RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP 1912513 Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: 25.07.2006 06794209.4 (97) O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono: 11.09.2013 Europejski Biuletyn Patentowy 2013/37 EP 1912513 B1 (13) (51) T3 Int.Cl. A23C 9/146 (2006.01) A61K 38/40 (2006.01) A61K 38/18 (2006.01) A61K 38/30 (2006.01) A61K 39/395 (2006.01) A61K 35/20 (2006.01) A61P 29/00 (2006.01) (54) Tytuł wynalazku: Nowe frakcje białek mleka i ich zastosowanie do zapobiegania lub leczenia przewlekłych chorób zapalnych (30) Pierwszeństwo: 29.07.2005 FR 0508177 (43) Zgłoszenie ogłoszono: 23.04.2008 w Europejskim Biuletynie Patentowym nr 2008/17 (45) O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono: 31.03.2014 Wiadomości Urzędu Patentowego 2014/03 (73) Uprawniony z patentu: COMPAGNIE LAITIERE EUROPEENNE, Condé-sur-Vire, FR (72) Twórca(y) wynalazku: PL/EP 1912513 T3 TAKASHI MIKOGAMI, Fougeres, FR JÉRÔME SOUPPE, Rennes, FR PIERRE JOUAN, Cesson Sevigne, FR MICHEL BOURTOURAULT, Noyal Chatillon Sur Seiche, FR (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Renata Piekarz AOMB POLSKA SP. Z O.O. ul. Emilii Plater 53 28 piętro 00-113 Warszawa Uwaga: W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejskiego Urzędu Patentowego sprzeciw dotyczący udzielonego patentu europejskiego. Sprzeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą wniesienia opłaty za sprzeciw (Art. 99 (1) Konwencji o udzielaniu patentów europejskich).
Opis [0001] Niniejszy wynalazek dotyczy nowych frakcji białek mleka wzbogaconych w TGF-β, sposobu ich otrzymywania i ich zastosowania do otrzymywania leku i/lub kompozycji żywnościowej, przeznaczonych do zapobiegania i/lub leczenia przewlekłych chorób zapalnych, w szczególności łuszczycy. [0002] Łuszczyca jest przewlekłym stanem dermatologicznym, charakteryzującym się powstawaniem rozległych zmian rumieniowo-złuszczających, występujących głównie na poziomie łokci, kolan i owłosionej skóry głowy. [0003] Z biologicznego punktu widzenia łuszczyca to przewlekły proces zapalny, charakteryzujący się nieprawidłową proliferacją i różnicowaniem keratynocytów powiązanych z infiltracją skóry i naskórka przez limfocyty T i wielojądrowe neutrofile, które tworzą mikroropnie w warstwie rogowej naskórka. [0004] Niewiele wiadomo o przyczynach występowania łuszczycy u danego osobnika. Przytacza się kilka czynników sprzyjających pojawieniu się łuszczycy: - czynnik genetyczny, - czynnik psychologiczny (stres, zmiany hormonalne,...), - nieprawidłowość immunologiczna. [0005] Wreszcie, podejrzewa się niektóre leki i infekcje bakteryjne lub wirusowe o wywoływanie napadów łuszczycowych. [0006] Obecnie żadne leczenie nie jest w stanie wyleczyć łuszczycy. Znane jak dotąd terapie mogą jedynie powstrzymać i/lub złagodzić jej objawy. [0007] Na łuszczycę ograniczoną do kilku płytek przepisuje się witaminę D, opcjonalnie w połączeniu z kortykosteroidami do stosowania miejscowego. Można również przepisywać retinoidy do stosowania miejscowego. [0008] W najcięższych przypadkach przepisuje się fototerapię, lub opcjonalnie metotreksat czy też retinoidy do leczenia systemowego. Te ostatnie terapie są powiązane z licznymi skutkami niepożądanymi. [0009] Nie ma zatem obecnie zadowalającego sposobu leczenia łuszczycy. 2
[0010] Inne przewlekłe choroby zapalne, jak reumatoidalne zapalenie stawów, zapalenie kości i stawów, choroba Crohna, stwardnienie rozsiane, toczeń rumieniowaty, stanowią dla lekarza taki sam problem: nie istnieje leczenie pozwalające na pokonanie tych schorzeń, zaś istniejące terapie pozwalające leczyć objawy tych schorzeń są albo niewystarczające, albo związane z bardzo poważnymi skutkami niepożądanymi. Przewlekły czynnik zapalny występuje również w przypadku chorób autoimmunologicznych. [0011] Wiadomo, że czynniki wzrostu, w taki sam sposób jak chemokiny i cytokiny, wpływają na procesy zapalne. Wpływ ten waha się od wzmocnienia do hamowania procesów zapalnych. [0012] Wiadomo w szczególności, że niektóre czynniki wzrostu z mleka mają aktywność modulatorów procesów zapalnych. [0013] Na przykład, publikacja WO 96/34614 opisuje zastosowanie produktu mlecznego do otrzymywania leku do zapobiegania uszkodzeniom śluzówki przewodu pokarmowego, wywoływanym przez chemioterapię lub radioterapię. [0014] Wyciąg jest korzystnie otrzymywany poprzez przepuszczenie mleka przez kolumnę do chromatografii kationowymiennej. Zawiera on korzystnie laktoferynę i/lub laktoperoksydazę oraz czynnik wzrostu, szczególnie TGF-β. [0015] TGF-β (transformujący czynnik wzrostu) oznacza peptydowy czynnik wzrostu, który reguluje wzrost i różnicowanie komórek. Dotyczy to cząsteczki dimerycznej o masie 25 kd, która może występować w różnych izoformach: TGFß 1, TGFß 2 i TGFß 3. TGF-β jest znany ze swojej zdolności do regulowania, a szczególnie do redukowania niektórych etapów odpowiedzi immunologicznej i zapalnej (G. Prud'homme et al., J. Autoimmun. (2000), 14, 23-42; M. Shull et al., Nature (1992), 359, 693-699; J.Graycar et al., Mol. Endocrinol. (1989), 3, 1977-1986; J.Letterio et al., Annu. Rev. Immunol. (1998), 16, 137-161). Jest on obecny w formie utajonej (nie jest biologicznie aktywny) lub formie aktywnej. [0016] Jest obecny w mleku w bardzo małej ilości (30 µg/l mleka). Jednakże, w mleku są obecne inne liczne czynniki mające inną aktywność niż ta, którą posiada TGF-β, opcjonalnie przeciwną do niej, i konsekwencją jest to, że TGF-β zawarty w mleku nie ma istotnego wpływu na procesy zapalne. [0017] Ponadto, izolacja TGF-ß z mleka jest niepraktyczna w skali przemysłowej, po 3
pierwsze ze względu na koszty, jak również dlatego, że procesy izolacji powodują często denaturację przedmiotowych białek i prowadzą w związku z tym do otrzymania frakcji białek mleka, które utraciły wszystkie właściwości biologiczne zawartych w nich białek. [0018] W dokumencie EP 0 313 515 opisano sposób izolacji TGF-β z mleka. Jednakże, sposób ten obejmuje bardzo liczne etapy, o złożonej naturze, i stąd w małym stopniu jest to opłacalne z ekonomicznego punktu widzenia. [0019] W celu otrzymania frakcji białek mleka, która wykazuje aktywność biologiczną względem procesów zapalnych, tj. obniżenie lub hamowanie procesów zapalnych, powinna istnieć możliwość zwiększenia w mleku zawartości TGF-β w stosunku do innych białek, z równoczesnym usunięciem co najmniej niektórych czynników antagonistycznych wobec TGF-β, które blokują jego właściwości przeciwzapalne gdy jest obecny w mleku. Trudność w tym podejściu jest tym większa, gdyż nie jest jasne, czym dokładnie są antagoniści TGF-β. [0020] Kilku autorów zajęło się problemem izolacji frakcji białek mleka wzbogaconych w TGF-β. Dotyczy to zgłoszeń patentowych i opisów patentowych WO 96/34614, EP 0 545 946, WO 01/25276, WO 03/008447, FR 2 827 240, EP 0869 134. [0021] W dokumencie EP-0 545 946 opisano sposób ekstrakcji czynników wzrostu z serwatki; przy czym ten sposób obejmuje etapy: filtracji serwatki dla usunięcia substancji nierozpuszczalnych, regulacji ph w zakresie 6,5 do 8, zastosowania żywicy kationowymiennej typu sefaroza, na której są adsorbowane główne składniki o charakterze zasadowym, a główne białka kwasowe są eluowane, równoważenia żywicy buforem, nanoszenia filtratu na żywicę, elucji buforem o podwyższonej sile jonowej, filtracji dla usunięcia soli, zatężania. [0022] W dokumencie EP 0 869 134 opisano sposób odzyskiwania jednego lub większej liczby czynników wzrostu z mleka lub pochodnych mleka, przez adsorpcję na żywicy kationowymiennej, elucję frakcji, otrzymywanie frakcji wzbogaconej w czynniki wzrostu, a następnie obróbkę w ph od 3,5 do 4,5. Sposób korzystnie stosuje się z podwyższoną prędkością powierzchniową i przy podwyższonym obciążeniu cieczą. [0023] W dokumencie WO 01/25276 opisano sposób ekstrakcji TGF-β i IGF-1 obejmujący następujące etapy: odzyskiwanie frakcji zasadowej mleka poprzez chromatografię kationowymienną, przepuszczanie odzyskanych frakcji przez kolumnę z 4
hydroksyapatytem, elucję co najmniej dwoma eluentami o wzrastających stężeniach soli, w sposób prowadzący do otrzymania dwóch frakcji: - frakcji wzbogaconej w IGF-1 z IGF-1/TGF-β > 10 - frakcji wzbogaconej w TUF-β z TGF-β/IGF-1 > 5, i która zawiera 30 do 50% immunoglobulin w stosunku do całkowitej ilości białka. [0024] W dokumencie FR 2 827 240 opisano sposób otrzymywania frakcji białek wzbogaconej w TGF-β w postaci aktywnej, z roztworu bogatego w rozpuszczalne białka fazy wodnej mleka, poprzez: a) regulację stężenia białek rozpuszczalnych w zakresie 5-30 g/l, b) strącanie przez traktowanie kwasem, c) mikrofiltrację-diafiltrację, d) odzyskiwanie retentatu z mikrofiltracji, e) suszenie. [0025] W dokumencie WO 03/008447 opisano sposób do izolacji czynników wzrostu TGF-ß, IGF-1, laktoperoksydazy i immunoglobulin. Frakcję białek zasadowych mleka odzyskuje się za pomocą chromatografii kationowymiennej. Otrzymaną frakcję poddaje się chromatografii oddziaływań hydrofobowych. [0026] Jednakże, żaden z tych sposobów nie pozwala na otrzymanie, w warunkach nadających się do zastosowań przemysłowych, frakcji białek mleka mających faktyczny wpływ na przewlekłe choroby zapalne i na ich symptomy lub objawy, a w szczególności na łuszczycę. [0027] Zatem, zgłaszający w sposób zaskakujący stwierdził występowanie nowych frakcji białek mleka wykazujących wpływ na przewlekłe procesy zapalne, a szczególnie na łuszczycę. [0028] Frakcje białek mleka według wynalazku można otrzymywać za pomocą sposobu obejmującego następujące etapy: [0029] Stosuje się mleko lub serwatkę jako produkt wyjściowy. (a) mleko lub serwatkę opcjonalnie podda je się mikrofiltracji lub obróbce termicznej; (b) mleko lub serwatkę, albo produkt uzyskany w etapie (a) nanosi się na żywicę kationowymienną złożoną z syntetycznego polimeru nanoporowatego, funkcjonalizowanego grupami funkcyjnymi typu zasada sprzęgana z anionem silnego kwasu; prędkość liniowa wynosi od 2,8 do 4,5 m/godz., a objętość mleka lub serwatki w stosunku do objętości żywicy wynosi od 100 do 200; 5
(c) żywicę kationowymienną przemywa się wodą demineralizowaną; (d) żywicę się wymywa za pomocą roztworów solanki o wzrastających stężeniach; (e) odzyskuje się eluat odpowiadający roztworowi solanki o przewodności wynoszącej od 21,0 do 22,0 ms/cm. [0030] Sposób według wynalazku może jeszcze dodatkowo obejmować jeden lub większą liczbę następujących etapów: (f) eluat otrzymany w etapie (e) zatęża się za pomocą ultrafiltracji i odzyskuje się retentat; (g) retentat otrzymany w etapie (f) wyjaławia się za pomocą mikrofiltracji i odzyskuje się permeat; (h) permeat otrzymany w etapie (g) suszy się za pomocą suszenia rozpryskowego. [0031] Jako produkt wyjściowy w sposobie według wynalazku można stosować mleko tudzież serwatkę, korzystnie pochodzenia krowiego. Serwatka to pozostałość ciekła, otrzymywana po ekstrakcji białek i tłuszczy mleka lub serwatki. Na ogół wyróżnia się trzy kategorie serwatki. Dwie pierwsze kategorie oznaczają klasy według kwasowości serwatki, która może być niższa lub wyższa od 1,8 g kwasu mlekowego/l: serwatka słodka, z produkcji serów prasowanych gotowanych lub niegotowanych (ementaler, saint-paulin itp.) i serwatka kwaśna, z kazeiny lub innych serów otrzymanych na drodze koagulacji mieszanej lub mlekowej (sery miękkie, sery świeże). Średni skład serwatki miękkiej ma charakter orientacyjny, na 61 g suchej masy na kg serwatki, od 42 do 48 g laktozy, 8 g białka, 2 g tłuszczu, 5 do 7 g składników mineralnych, 1 do 5 g kwasu mlekowego, a pozostałą część stanowią minerały i witaminy. [0032] Znana jest również serwatka idealna, otrzymywana za pomocą mikrofiltracji mleka na nośniku o średniej porowatości 0,1 µm. [0033] Według pierwszego przykładu wykonania wynalazku, jako produkt wyjściowy stosuje się mleko, korzystnie mleko krowie, którego skład pozwala, z udziałem sposobu według wynalazku, na otrzymanie izolatu białek mających najbardziej interesujące właściwości biologiczne. Wariant ten umożliwia również otrzymywanie wydajności, w odniesieniu do białek, która jest wyższa niż w przykładach wykonania wykorzystujących serwatkę jako produkt wyjściowy. 6
[0034] Według drugiego przykładu wykonania wynalazku, jako produkt wyjściowy stosuje się kwaśną serwatkę z kazeiny. Ten przykład wykonania stanowi korzyść ekonomiczną o tyle, o ile produkt wyjściowy oznacza produkt uboczny pochodzący z eksploatacji przemysłowej i stąd ma niski koszt. [0035] Mleko stosowane jako produkt wyjściowy może oznaczać mleko krowie, kozie, owcze, bawole. Może ono być odtłuszczane, w znany sposób, przez odwirowanie. [0036] Mleko lub serwatka są poddawane traktowaniu, które umożliwia usunięcie wszelkich zanieczyszczeń pochodzenia mikrobiologicznego. W tym celu, mleko jest korzystnie poddawane obróbce termicznej, w temperaturze nieprzekraczającej 68 C, lub pierwszemu etapowi mikrofiltracji, na przykład na filtrze o porowatości około 1,4 µm. [0037] Następnie, permeat po mikrofiltracji, lub bezpośrednio mleko lub serwatka, są nanoszone na kolumnę z żywicą. [0038] Żywica stosowana w opisanym powyżej sposobie składa się z syntetycznego, nanoporowatego, polianionowego polimeru. Polimer jest korzystnie trójwymiarowy, kulisty lub sferoidalny. Jest on nośnikiem grup funkcyjnych typu silny kwas, pod postacią zasady sprzęganej z anionem tego silnego kwasu. Jest on korzystnie funkcjonalizowany grupami SO - 3. Dodatkowo polimer, z którego złożona jest żywica musi mieć właściwości wytrzymałości mechanicznej, które umożliwią mu wytrzymanie naprężeń hydraulicznych wynikających z korzystnych parametrów elucji. [0039] Na etapie (b) natężenie przepływu kolumny wynosi od 10 do 15 m 3 /godz., a prędkość liniowa wynosi od 2,8 do 4,5 m/godz. [0040] Na etapie (b), stosunek objętość mleka do objętości żywicy wynosi od 100 do 200. [0041] Po naniesieniu mleka lub serwatki, kolumna żywicy jest przemywana wodą demineralizowaną, korzystnie przy użyciu 10 do 151 wody/l żywicy. [0042] Następnie stosuje się roztwór solanki zawierający stężenie soli od 10 do 14 g/l, korzystnie od 11 do 13 g/l. [0043] Przepływ solanki wynosi od 1,5 do 2 m 3 /godz., a prędkość liniowa roztworu solanki wynosi korzystnie od 0,4 do 0,6 m/godz. Objętość solanki w stosunku do objętości żywicy wynosi od 2,5 do 3,5. [0044] Tak odzyskiwany eluat następnie zatęża się za pomocą jednego lub większej 7
liczby etapów ultrafiltracji, i opcjonalnie jednego lub większej liczby etapów diafiltracji. Etapy te korzystnie prowadzi się w niskiej temperaturze (2 do 6 C). [0045] Tak otrzymywany retentat jest poddawany mikrofiltracji i suszony za pomocą atomizacji. [0046] Jednakże, można rozważyć inne metody demineralizacji i zatężania, znane specjaliście z dziedziny. [0047] Otrzymuje się w ten sposób frakcję białek mleka mającą następujące parametry: - zawartość TGF-β wynosi od 0,010 do 0,025% masowych w stosunku do całkowitej masy białek. - zawartość IgG (Immunoglobulina) < 25% masowych w stosunku do całkowitej masy białek; - stosunek TGF-β/IGF 1 5 mas./mas. - zawartość laktoperoksydazy wynosi od 35 do 45% masowych w stosunku do całkowitej masy białek; [0048] Te frakcje białek mleka stanowią kolejny przedmiot wynalazku. [0049] W zaskakujący sposób, frakcja białek mleka według wynalazku powoduje zmniejszenie proliferacji limfocytów, co oceniano przy udziale komórek śledziony uśmiercanych myszy: komórki traktowane chlorkiem amonowym i przemywane, umieszczano w cieplarce na 48 godziny, w obecności frakcji białek będących przedmiotem wynalazku oraz mitogenu, jak konkanawalina A, z dodatkiem 5-bromodeoksyurydyny w środowisku komórkowym pod koniec okresu hodowli. Proliferację limfocytów oceniano dzięki ilości 5-bromodeoksyurydyny inkorporowanej do komórek. [0050] Wiedząc, że naskórek łuszczycowy jest miejscem napływu aktywowanych limfocytów T, frakcje białek, przedmiot wynalazku, można stosować do zapobiegania lub leczenia łuszczycy, ale również innych schorzeń, takich jak przewlekłe zapalne stany chorobowe i/lub ich objawy. Spośród tych stanów chorobowych można wymienić łuszczycę, ale również reumatoidalne zapalenie stawów, zapalenie kości i stawów, chorobę Crohna, stwardnienie rozsiane oraz toczeń rumieniowaty. Dodatkowo, mogą one mieć wpływ na czynnik zapalny chorób autoimmunologicznych. Nadają się zatem do stosowania do zapobiegania i/lub leczenia chorób autoimmunologicznych, w szczególności do zapobiegania i/lub leczenia czynnika zapalnego chorób 8
autoimmunologicznych. [0051] Dodatkowo, sposób według wynalazku można łatwo prowadzić na skalę przemysłową, przy prostej realizacji i z ograniczoną liczbą etapów. [0052] Kolejną zaletą sposobu według wynalazku jest fakt, że umożliwia on odzyskiwanie innych frakcji białek mleka, które mają szczególne znaczenie w przemyśle. Można prowadzić elucję kolumny za pomocą roztworów wodnych solanki o wzrastających stężeniach, co umożliwia odzyskiwanie różnych frakcji białek mleka, opcjonalnie po odzyskaniu frakcji z etapu e). W etapie e') frakcja, która jest eluowana roztworem solanki o przewodności od 50,5 do 51,5 ms/cm stanowi frakcję wzbogaconą w laktoferynę. Umożliwia ona odzyskiwanie kompozycji białek mleka bogatych w laktoferynę w pojedynczym etapie chromatografii. Korzystnie, ten etap sposobu prowadzi się przy spełnieniu jednego lub większej liczby następujących warunków: - objętość solanki w stosunku do objętości żywicy wynosi od 2,5 do 3,5, - przepływ solanki wynosi od 1,5 do 2 m 3 /godz., - prędkość liniowa elucji wynosi od 0,4 do 0,6 m/godz. [0053] Może on dodatkowo obejmować kolejne etapy ultrafiltracji, diafiltracji, mikrofiltracji i/lub suszenia, szczególnie poprzez suszenie rozpryskowe. [0054] Ten sposób izolacji frakcji białek mleka wzbogaconego w laktoferynę stanowi kolejny przedmiot wynalazku. [0055] Kolejnym przedmiotem wynalazku jest kompozycja farmaceutyczna zawierająca frakcję białek mleka według wynalazku i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik. [0056] W zależności od rodzaju schorzenia i nasilenia tego schorzenia, droga podawania i nośnik będą dobierane przez specjalistę: podawanie miejscowe (krem, balsam, plaster na skórę), podawanie doustne (kapsułki, syrop, tabletka, roztwór lub dyspersja wodna), wstrzykiwanie (roztwór do wstrzykiwania). [0057] Można również zaplanować wykorzystywanie frakcji białek mleka według wynalazku do otrzymywania kompozycji żywieniowych, szczególnie kompozycji dietetycznych, przeznaczonych specjalnie dla osób dotkniętych przewlekłymi chorobami zapalnymi, w szczególności łuszczycą, lub chorobami autoimmunologicznymi. Takie kompozycje żywieniowe zawierają frakcję białek mleka według wynalazku zamiast zazwyczaj stosowanych białek mleka. Mogą być to napoje białkowe, przetwory 9
mleczne. Stanowią one kolejny przedmiot wynalazku. [0058] Ilość frakcji białek mleka do podawania, i częstość podawania są dobierane przez specjalistę w zależności od schorzenia, jego nasilenia, wieku i wagi pacjenta. [0059] Kompozycje farmaceutyczne lub dietetyczne według wynalazku można stosować do leczenia przewlekłej choroby zapalnej, w szczególności łuszczycy, bądź choroby autoimmunologicznej, w okresie ataku. Mogą być również stosowane w okresie remisji, w taki sposób, aby zapobiegać i/lub unikąć i/lub rozkładać w czasie występowania kolejnych okresów ostrych napadów. PRZYKŁAD 1: Otrzymywanie frakcji białek mleka [0060] 250 m 3 mleka odtłuszczonego i poddawanego wstępnie obróbce termicznej w 68 C przez 15 sekund przepuszczano przez kolumnę do chromatografii (w kierunku zstępującym) z 20001 żywicy kationowymiennej (SPEC 70 dostarczanej przez BIOSEPRA) o następujących parametrach: [0061] Polimer w pełni syntetyczny, makroporowaty, polianionowy funkcjonalizowany ugrupowaniami SO - 3 ; polimer jest trójwymiarowy, o postaci kulistej lub sferoidalnej; wielkość cząstek jest większa niż 261 µm; nośnik jest wytwarzany poprzez polimeryzację AMPS: kwasu 2-akryloamido-2-metylopropanosulfonowego. [0062] Natężenie przepływu mleka przez kolumnę wynosi 14 m 3 /godz., a prędkość liniowa 3,2 m/godz. [0063] Po przejściu mleka, kolumna jest przemywana 23 000 litrami wody demineralizowanej (w kierunku zstępującym). [0064] Następnie stosuje się roztwór solanki 12 g/l do ekstrakcji z żywicy związanych białek. Stosowany przepływ wynosi 1900 l/godz., a prędkość liniowa 0,6 m/godz.; objętość otrzymanego eluatu jest bliska 8 000 litrów. [0065] Eluat ten następnie zatęża się za pomocą UF (DSS, membrany GR10D 400 m) w 4 C, z użyciem takiego czynnika stężenia objętościowego, że przewodność retentatu pozostaje wyższa od 15 ms/cm. Otrzymany retentat jest następnie zatężany po raz drugi, za pomocą UF i diafiltracji (wyposażonych w te same membrany, ale o powierzchni jedynie 34 m 2 ) aż do otrzymania przewodności retentatu rzędu 5 ms/cm. [0066] Tak otrzymywany retentat przepuszcza się w 30 C przez moduł do mikrofiltracji 10
o 17 m 2 i porowatości 1,4 µm; otrzymany permeat stanowi ekstrakt suchy w przybliżeniu 8% i jest atomizowany przy użyciu zwykłej wieży z dyszami, przy temperaturze powietrza wlotowego 180 C i temperaturze powietrza wylotowego 80 C. [0067] Odzyskuje się 1650 g frakcji białek mleka pod postacią proszku. Ta frakcja ma następujące parametry: Wilgotność 5,4% Białka 94,2% Popiół 0,9% Zawartość TGF-β 110 µg/g białek Zawartość laktoperoksydazy 407 mg/g białek Zawartość IgG <190 mg/g białek PRZYKŁAD 2: Wpływ frakcji białek mleka na wzrost komórek [0068] Wpływ tej frakcji białek mleka otrzymanej w Przykładzie 1 testowano na hodowli komórek pochodzących z wysięku w opłucnej z gruczolakoraka piersi, MCF7. Wykonano dwa doświadczenia. Komórki MCF7 wysiewa się w naczyniach o pojemności 25 cm 2 przy stężeniu 700 000 komórek/naczynie dla doświadczenia 1 oraz 200 000 komórek/naczynie dla doświadczenia 2. Po odczekaniu 24 godzin pożywkę odessano i zastąpiono 7 ml pożywką zawierającą frakcję białek otrzymaną w Przykładzie 1 przy stężeniu 218 µg/ml, 109 µg/ml lub 0 µg/ml (pożywka kontrolna). Następnie hodowano komórki przez 72 godziny, zmieniając pożywkę co 24 godziny. Wyniki odpowiadały średniej ze zliczeń prowadzonych dla 4 naczyń; dla każdego oznaczenia. [0069] Doświadczenia wyraźnie pokazują działanie hamujące, w sposób zależny od dawki, frakcji białek mleka otrzymanej w Przykładzie 1 na wzrost komórek MCF7. Stężenie frakcji białek w pożywce (µg/ml) 218 109 0 (próbka kontrolna) Doświadczenie 1 Doświadczenie 2 Liczba komórek (10 6 ) 3,64 ± 0,46 % redukcji w stosunku do próbki kontrolnej 11 4,64 ± 0,40 46,0% 31,2% Liczba komórek (10 6 ) 0,87 ± 0,05 % redukcji w stosunku do próbki kontrolnej 1,15 ± 0,08 47,9% 31,1% 6,74 ± 0,70 1,67 ± 0,08
PRZYKŁAD 3: Otrzymywanie suplementu diety zawierającego frakcję białek mleka [0070] Otrzymywano suplement diety pod postacią kapsułki, inkorporując frakcję białek mleka otrzymaną w Przykładzie 1. Frakcja białek mleka otrzymana w Przykładzie 1 Omégacaps z firmy Polaris (olej rybny w proszku, zawierający 20% kwasów tłuszczowych omega 3) Witamina PP (niacyna) Stearynian magnezu Emeocel W przeliczeniu na 1 kapsułkę 350 mg 125 mg 125 mg (w tym 25 mg omega 3) 1,25 mg 5 mg 93,75 mg PRZYKŁAD 4: Wpływ suplementu diety zawierającego frakcję białek mleka na osoby dotknięte łuszczycą [0071] Testowano wpływ suplementu diety otrzymanego w Przykładzie 3. Dwadzieścia osób (8 kobiet i 12 mężczyzn w wieku od 23 do 70 lat) dotkniętych łuszczycą spożywało dziennie 8 kapsułek (4 kapsułki rano i 4 kapsułki wieczorem) suplementu diety otrzymanego w Przykładzie 3 przez okres 60 dni. Oznacza to, że spożycie dzienne frakcji białek mleka otrzymanej w Przykładzie 1 wynosiło 1 g, co odpowiada 110 µg TGF-β. Kontrole objawowe i analizy krwi prowadzono przed i po 60 dniach spożywania tego suplementu diety. Wyniki: [0072] - Objawy łuszczycowe: po 60 dniach spożywania tego suplementu diety, u 80% osób zobserwowano znaczące polepszenie objawów (zmniejszenie płytek łuszczycowych, stanu zapalnego, łuszczenia i świądu). 12
Ogólna ocena objawów łuszczycowych U 20 osób Wyraźne polepszenie 6 30% Polepszenie 10 50% Brak polepszenia 4 20% Pogorszenie 0 0% - Nieszkodliwość: Ten suplement diety był dobrze tolerowany. Podczas całego okresu 60 dni spożywania nie zaobserwowano żadnego poważnego zdarzenia niepożądanego. Nie zaobserwowano żadnych nieprawidłowości parametrów wątrobowych (ASAT, ALAT, GGT), nerkowych (mocznik, kreatynina) ani hematologicznych (leukocyty, komórki wielojądrzaste, limfocyty, monocyty, płytki krwi), co potwierdza nieszkodliwość tego suplementu diety. 13
Zastrzeżenia patentowe 1. Sposób otrzymywania frakcji białek mleka, znamienny tym, że obejmuje następujące etapy: mleko lub serwatkę stosuje się jako produkt wyjściowy; (a) mleko lub serwatkę ewentualnie poddaje się mikrofiltracji lub obróbce termicznej; (b) mleko lub serwatkę, albo produkt uzyskany w etapie (a) nanosi się na żywicę kationowymienną złożoną z syntetycznego polimeru nanoporowatego, funkcjonalizowanego grupami funkcyjnymi typu zasada sprzęgana z anionem silnego kwasu; prędkość liniowa wynosi od 2,8 do 4,5 m/godz., a objętość mleka lub serwatki w stosunku do objętości żywicy wynosi od 100 do 200; (c) żywicę kationowymienną przemywa się wodą demineralizowaną; (d) żywicę wymywa się za pomocą roztworów solanki o wzrastających stężeniach; (e) odzyskuje się eluat odpowiadający roztworowi solanki o przewodności wynoszącej od 21,0 do 22,0 ms/cm. 2. Sposób według zastrzeżenia 1, znamienny tym, że obejmuje dodatkowo jeden lub kilku następujących etapów: (f) eluat otrzymany w etapie (e) zatęża się za pomocą ultrafiltracji i odzyskuje się retentat; (g) retentat otrzymany w etapie (f) wyjaławia się za pomocą mikrofiltracji i odzyskuje się permeat; (h) permeat otrzymany w etapie (g) poddaje się suszeniu rozpryskowemu. 3. Sposób według zastrzeżenia 1 albo zastrzeżenia 2, znamienny tym, że produkt wyjściowy stanowi mleko krowie. 4. Sposób według któregokolwiek z zastrzeżeń 1 do 3, znamienny tym, że wspomniany polimer żywicy kationowymiennej jest funkcjonalizowany grupami 14
SO - 3. 5. Sposób według któregokolwiek z poprzednich zastrzeżeń, znamienny tym, że natężenie przepływu kolumny w etapie (b) wynosi od 10 do 15 m 3 /godz. 6. Sposób według któregokolwiek z poprzedzających zastrzeżeń, znamienny tym, że spełniony jest jeden lub kilka z następujących warunków: - roztwór solanki zawiera stężenie soli od 10 do 14 g/l; - przepływ solanki wynosi od 1,5 do 2 m 3 /godz.; - prędkość liniowa roztworu solanki wynosi od 0,4 do 0,6 m/godz.; - objętość solanki w stosunku do objętości żywicy wynosi od 2,5 do 3,5. 7. Frakcja białek mleka otrzymywana sposobem według któregokolwiek z poprzedzających zastrzeżeń, znamienna tym, że spełnia następujące parametry: - zawartość TGF-β wynosi od 0,010 do 0,025% masowych w stosunku do całkowitej masy białek; - zawartość IgG (Immunoglobulina) < 25% masowych w stosunku do całkowitej masy białek; - stosunek TGF-β/IGF 1 wynosi 5 mas./mas.; - zawartość laktoperoksydazy wynosi od 35 do 45% masowych w stosunku do całkowitej masy białek. 8. Zastosowanie frakcji białek mleka według zastrzeżenia 7 do otrzymywania leku przeznaczonego do zapobiegania lub leczenia przewlekłych chorób zapalnych i/lub ich objawów. 9. Zastosowanie według zastrzeżenia 8 do otrzymywania leku przeznaczonego do zapobiegania lub leczenia łuszczycy i/lub jej objawów. 10. Zastosowanie frakcji białek mleka według zastrzeżenia 7 do otrzymywania leku przeznaczonego do zapobiegania lub leczenia chorób autoimmunologicznych. 11. Zastosowanie frakcji białek mleka według zastrzeżenia 7 do otrzymywania leku przeznaczonego do zapobiegania lub leczenia przejawów zapalnych chorób autoimmunologicznych. 15
12. Kompozycja farmaceutyczna zawierająca frakcję białek mleka według zastrzeżenia 7 i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik. 13. Kompozycja żywnościowa, szczególnie kompozycja dietetyczna, zawierająca frakcję białek mleka według zastrzeżenia 7. 14. Sposób według któregokolwiek z zastrzeżeń 1 do 6, znamienny tym, że obejmuje dodatkowo etap (e') izolacji frakcji białek mleka wzbogaconej w laktoferynę, w którym odzyskuje się eluat odpowiadający roztworowi solanki o przewodności wynoszącej od 50,5 do 51,5 ms/cm. 15. Sposób według zastrzeżenia 14, znamienny tym, że etap (e') tego sposobu prowadzi się przy spełnieniu jednego lub kilku następujących warunków: - objętość solanki w stosunku do objętości żywicy wynosi od 2,5 do 3,5, - przepływ solanki wynosi od 1,5 do 2 m 3 /godz., - prędkość liniowa elucji wynosi od 0,4 do 0,6 m/godz. 16
WCZEŚNIEJSZE PUBLIKACJE WYMIENIONE W OPISIE Niniejsza lista publikacji przywołanych przez Zgłaszającego przygotowana jest wyłącznie dla wygody czytelników. Nie stanowi ona części europejskiego dokumentu patentowego. Chociaż dołożono wielkiej staranności przy układaniu listy przywołanych publikacji, nie można wykluczyć błędów lub pominięć, a Europejski Urząd Patentowy uchyla się od wszelkiej odpowiedzialności w tym względzie. Dokumenty patentowe wymienione w opisie WO9634614A [0013] [0020] EP0313515A [0018] EP0545946A [0020] [0021] WO03008447A [0020] [0025] FR2827240 [0020] [0024] EP0869134A [0020] [0022] WO0125276A [0020] [0023] Literatura niepatentowa wymieniona w opisie G. PRUD'HOMME et al.j. Autoimmun., 2000, vol. 14, 23-42 [0015] M. SHULL et al.nature, 1992, vol. 359, 693-699 [0015] J.GRAYCAR et al.mol. Endocrinol., 1989, vol. 3, 1977-1986 [0015] J.LETTERIO et al.annu. Rev. Immunol., 1998, vol. 16, 137-161 [0015] 17