RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) 208422 (13) B1 Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (21) Numer zgłoszenia: 380804 (22) Data zgłoszenia: 10.10.2006 (51) Int.Cl. C12N 1/20 (2006.01) C12R 1/225 (2006.01) A61P 1/00 (2006.01) (54) Nowy szczep Lactobacillus rhamnosus (73) Uprawniony z patentu: INSTYTUT BIOTECHNOLOGII SUROWIC I SZCZEPIONEK BIOMED SPÓŁKA AKCYJNA, Kraków, PL (43) Zgłoszenie ogłoszono: 14.04.2008 BUP 08/08 (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: 29.04.2011 WUP 04/11 (72) Twórca(y) wynalazku: PIOTR B. HECZKO, Kraków, PL MAGDALENA STRUS, Kraków, PL URSZULA SKORUPSKA, Kraków, PL BARBARA ŁUKAWSKA, Kraków, PL GRZEGORZ STEFAŃSKI, Warszawa, PL (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Alina Magońska PL 208422 B1
2 PL 208 422 B1 Opis wynalazku Przedmiotem wynalazku jest nowy szczep Lactobacillus rhamnosus. W europejskim opisie patentowym EP 199535 opisano szczep Lactobacillus rhamnosus nazwany GG zdeponowany w ATCC pod numerem 53103. Szczep Lactobacillus rhamnosus GG przeznaczony jest do stosowania u ludzi i zwierząt w celu leczenia lub profilaktyki przewodu pokarmowego. Znany jest z amerykańskiego opisu patentowego nr US 2005074440 nowy szczep Lactobacillus rhamnosus CCRC 910145 (PTA-2406). Szczep ten użyty jest do kompozycji z probiotycznymi szczepami wybranymi z grupy. Z polskiego zgłoszenia patentowego nr 338775 znana jest biologicznie czysta kultura Lactobacillus rhamnosus HN001 nr depozytu AGAL NM97/09514 i Lactobacillus rhamnosus HN067 nr depozytu AGAL NM97/01925. Wymienione bakterie kwasu mlekowego mają korzystny wpływ na odporność organizmów. Celem wynalazku jest wyselekcjonowanie bakterii z rodzaju Lactobacillus o silnych właściwościach probiotycznych. Szczep powinien posiadać bardzo dobre właściwości probiotyczne, który będzie miał silniejsze oddziaływanie na przewód pokarmowy niż szczepy stosowane obecnie. Istotą wynalazku jest nowy szczep Lactobacillus rhamnosus KL53A PCM B/00011. 1. Identyfikacja szczepów. Nowy szczep Lactobacillus rhamnosus KL53A pochodzi z przewodu pokarmowego zdrowych noworodków karmionych mlekiem matki. Szczep został zdeponowany zgodnie z Traktatem Budapeszteńskim w Polskiej Kolekcji Mikroorganizmów (PCM) w Instytucie Immunologii i Terapii Doświadczalnej Polskiej Akademii Nauk, 53-114 Wrocław, ul. Rudolfa Weigla 12. Depozyty złożono w dniu 16.06 2005 r. Depozytowi nadano numer: Lactobacillus rhamnosus KL53A - numer depozytu - B/00011. 2. Oznaczanie przynależności gatunkowej szczepu Lactobacillus rhamnosus KL53A. Szczep poddany był szczegółowym badaniom potwierdzającym jego właściwości probiotyczne. W tym celu określono jego przynależność gatunkową metodami fenotypowymi (zestaw API 50CHL i API 20A) i genotypowymi (metoda PCR), ponadto wykonano sekwencjonowanie podjednostki 16 S rrna. Wykazano metodami fenotypowymi i genotypowymi, że szczep należy do następującego gatunku: KL53A - Lactobacillus rhamnosus. 3. Oznaczanie antagonistycznych właściwości szczepu Lactobacillus rhamnosus KL53A wobec typowych czynników patogennych przewodu pokarmowego za pomocą metody słupkowej. Badanie antagonizmu przeprowadzono za pomocą metody słupkowej. Wybrano drobnoustroje wskaźnikowe (Tabela 1), które stanowią tlenowe i beztlenowe czynniki patogenne zakażeń ludzkiego przewodu pokarmowego, oraz stanowią element składowy lokalnej flory przewodu pokarmowego (wybrane gatunki Lactobacillus i Bifidobacterium). T a b e l a 1: Antagonizm szczepu Lactobacillus rhamnosus KL 53 A względem szczepów wskaźnikowych. Szczepy wskaźnikowe Strefa zahamowania wzrostu / skala zahamowania wzrostu Stapylococcus aureus ATTC 25923 18 mm / 2 Salmonella enteritidis 22 mm / 3 Shigella sonnei 30 mm / 4 Lactobacillus rhamnosus GG 14 mm / 1 Lactobacillus plantarum DSMZ 20174 10 mm / 1 Bifidobacterium longum DSMZ 20219 20 mm / 2 Campylobacter jejuni ATCC 29428 35 mm / 4 Helicobacter pylori DSMZ 4867 30 mm / 4 Clostridium difficile 22 mm / 3
PL 208 422 B1 3 Skala zahamowania wzrostu: 1 - Średnica strefy zahamowania wynosi: 12-16 mm 2 - Średnica strefy zahamowania wynosi: 17-21 mm 3 - Średnica strefy zahamowania wynosi: 22-26 mm 4 - Średnica strefy zahamowania wynosi: 27-35 mm Badany szczep wykazuje bardzo silne antagonistyczne właściwości wobec bakterii wskaźnikowych należących do rodzajów: Campylobacter, Helicobacter, Shigella, zaś silne antagonistyczne właściwości zaznaczają się wobec rodzajów: Clostridium i Salmonella. Średnie właściwości antagonistyczne zaznaczają się wobec bakterii Gram dodatnich tzn. Staphylococcus i Bifidobacterium. Ponadto wykazano brak hamujących aktywności badanego szczepu wobec innych bakterii z rodzaju Lactobacillus (skala zahamowania wzrostu równa 1), co ma istotne znaczenie przy ustalaniu wzajemnych relacji (brak konkurencji) z tymi gatunkami Lactobacillus, które drogą naturalną skolonizowały przewód pokarmowy człowieka. 4. Oznaczanie właściwości adherencyjnych szczepu Lactobacillus rhamnosus KL53A do ludzkiej linii tkankowej HT-29MTX. Oznaczenie właściwości adherencyjnych szczepu Lactobacillus rhamnosus KL 53A zostało przeprowadzone na ludzkiej linii komórek jelitowych HT-29MTX. Działanie metotrexatu (MTX) indukuje tkankę HT-29 do wydzielania zwiększonej ilości śluzu, dzięki czemu ten model tkankowy bardziej przypomina naturalne właściwości jelita grubego zdrowego człowieka. Hodowlę tkankową prowadzono metodą wielokrotnych pasaży przez okres 20 dni do uzyskania jednolitej warstwy (monolayer). Stosowano podłoże DMEM (Dulbecco Minimal Essential Medium) (Gibco), wzbogacone dodatkiem 10% inaktywowanej, płodowej surowicy cielęcej. Ponadto, podłoże to zawierało 3 mm/ml L-glutaminy oraz antybiotyki: 100 μg/ml -1 streptomycyny i 100 U/ml -1 penicyliny. Hodowle prowadzono w temperaturze 37 C w atmosferze o zwiększonej wilgotności zawierającej 10% CO 2, zmieniając podłoże odżywcze 2 razy w tygodniu. Zliofilizowany szczep Lactobacillus rhamnosus KL 53A zawieszano w 10 ml bulionu MRS i inkubowano przez pół godziny w cieplarce, w temperaturze 37 C, a następnie sprawdzono gęstość szczepu za pomocą dziesiątkowych rozcieńczeń. Do testu adherencji pobrano 500 μl szczepu o gęstości około 2x10 9 i 500 μl płynu hodowlanego DMEM. Tak przygotowany szczep dodawano do dołków zawierających komórki Ht-29MTX. Komórki linii tkankowej wraz z badanym szczepem inkubowano w temperaturze 37 C, w atmosferze wzbogaconej 10% CO 2 przez 30 minut. Po inkubacji komórki przemywano dwukrotnie PBS w celu usunięcia nie przyczepionych bakterii, a następnie utrwalano 3,7% formaldehydem w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Po utrwaleniu komórki ponownie przemywano PBS i barwiono fioletem krystalicznym przez 3 minuty. Preparat oceniano mikroskopowo przy powiększeniu 1000 x. Liczono komórki Lactobacillus w 20 polach widzenia preparatu. Badanie adherencji szczepu do tkanki HT-29MTX było przeprowadzone dwukrotnie, a końcowy wynik zatem jest średnią powyższych badań. T a b e l a 2. Wynik adherencja szczepu Lactobacillus rhamnosus KL 53A do ludzkiej linii tkankowej HT-29MTX. Badanie Stopień adherencji Badanie I +++ Badanie II +++ Legenda dotycząca określenia stopnia adherencji do tkanki HT-29-MTX wg standardu wewnętrznego. Stopień adherencji Liczba komórek bakteryjnych +++ Powyżej 80 ++ Zakres 60-80 + Zakres 40-60 - Poniżej 40 Liczbę komórek bakteryjnych podaje się jako średnią z 20 pól widzenia w preparacie. HT29-MTX do badań stosuje się w postaci hodowli jednowarstwowej. Średnia z 20 pól widzenia z dwóch badań wynosiła powyżej 80 komórek bakteryjnych (+++).
4 PL 208 422 B1 Zliofilizowany szczep Lactobacillus rhamnosus KL53A wykazuje duży stopień adherencji do ludzkiej linii komórkowej nabłonka jelitowego HT-29MTX. Tłumaczyć to można faktem, iż zostały one wyizolowane z normalnej mikroflory ustroju ludzkiego. 5. Oznaczanie oporności na antybiotyki szczepu Lactobacillus rhamnosus KL53A za pomocą metody dyfuzyjno krążkowej. Szczep Lactobacillus rhamnosus oraz jego wzorce posiewano metodą redukcyjną na płytki ze stałym podłożem MRS, a następnie inkubowano w standardowych warunkach beztlenowych w temperaturze 37 C przez 24 godz. Uzyskane w ten sposób pojedyncze kolonie zawieszano w 1 ml płynnego podłoża MRS i inkubowano w tych samych warunkach przez 24 godz. Następnie przy wykorzystaniu soli fizjologicznej doprowadzano gęstość hodowli do 0,5 według skali McFarland'a dla szczepów Lactobacillus. Tak przygotowane zawiesiny bakteryjne rozprowadzano przy użyciu jałowego wacika po całej powierzchni uprzednio przygotowanych płytek ze stałym podłożem MRS w objętości 20 ml. Na płytki nakładano krążki nasycone antybiotykami, a następnie inkubowano w warunkach beztlenowych w temperaturze 37 C przez 24 godz. T a b e l a 3: Wrażliwość badanego szczepu Lactobacillus rhamnosus KL53A na antybiotyki oznaczone metodą krążkową wobec szczepów kontrolnych Antybiotyk Stężenie Lactobacillus rhamnosus GG Lactobacillus rhamnosus KL53A Penicylina 10:L 38 36 Ciprofloksacyna 5:L 25 22 Cefaklor 30:L 20 18 Doksacyklina 30:L 40 40 Oksycyklina 1:L 12 11 Kotrymoksazol 25:L 6 6 Erytromycyna 15:L 40 40 Ampicylina 10:L 21 25 Klindamycyna 2:L 30 30 Gentamycyna 10:L 14 14 Wankomycyna 30:L 6 6 Metronidazol 5:L 6 6 Oporność szczepów bakterii probiotycznych na leki przeciwbakteryjne jest przedmiotem szczegółowych badań ze względów bezpieczeństwa przyszłych preparatów leczniczych. Chodzi tu głównie o możliwość przeniesienia genów oporności na antybiotyki z podanych w preparacie, żywych bakterii na inne składniki flory chorego i rozpowszechnienie genów oporności wśród składników normalnej flory, co może spowodować uniemożliwienie leczenia ewentualnych zakażeń tego chorego lub jego kontaktów. Bakterie z rodzaju Lactobacillus wykazują oporność gatunkową, tzn. oporność, która na stałe związana jest z danym gatunkiem (np. bakterie Lactobacillus acidophilus są zawsze wrażliwe na wankomycynę, zaś np. Lactobacillus rhamnosus są na ten lek zawsze oporne). Oporność na dany antybiotyk pojawiająca się w jednym lub kilku szczepach danego gatunku odbiegająca od generalnej wrażliwości całego gatunku, lub znajdowana w szczepach wyizolowanych od chorego w trakcie leczenia antybiotykiem może oznaczać jednostkowe nabycie cechy oporności na drodze mutacji lub wymiany materiału genetycznego zlokalizowanego na plazmidzie, jest to już oporność plazmidowa (nabyta). Zjawisko nabywania oporności przez bakterie z rodzaju Lactobacillus nie jest korzystne, istnieje bowiem zagrożenie jej przekazywania enterokokom (również drogą plazmidową), które wraz ze szczepami Lactobacillus są naturalnym symbiontem przewodu pokarmowego. Izolacja DNA chromosomalnego metodą kolumienkową Na zdjęciu (a) widoczny prążek odpowiadający DNA chromosomalnemu (na wysokości prążka 23130pz markera wielkości λ/hind III). Nie widać żadnych prążków poniżej ani powyżej DNA chromo-
PL 208 422 B1 5 somalnego, które mogłyby świadczyć o obecności DNA plazmidowego. Kontrolą pozytywną jest szczep Lactobacillus rhamnosus u którego poniżej DNA chromosomalnego (prążek na wysokości 23130pz) widoczne są dodatkowe prążki świadczące o obecności DNA plazmidowego - zdjęcie (b). Izolacja DNA plazmidowego wg metody O'Sullivan Metoda używana do rodzaju Latobacillus i Lactococcus. Na zdjęciu (c) widać niewielkie ilości DNA chromosomalnego (na wysokości prążka 23130pz markera wielkości λ/hind III), które pozostało w trakcie izolacji DNA plazmidowego, nie widać prążków odpowiadających wielkością DNA plazmidowemu. Lekooporność badanych szczepu Lactobacillus rhamnosus KL53A reprezentuje wzór oporności typowy dla danego gatunku. Ponadto w wyniku zastosowania dwóch metod wykazano brak obecności dodatkowego prążka DNA (poniżej wysokości 23130pz) co może świadczyć o braku obecności DNA plazmidowego. 6. Oznaczenie oporności szczepu Lactobacillus rhamnosus KL53A na niskie ph. Badany szczep Lactobacillus rhamnosus namnożono w płynnym podłożu MRS. Hodowlę prowadzono w warunkach beztlenowych w 37 C przez 24 godziny, a po upływie tego czasu, za pomocą dziesiątkowych rozcieńczeń, określono uzyskaną gęstość poszczególnych bakterii. Następnie przy
6 PL 208 422 B1 pomocy 1N HCl obniżano ph medium hodowlanego do wartości 1,2 równej wartości ph soku żołądkowego. Hodowle dalej inkubowano przez 20 minut w warunkach beztlenowych w 37 C, a następnie ponownie ją wysiewano w celu określenia stopnia redukcji badanych populacji bakterii pod wpływem niskiego ph. T a b e l a 4: Oporność szczepów Lactobacillus na niskie ph. Gęstość bakterii podana w j.t.k./1 ml Szczep Czas wyjściowy 20 min. Inkubacji w ph 1.2 L. rhamnosus GG 1 x 10 8 1 x 10 7 L. rhamnosus KL53A 6 x 10 8 2,5 x 10 6 7. Oznaczanie oporności szczepu Lactobacillus rhamnosus KL53A na sole żółci. W celu oznaczenia oporności badanego szczepu Lactobacillus rhamnosus na sole żółci posłużono się metodą Dashkevicz'a i Feighner'a. Metoda ta polegała na dodaniu do agaru MRS barwnika wskaźnikowego - purpury bromokrezolowej [POCH] w ilości 0,17 g/l oraz soli żółci [OXGAL firmy Difco], w pięciu kolejnych stężeniach: 1 g/l, 2 g/l, 5 g/l, 10 g/l, 20 g/l. Na tak przygotowane, stałe podłoża MRS posiewano metodą redukcyjną 100 μl hodowli badane szczepy Lactobacillus, które następnie inkubowano w standardowych warunkach beztlenowych przez 48 godz. Po zakończonej inkubacji kolonie szczepów opornych na dane stężenie soli żółci nabierały koloru jasno żółtego, jak również podłoże wzrostowe zmieniało swoje zabarwienie z fioletowego na żółte. T a b e l a 5: Oporność szczepów Lactobacillus na sole żółci w stężeniach: 1, 2, 5, 10, 20 g/l. Sole żółci stężenie Lactobacillus rhamnosus GG Lactobacillus rhamnosus KL53A 1 g/l +++ +++ 2 g/l +++ +++ 5 g/l +++ +++ 10 g/l +++ +++ 20 g/l +++ +++ Przebadane szczepy Lactobacillus wykazały dużą oporność zarówno na niskie ph (równe wartości ph występujące w soku żołądkowym) jak i na sole żółci, co może świadczyć o i ich doskonałym przystosowaniu do niesprzyjających warunków panującym w ludzkim przewodzie pokarmowym. 8. Badanie antagonistycznego działania Lactobacillus rhamnosus KL53A na wzrost Candida albicans. Do badania antagonistycznego działania Lactobacillus rhamnosus KL53A na wzrost Candida albicans wybrano 4 grzyby z których 3 pochodziły z przewodu pokarmowego, zaś jeden był szczepem kolekcyjnym (Candida albicans ATCC 10231). Ponadto jako kontrolę antygrzybiczego działania bakterii kwasu mlekowego na grzyby zastosowano również szczep Lactobacillus rhamnosus GG. Do badania posłużono się zmodyfikowaną metodą półilościową według Fitzsimmons i Berry. Metoda polegała na zastosowaniu podłóż dwuwarstwowych. Pierwszą warstwę stanowiło podłoże MRS agar (Oxoid) na którym posiewano w formie paska o szerokości 2 cm badane szczepy probiotyczne z rodzaju Lactobacillus. Po wymazaniu płytki inkubowano przez 48 godzin w warunkach beztlenowych, a po upływie tego czasu na wierzch wylewano drugie, lekko przestudzone, płynne podłoże MYPG agar w kierunku wzrostu grzybów wskaźnikowych. Po zastygnięciu na podłoże wysiewano grzyby z rodzaju Candida o gęstości 0,5 MacFarlanda. Następnie płytki były wkładane na 4 godziny do lodówki na 4 C, a następnie dalszą inkubacje prowadzono już w warunkach tlenowych w 37 C przez 24 godziny. Uzyskane wyniki oceniono według następującej legendy: - Brak działania antagonistycznego Lactobacillus wobec Candida albicans nie zaobserwowano żadnej strefy zahamowania wzrostu Candida wzdłuż paska z wymazanym szczepem probiotycznym. + Częściowe działanie antagonistyczne Lactobacillus wobec Candida albicans obserwuje się lekkie przyhamowanie wzrostu Candida jedynie nad paskiem z wymazanym szczepem probiotycznym.
PL 208 422 B1 7 ++ Wyraźne działanie antagonistyczne Lactobacillus wobec Candida albicans obserwuje się wyraźne przyhamowanie wzrostu Candida nad paskiem z wymazanym szczepem probiotycznym czasami wyraźniej w jego górnej i dolnej części. +++ Bardzo silne działanie antagonistyczne Lactobacillus wobec Candida albicans obserwuje się wyraźne przyhamowanie wzrostu Candida nad paskiem i poza jego powierzchnią wzdłuż całej linii posiewu szczepu probiotycznego. Badanie antagonistycznego działania Lactobacillus rhamnosus KL53A za pomocą metody półilościowej w warunkach in vitro wykazało, iż tylko badany szczep z rodzaju Lactobacillus wykazuje działanie wobec 4 wybranych szczepów grzybów Candida albicans. T a b e l a 6. Antagonistyczne działanie Lactobacillus rhamnosus KL53A na wybrane szczepy Candida albicans. Badany szczep Lactobacillus rhamnosus KL53A Kontrola Lactobacillus rhamnosus GG Candida albicans 1 +++ +++ Candida albicans 2 ++ +++ Candida albicans 3 +++ +++ C. albicans wzorzec ATCC 10231 +++ +++ Wybrany drogą selekcji szczep bakterii należący do rodzaju Lactobacillus spełnił wszystkie wymagania stawiane szczepom probiotycznym. Wyboru dokonano w spośród szczepów, które w naturalny sposób kolonizują przewód pokarmowy i egzystują obok siebie. Dzięki temu oraz specyficznym cechom indywidualnym szczep Lactobacillus rhamnosus KL53A jest użyteczny w profilaktyce i leczeniu stanów będących wynikiem braku właściwej flory bakteryjnej przewodu pokarmowego. Przeprowadzone badania laboratoryjne wykazały, że wybrany szczep bakterii Lactobacillus rhamnosus spełnia wszystkie kryteria funkcjonalności i bezpieczeństwa wymagane od probiotyków doustnych i może być stosowany jako dodatek żywnościowe do uzupełniania składu fizjologicznej flory przewodu pokarmowego dzieci i dorosłych we wszystkich stanach wskazujących na zaburzenia tego składu z różnych przyczyn, np. związanych z leczeniem antybiotykami, biegunką na różnym tle, niedoborami witamin i innych składników pokarmowych. Zastrzeżenie patentowe Nowy szczep Lactobacillus rhamnosus KL53A nr depozytu PCM B/00011.
8 PL 208 422 B1 Departament Wydawnictw UP RP Cena 2,46 zł (w tym 23% VAT)