między zarodkiem a matką prowadzącego do rozpoznania ciąży i implantacji. Badania mgr. Kamila Dobrzynia wskazują, że adiponektyna, obok mikrorna, cząsteczek adhezyjnych, czynników wzrostu i

10 steroidów, jest zaangażowana w te skomplikowane i nadal najmniej poznane procesy zachodzące na wczesnym etapie ciąży u świni. WNIOSEK KOŃCOWY Przedstawiona do oceny rozprawa doktorska mgr. Kamila Dobrzynia: Wpływ hormonów steroidowych i prostaglandyn na system adiponektynowy w macicy świni domowej (Sus scrofa domestica) podczas wczesnej ciąży spełnia warunki określone w artykule 13 Ustawy 1 z dnia 14 marca 2003 r. o stopniach naukowych i tytule naukowym oraz stopniach i tytule w zakresie sztuki (Dz. U. Nr 65, poz. 595; z późniejszymi zmianami) stawiane pracom doktorskim i w związku z powyższym zwracam się do Wysokiej Rady Wydziału Biologii i Biotechnologii Uniwersytetu Warmińsko-Mazurskiego w Olsztynie z wnioskiem o dopuszczenie mgr. Kamila Dobrzynia do dalszych etapów przewodu doktorskiego. Jednocześnie proponuję wyróżnienie recenzowanej przeze mnie rozprawy doktorskiej stosowna nagrodą. Kraków