Ćwiczenie 4 i 21 (skrypt) ćwiczenie laboratoryjne nr 3 dla e-rolnictwa Właściwości i budowa węglowodanów. Sacharydy są podstawową i bardzo zróżnicowaną grupą związków naturalnych występujących we wszystkich organizmach żywych. Szczególnie zróżnicowane pod względem budowy i funkcji są one u roślin. Najprostsze z nich to monosacharydy, które oprócz grupy karbonylowej zawierają grupy hydroksylowe i których sumaryczny wzór można przedstawić jako (CH 2 O) n. Najprostszymi monosacharydami są triozy: aldehyd glicerynowy (aldotrioza) i traktowany jako trioza dihydroksyaceton (Rys.1. oraz Rys. 2.). Rys. 1. Wzory aldehydu glicerynowego Rys. 2. Wzór dihydroksyacetonu. w konfiguracjach L i D. Wszystkie monosacharydy, z wyjątkiem dihydroksyacetonu, zawierają jeden lub kilka ośrodków asymetrii. W zależności od liczby asymetrycznych atomów węgla w cząsteczce danemu sumarycznemu wzorowi odpowiada pewna liczba stereoizomerów, którą określa wyrażenie 2 n (n liczba asymetrycznych atomów węgla). Wśród tych stereoizomerów wyróżnia się dwa szeregi D i L, których człony tworzą pary będące swymi lustrzanymi odbiciami. Litery D i L odnoszą się do konfiguracji podstawników przy asymetrycznych atomach węgla najdalej położonych od karbonylowego atomu węgla. Człony szeregu D mają zatem konfigurację przy najdalej położonym od grupy karbonylowej atomie węgla, taką jak aldehyd D- glicerynowy, natomiast człony szeregu L są ich lustrzanym odbiciem. Na rysunku 1 przedstawiono wzory aldehydu D- i L-glicerynowego. W związku z występowaniem ośrodków asymetrii sacharydy charakteryzują się różnym stopniem zdolności skręcania w prawo (+) lub w lewo ( ) płaszczyzny światła spolaryzowanego. Kierunek skręcania nie wiąże się jednak z przynależnością do szeregu D czy L, a zdolność skręcania oznacza się doświadczalnie. Monosacharydy, mające 5 lub więcej atomów węgla, mogą występować w formach pierścieniowych (półacetalowych), które obrazują wzory Hawortha. W wypadku utworzenia formy pierścieniowej ujawnia się w cząsteczce sacharydu dodatkowy ośrodek asymetrii i cząsteczka taka może występować w dwóch odmianach α i β (Rys. 3.). Rys. 3. Powstawanie cyklicznej formy glukozy i fruktozy - wzory Hawortha, odmiany α i β D-glukozy oraz D-fruktozy.
Monosacharydy składają się z pojedynczej jednostki polihydroksy-aldehydowej lub - ketonowej (np. arabinoza, ryboza, galaktoza, mannoza, glukoza, fruktoza Rys. 4.). Rys. 4. Wzory łańcuchowe D izomerów: arabinozy, rybozy, galaktozy, mannozy, glukozy i fruktozy. Oligosacharydy zawierają od dwu do dziesięciu jednostek monosacharydowych połączonych wiązaniem glikozydowym (np. laktoza, maltoza, sacharoza, celobioza, izomaltoza Rys. 5.). Rys. 5. Wzory laktozy, maltozy, sacharozy, celobiozy, izomaltozy. Polisacharydy zawierają bardzo długie łańcuchy zbudowane z jednostek monosacharydowych, przy czym mogą być one nierozgałęzione (np. celuloza Rys. 6., amyloza Rys. 7.) lub rozgałęzione (amylopektyna Rys. 7., glikogen). Rys. 6. Schemat budowy celulozy.
Rys. 7. Schemat budowy amylozy i amylopektyny składników skrobi. Do podstawowych funkcji sacharydów należą: udział w magazynowaniu i uruchamianiu energii, funkcje strukturalne, udział w utrzymywaniu właściwych stosunków wodnych w komórkach roślin i drobnoustrojów, integracja komórek w tkanki, utrzymywanie właściwego ciśnienia osmotycznego w cieczach ustrojowych zwierząt i komórkach roślinnych oraz udział w regulacji transportu przez błony komórkowe i cytoplazmatyczne, a także w reakcjach odpornościowych krwi. Ponadto wchodzą one w skład kwasów nukleinowych, koenzymów oraz licznych glikozydów. Najlepiej poznanymi przemianami sacharydów jest ich biosynteza w procesie fotosyntezy prowadzącym do zmagazynowania energii chemicznej w postaci sacharydów złożonych oraz ich rozkład do CO 2 i H 2 O w procesie utleniania biologicznego, w celu uruchomienia energii potrzebnej w licznych reakcjach anabolicznych. 1. Reakcje charakterystyczne sacharydów Cel ćwiczenia Ćwiczenie poświęcone jest przypomnieniu wiadomości z chemii dotyczących budowy i właściwości sacharydów. Stosowane w doświadczeniach sacharydy (aldoheksoza glukoza; ketoheksoza fruktoza; aldopentoza arabinoza; disacharyd nieredukujący sacharoza i disacharyd redukujący maltoza) oraz przewidziane w ćwiczeniu reakcje są tak dobrane, aby na podstawie ich wyników możliwe było zaklasyfikowanie nieznacznego sacharydu do określonej grupy strukturalnej. Wprowadzenie Właściwością sacharydów bardzo często wykorzystywaną w oznaczeniach jest ich zdolność do redukowania innych związków. Właściwość ta związana jest z występowaniem cząsteczki sacharydów w formie łańcuchowej zawierającej reaktywną grupę aldehydową lub ketonową. Wszystkie monosacharydy mają więc właściwości redukujące. Właściwości redukujących nie mają te disacharydy, których wiązanie glikozydowe utworzone jest z udziałem obydwu węgli acetalowych, ponieważ w takiej cząsteczce nie może nastąpić w roztworze otwarcie pierścienia piranozowego lub furanozowego z odtworzeniem grup: aldehydowej bądź ketonowej. W reakcji Benedicta w środowisku zasadowym (sprzyjającym przesunięciu równowagi między formą pierścieniową i łańcuchową sacharydu w kierunku reaktywnej formy łańcuchowej) następuje utlenienie sacharydów redukujących do odpowiednich hydroksykwasów, a obecne w odczynniku Benedicta jony Cu 2+ redukują się do jonów Cu + wypadających z roztworu w postaci nierozpuszczalnego tlenku miedziawego (Cu 2 O).
W reakcji Barfoeda redukcja jonów miedziowych przeprowadzana jest w środowisku słabo kwaśnym, co powoduje znaczne obniżenie reaktywności sacharydów. W przewidzianych doświadczeniem warunkach reakcji (ph, czas trwania) tylko w roztworze monosacharydu pojawi się czerwony osad tlenku miedziawego. Pod wpływem wyższych stężeń jonów wodorowych oraz wysokiej temperatury disacharydy ulegają łatwo hydrolizie. Oznaczane właściwości redukcyjne roztworu po hydrolizie wynikają więc z obecności w nim produktów hydrolizy monosacharydów. Kwasy mineralne w wyższych stężeniach powodują również odwodnienie cząsteczek sacharydów z utworzeniem odpowiednich w stosunku do ich budowy furfurali (aldehydowe pochodne furanu Rys. 8). Produkty odwodnienia kondensując z fenolami dają połączenia o różnych zabarwieniach. Właściwości te wykorzystano w reakcjach Molischa, Biala i Seliwanowa. W reakcji Molischa wszystkie sacharydy po odwodnieniu kwasem siarkowym dają z α-naftolem fioletowo zabarwiony produkt kondensacji. W reakcji Biala tylko pentozy przekształcają się w furfural kondensujący z orcynolem, w wyniku czego powstaje produkt o barwie zielonej. Odczynnik Seliwanowa zawiera natomiast rezorcynol, który z produktem odwodnienia heksoketoz hydroksymetylofurfuralem daje barwę łososiową. Rys. 8. Wzory: orcynolu, rezorcynolu, α-naftolu, furfuralu, hydroksymetylofurfuralu. Odczynniki 1. 1-proc. roztwór L-arabinozy. 2. 1-proc. roztwór D-glukozy. 3. 1-proc. roztwór D-fruktozy. 4. 1-proc. roztwór maltozy. 5. 1-proc. roztwór sacharozy. 6. Stężony kwas solny. 7. Stężony kwas siarkowy. 8. 5-proc. alkoholowy roztwór α-naftolu. 9. 1-proc. roztwór difenyloaminy. 10. Odczynnik Benedicta: 173 g cytrynianu sodowego i 100 g węglanu sodowego rozpuścić w 800 ml ciepłej wody (jeżeli roztwór nie jest klarowny przesączyć) i uzupełnić wodą do 850 ml. 17,3 g siarczanu miedziowego rozpuścić w 100 ml wody i dodać mieszając do uprzednio przygotowanego roztworu. Otrzymany roztwór uzupełnić wodą do 1000 ml.
11. Odczynnik Barfoeda: 24 g octanu miedziowego rozpuścić w 450 ml wrzącej wody, dodać 25 ml 8,5-proc. roztworu kwasu mlekowego i po ostudzeniu uzupełnić wodą do objętości 500 ml. Przed użyciem przesączyć. 12. Odczynnik Biala: 1 g orcyny rozpuścić w 500 ml kwasu solnego rozcieńczonego wodą w stosunku 1:1 i następnie dodać 20 kropli 10-proc. roztworu chlorku żelazowego. 13. Odczynnik Seliwanowa: 500 mg rezorcynolu rozpuścić w 1000 ml kwasu solnego rozcieńczonego wodą w stosunku 1:2. Wykonanie 1. Reakcja Molischa. Jest ona charakterystyczna dla wszystkich sacharydów. Odmierzyć do dwóch probówek po 0,5 ml dowolnych roztworów sacharydów. Do obydwu probówek dodać po 2 lub 3 krople α-naftolu (8), wymieszać i następnie po ściance pochylonej probówki wprowadzić powoli 1,5 ml stężonego kwasu siarkowego (7) tak, aby spłynął on na dno probówki. Nie mieszać! 2. Reakcja Seliwanowa charakterystyczna dla ketoz. Odmierzyć do jednej probówki 0,5 ml fruktozy (3), do drugiej 0,5 ml glukozy (2), dodać po 1 ml odczynnika Seliwanowa (13) i ogrzewać przez 1 minutę we wrzącej łaźni wodnej. 3. Reakcja Biala charakterystyczna dla pentoz. Do dwóch probówek odmierzyć po 2,5 ml odczynnika Biala (12) i ogrzewać przez 5 minut we wrzącej łaźni wodnej. Następnie do jednej probówki dodać 0,5 ml arabinozy (1), do drugiej 0,5 ml glukozy (2), wymieszać i ogrzewać przez kolejne 5 minut. 4. Reakcja Benedicta charakterystyczna dla sacharydów redukujących. Odmierzyć do trzech probówek po 0,5 ml: do pierwszej glukozy (2), do drugiej maltozy (4) i do trzeciej sacharozy (5). Do każdej probówki dodać 1 ml odczynnika Benedicta (10) i ogrzewać przez kilka minut we wrzącej łaźni wodnej. Do czwartej probówki odmierzyć 0,5 ml sacharozy, dodać 2 lub 3 krople stężonego kwasu solnego (6), wymieszać i ogrzewać przez około 2 minuty we wrzącej łaźni wodnej. Ostudzić zawartość probówki, dodać 1 ml odczynnika Benedicta i wstawić na kilka minut do wrzącej łaźni wodnej. 5. Reakcja Barfoeda charakterystyczna dla monosacharydów redukujących. Odmierzyć do jednej probówki 0,5 ml glukozy (2), a do drugiej 0,5 ml maltozy (4). Dodać po 1 ml odczynnika Barfoeda (11), wymieszać i ogrzewać przez 3 min we wrzącej łaźni wodnej. 6. Określenie charakteru otrzymanego sacharydu. Po wykonaniu reakcji od 1-5 pobrać z pokoju laboranta roztwór nieznanego sacharydu (próbę do zbadania), przeprowadzić odpowiednie reakcje charakterystyczne pozwalające na stwierdzenie, który z badanych poprzednio rodzajów sacharydu znajdował się w tym roztworze. Do każdej rekcji pobierać po 0,5 ml analizowanego roztworu sacharydu. Opracowanie wyników W sprawozdaniu należy podać wnioski wypływające z wykonanych reakcji charakterystycznych oraz ich zasadę. Które z tych reakcji były konieczne dla jednoznacznego określenia sacharydu w nieznanym roztworze, jaki to był sacharyd?
2. Oznaczanie aktywności enzymów amylolitycznych. Cel ćwiczenia Ćwiczenie poświęcone jest na zapoznanie się z metodą Bernfelda oznaczania aktywności enzymów amylolitycznych, na podstawie pomiaru przyrostu redukcyjności mieszaniny reakcyjnej. Wprowadzenie Amylazy. α-amylaza i β-amylaza należą do klasy hydrolaz i są jednymi z najwcześniej poznanych enzymów. Rozkładają one skrobię, glikogen oraz pokrewne im oligo- i polisacharydy. W katabolizmie skrobi w układzie pokarmowym ludzi i zwierząt oraz w roślinach obok α- i β-amylaz bierze udział wiele innych enzymów. Amylazy są typowymi enzymami katabolicznymi występującymi powszechnie w organizmach zwierzęcych, w roślinach i drobnoustrojach. Szczególnie duże ilości α- i β- amylazy znajdują się w skiełkowanych ziarniakach zbóż (słód pszenny lub jęczmienny). W procesie kiełkowania α-amylaza jest syntetyzowana de novo, natomiast β amylaza z formy nieaktywnej pod wpływem enzymów proteolitycznych przechodzi w formę aktywną. α-amylaza katalizuje rozrywanie wyłącznie wiązań α-1,4-glikozydowych wewnątrz cząsteczki substratu (endoamylaza), a produktami jej działania są początkowo dekstryny wysokocząsteczkowe, przechodzące w miarę przebiegu reakcji w dekstryny o coraz krótszym łańcuchu. Produktami długotrwałej hydrolizy polisacharydów skrobi, glikogenu i amylopektyny z udziałem α-amylaz są głównie: maltotrioza, izomaltoza, maltoza i glukoza. Uwalniane reszty glukozylowe mają konfigurację α i stąd pochodzi symbol α przy nazwie enzymu. W wyniku działania α-amylazy następuje szybki spadek lepkości substratu, zmiana zabarwienia kompleksu z jodem i powolny przyrost redukcyjności w mieszaninie reakcyjnej. α-amylazy różnego pochodzenia wykazują optimum aktywności w zakresie ph 4,5 7,0, chociaż znane są enzymy pochodzenia bakteryjnego, dla których wartość ta wynosi 10,0 10,5; w przypadku α-amylazy słodowej optimum ph wynosi ona 5,3. Optymalna temperatura działania α-amylaz mieści się w granicach 40 50 C, a tylko dla niektórych enzymów bakteryjnych (Bacillus licheniformis) wynosi 90 100 C. β-amylaza działa na substrat (skrobię, amylozę, amylopektynę, glikogen) od strony nieredukującego końca łańcucha i dlatego nazywana jest egzoamylazą. Hydrolizuje co drugie wiązanie α-1,4-glikozydowe, odrywając jednostki β-maltozy. Podczas hydrolizy występuje przegrupowanie Waldena i dlatego uwalniana maltoza jest w formie β. β-amylaza nie działa na wiązanie α-1,6-glikozydowe i nie jest w stanie go ominąć jak α-amylaza, działanie jej zatrzymuje się więc po dojściu do tego wiązania. W wyniku działania β-amylazy na substraty rozgałęzione (zawierające wiązanie α-1,6-glikozydowe) produktami są β-maltoza i wysokocząsteczkowa dekstryna graniczna. W mieszaninie reakcyjnej β-amylazy ze skrobią obserwuje się szybki przyrost redukcyjności, natomiast nie występuje spadek lepkości i zmiany zabarwienia z jodem, gdyż jednym z produktów jest wyżej wspomniana wysokocząsteczkowa dekstryna graniczna. β-amylaz w przeciwieństwie do α-amylazy praktycznie nie występuje w układzie pokarmowym człowieka jako enzym trawienny. β- amylazy pochodzenia roślinnego wykazują optymalną aktywność w zakresie ph 4,0 5,5, natomiast β-amylazy bakteryjne działają optymalnie przy wartości ph 6,0 7,0. Zakres temperatury optymalnego ich działania znajduje się w granicach 40 55 C. Glukoamylaza jest wytwarzana głównie przez drobnoustroje, występuje także w tkankach zwierzęcych i w niewielkich ilościach w nasionach roślin. Enzym ten katalizuje hydrolizę wiązań α-1,4- i α-1,6-glikozydowych oraz nielicznie występujących w skrobi wiązań α-1,3-glikozydowych, odrywając kolejno jednostki glukozy od nieredukującego końca
cząsteczek wielocukru. Ze względu na sposób działania glukoamylaza określana jest, podobnie jak β-amylaza, jako egzoamylaza. Podczas hydrolizy zarówno w wiązaniu α-1,4-, jak i α-1,6-zachodzi przegrupowanie Waldena, wskutek czego glukoza jest uwalniana w formie β-. W początkowej fazie działania glukoamylazy na skrobię obserwuje się szybki przyrost redukcyjności oraz powolną zmianę barwy z jodem, a także powolny spadek lepkości w mieszaninie reakcyjnej. Końcowym produktem działania glukoamylazy na skrobię, glikogen, amylozę i amylopektynę oraz ich pochodne jest glukoza. Mechanizm i sposób działania amylaz. Amylazy działając na substrat niezależnie od długości jego łańcucha i stopnia rozgałęzienia rozrywają wiązanie glikozydowe pomiędzy węglem glikozydowym a tlenem wiązania glikozydowego (Rys. 9.). Rys. 9. Schemat działania α-amylazy oraz β-amylazy na amylopektynę. Poszczególne enzymy amylolityczne mają określone wymagania co do położenia wiązania podatnego na hydrolizę oraz określoną kolejność rozrywania wiązań. Sposób działania amylaz uwarunkowany jest budową ich centrum aktywnego i substratu, a także zależy od ph, temperatury i obecności inhibitorów i aktywatorów. W budowie centrum aktywnego amylaz wyróżnia się region katalityczny i region wiążący substrat. Pierwszy z nich bierze bezpośredni udział w rozrywaniu wiązania glikozydowego. Natomiast region wiążący jest to odcinek łańcucha polipetydowego białka, który musi połączyć się z określoną liczbą reszt glukozy w łańcuchu substratu, aby centrum katalityczne mogło spełnić swoją funkcję, tzn. aby nastąpiło rozerwanie wiązania. Metody oznaczania aktywności enzymów amylolitycznych. Oznaczanie aktywności enzymów amylolitycznych można przeprowadzić na podstawie pomiaru: 1) przyrostu redukcyjności w mieszaninie reakcyjnej, 2) zmian zabarwienia skrobi z jodem, 3) spadku lepkości użytego do reakcji substratu, 4) zmian natężenia fluorescencji w mieszaninie reakcyjnej przy zastosowaniu amylozy jako substratu. Do oznaczania aktywności α-amylazy najczęściej stosuje się pomiar zmian zabarwienia skrobi z jodem po określonym czasie inkubacji z enzymem. Aktywność β- amylazy oznacza się stosując pomiar przyrostu redukcyjności. Ze względu na niską specyficzność substratową enzymów amylolitycznych w mieszaninie występuje ich współdziałanie i efekt końcowy jest wypadkową działania poszczególnych enzymów.
Oznaczanie aktywności amylaz metodą Bernfelda Zasada metody. W metodzie Bernfelda wykorzystuje się właściwości redukujące maltozy i innych cukrów, które w środowisku zasadowym redukują grupę nitrową soli sodowej kwasu 3,5-dinitrosalicylowego (DNS) w pozycji 3 do grupy aminowej (Rys. 10.). Powstałe pochodne aminowe mają barwę pomarańczową, silnie absorbują świtało przy długości fali 540 nm. Intensywność powstałej barwy zależy od ilości w próbie cukrów redukujących (głównie β-maltozy) uwalnianych podczas działania enzymów, dlatego reakcja ta może stanowić podstawę do ich oznaczenia fotometrycznego. DNS Rys. 10. Wzór kwasu 3,5-dinitrosalicylowego (DNS) oraz kwasu 3-amino-5- nitrosalicylowego. Odczynniki 1. 2-proc. roztwór skrobi rozpuszczalnej w buforze octanowym o ph 5,3 oraz 1- molowego buforu octanowego o ph 5,3. 2. 1-proc. roztwór soli sodowej kwasu 3,5-dinitrosalicylowego (DNS): 10 g DNS rozpuścić w 200 ml 2-molowego wodorotlenku sodowego, następnie dodać 500 ml wody i 300 g winianu sodowopotasowego, a po rozpuszczeniu uzupełnić wodą do 1000 ml (w przypadku powstania osadu roztwór przesączyć przez sączek z bibuły). Wykonanie Otrzymany w kolbie miarowej na 25 ml wyciąg słodowego uzupełnić wodą i wymieszać. W razie konieczności przelać do czystej próbówki, w celu pobrania pipeta automatyczną do oznaczeń. Do 3 enzymatycznie czystych probówek pobrać po 0,5 ml roztworu skrobi (1) i wstawić na 5 min do łaźni wodnej o temp. 30 C. Po 5 minutach do 2 probówek dodać po 0,5 ml wyciągu enzymu z kolby na 25 ml (próby właściwe - P) i przeprowadzić reakcję hydrolizy skrobi w ciągu 15 min w temp. 30 C. Następnie do wszystkich 3 probówek dodać po 1 ml soli sodowej kwasu 3,5-dinitrosalicylowego (5), a do trzeciej probówki zawierającej substrat i 1 ml DNS dodać 0,5 ml enzymu (próba materiałowa - M). Po dokładnym wymieszaniu wszystkie 3 probówki wstawić do wrzącej łaźni wodnej, ogrzewać 10 minut, a następnie schłodzić, dodać 10 ml wody destylowanej. Odczytu wartości absorbancji dokonać w fotometrze przy długości fali 540 nm, zerując fotometr względem próby materiałowej. Opracowanie wyników Na podstawie uzyskanej absorbancji odczytać z krzywej wzorcowej odpowiednią wartość maltozy w µg i podać ją prowadzącemu ćwiczenia. Krzywą wzorcową dla maltozy z sola sodową kwasu 3,5-dinitrosalicylowego przygotowuje się stosując roztwór maltozy o stężeniach od 0,2 do 2,0 mg w próbie. Uwzględniając rozcieńczenia obliczyć aktywność amylazy słodowej i wyrazić ją w µmolach uwolnionej maltozy na 1 g słodu i na 1 min.
Pytania 1. Napisać wzory D- oraz α- i β-glukozy, D-fruktozy i D-arabinozy; wyjaśnić różnice. 2. Napisać wzory sacharozy i maltozy. Jakie wiązania występują w tych disacharydach? 3. Które z wykonywanych na ćwiczeniu reakcji są wspólne dla roztworów: glukozy, fruktozy i arabinozy, a które pozwolą na ich odróżnienie. Na jakiej zasadzie oparte jest to rozróżnienie? 4. Która z wykonywanych na ćwiczeniu reakcji pozwoli na odróżnienie roztworów sacharozy i maltozy? Na czym polega ta reakcja? 5. Wyjaśnić, dlaczego w reakcji z odczynnikiem Seliwanowa uzyskuje się łososiowe zabarwienie próby nie tylko w roztworze fruktozy, ale również w roztworze sacharozy? 6. Do jakiej klasy enzymatycznej należą amylazy? Jakie reakcje katalizują? 7. Narysować fragment łańcucha amylopektyny i wskazać na nim miejsca działania poszczególnych amylaz. 8. Na czym polega różnica w sposobie działania na skrobię pomiędzy α- i β-amylazą? Które enzymy określa się jako endoamylazy, a które jako egzoamylazy i dlaczego? 9. Na czym polegają metody oznaczania aktywności β-amylazy? 10. Jakie końcowe produkty powstają po działaniu poszczególnych amylaz na amylozę, a jakie na amylopektynę? 11. Wymienić typy organizmów, w których występują α-, β- i glukoamylazy. Jakie funkcje pełnią w nich te enzymy? 12. Uzasadnić celowość wykonywania prób kontrolnych w metodzie Bernfelda. Czy odczyty absorbancji będą w nich większe czy mniejsze niż w próbach właściwych (z działającymi enzymami amylolitycznymi) odpowiedź uzasadnij. 13. Napisz wzory i podaj nazwy produktów odwodorowania pentoz i heksoketoz. Jak można te produkty wykorzystać w analizie jakościowej monosacharydów? 14. Podaj nazwę i napisz wzór produktu reakcji cukrów redukujących z DNS (kwasem,5- dinitrosalicylowym). W jakiej metodzie wykorzystywany jest ten substrat? Aktywności których amylaz (egzo-, czy endoamylaz) częściej oznaczane są z wykorzystaniem DNS, odpowiedź uzasadnij.