KATEDRA BIOCHEMII Wydział Biologii i Ochrony Środowiska Reakcje charakterystyczne aminokwasów BIOCHEMIA STRUKTURALNA ĆWICZENIE 1 REAKCJE CHARAKTERYSTYCZNE AMINOKWASÓW A) REAKCJE OGÓLNE ZADANIE 1 WYKRYWANIE WOLNYCH AMINOKWASÓW Obecność w roztworze wolnych aminokwasów można wykryć za pomocą reakcji ninhydrynowej. Aminokwasy pod wpływem ninhydryny ulegają utlenieniu do iminokwasów (patrz rys. 1). Następne etapy przemian to deaminacja i dekarboksylacja oraz wytworzenie aldehydu skróconego o 1 atom węgla. W wyniku kondensacji utlenionej i zredukowanej w tym procesie cząsteczki ninhydryny oraz amoniaku powstaje kompleks o fioletowoniebieskiej barwie (tzw. purpura Ruhenmana z maksimum absorpcji przy = 570 nm), którego natężenie jest proporcjonalne do zawartości azotu aminowego aminokwasu. Aminy i aminokwasy inne niż α- aminokwasy dają również niebieski kompleks, ale nie wydzielają CO 2. Prolina i hydroksyprolina, czyli aminokwasy, które nie zawierają wolnej grupy α- aminowej, dają w reakcji z ninhydryną kompleksy o zabarwieniu żółtym. Reakcja z ninhydryną może służyć do ilościowego oznaczania α-aminokwasów metodą spektrofotometryczną. Dodatni odczyn ninhydrynowy dają obok aminokwasów, peptydów i białek również sole amonowe, aminocukry i amoniak. Rys 1. Przebieg reakcji ninhydrynowej Kompleks barwny Do 1 ml 0,1% roztworu glicyny dodać 0,5 ml roztworu ninhydryny w 50 % etanolu. Probówkę ogrzać do wrzenia (pod dygestorium!). Reakcję powtórzyć dla proliny. Zapisać obserwacje i wyciągnąć odpowiednie wnioski.
ZADANIE 2 REAKCJA Z KWASEM AZOTOWYM (III) Aminokwasy pod wpływem kwasu azotowego (III), tworzącego się wg reakcji - in statu nascendi, (rys. 2) ulegają reakcji deaminacji, której produktami są azot cząsteczkowy (wydzielający się w formie gazowej) oraz odpowiedni hydroksykwas (rys. 3). Rys. 2 Rys. 3 Reakcja ta jest podstawą w gazometrycznej metodzie ilościowego oznaczania α- aminokwasów metodą van Slyke a. Do 2 ml 10% NaNO 2 dodać 2 ml 2 M CH 3 COOH. Po zmieszaniu obu cieczy zaczekać do momentu zakończenia wydzielania się pęcherzyków gazu (tlenki azotu). Następnie dodać 2 ml 0,5% roztworu glicyny. Zapisać obserwacje i wyciągnąć odpowiednie wnioski. ZADANIE 3 WYKRYWANIE GRUPY COOH Aminokwasy rozpuszczają się podobnie jak kwasy karboksylowe w 5% NaHCO 3. Reakcji towarzyszy wydzielanie się CO 2, czyli zjawisko perlenia, które daje się zauważyć zazwyczaj dopiero po około 3 minutach. Reakcja ta wskazuje na to, iż aminokwasy są mocniejszymi kwasami od H 2 CO 3. Do 1 ml 5% roztworu NaHCO 3 dodać szczyptę glicyny. Odczekać 2-3 minuty. Zapisać obserwacje i wyciągnąć odpowiednie wnioski.
B) REAKCJE CHARAKTERYSTYCZNE NIEKTÓRYCH AMINOKWASÓW ZADANIE 4 REAKCJA KSANTOPROTEINOWA Aminokwasy aromatyczne ulegają reakcji nitrowania w czasie ogrzewania ze stężonym kwasem azotowym, dając żółto zabarwione pochodne nitrowe. Po zalkalizowaniu powstałe związki nitrowe ulegają redukcji do amin, przyjmując równocześnie zabarwienie pomarańczowe. Do 1 ml tyrozyny dodać 1 ml stężonego kwasu azotowego (pod dygestorium!). Probówkę ogrzewać przez 30 sekund (pod dygestorium!). Zaobserwować zmianę zabarwienia roztworu. Po ostudzeniu wprowadzić w nadmiarze 30 % roztwór NaOH. UWAGA! Reakcja silnie egzotermiczna! Zapisać obserwacje i wyciągnąć odpowiednie wnioski. ZADANIE 5 REAKCJA MILLONA WYKRYWANIE TYROZYNY Reakcja zachodzi pod wpływem odczynnika Millona, który zawiera w swoim składzie jony rtęciowe (I) i (II) oraz azotowe (III) i (V). Powstające w wyniku reakcji czerwone zabarwienie pochodzi od kompleksu rtęciowo-fenolowo- nitrozowego.
Do1 ml tyrozyny dodać kilka kropli odczynnika Millona. Probówkę ogrzewać przez kilka minut we wrzącej łaźni wodnej. Zapisać obserwacje i wyciągnąć odpowiednie wnioski. ZADANIE 6 WYKRYWANIE AMINOKWASÓW ZAWIERAJĄCYCH GRUPY HYDROSULFIDOWE Aminokwasy zawierające w łańcuchu bocznym grupę hydrosulfidową ( SH), czy wiązanie disulfidowe ( S S ) można wykryć w reakcji z solami ołowiu. Związki te ogrzewane w temperaturze 100 C, w środowisku zasadowym ulegają hydrolizie. Uwolniona w postaci jonów siarczkowych siarka tworzy z jonami ołowiowymi (II) czarny, nierozpuszczalny osad siarczku ołowiu (II). Metionina daje negatywny wynik reakcji, ponieważ występująca łańcuchu bocznym tego aminokwasu grupy tioeterowa ( S ), w znacznym stopniu obniża reaktywność siarki w stosunku do grupy hydrosulfidowej ( SH). Na 2 S + (CH 3 COO) 2 Pb 2CH 3 COONa + PbS Do 1 ml 1% cysteiny dodać 2 ml 6 M NaOH a następnie 0,5 ml 1% (CH 3 COO) 2 Pb. Zawartość probówki wymieszać i ogrzewać we wrzącej łaźni wodnej przez około 3-5 minut. Zapisać obserwacje i wyciągnąć odpowiednie wnioski. ZADANIE 7 REAKCJA SAKAGUCHI NA ARGININĘ Grupa guanidynowa argininy w obecności utleniacza bromianu (I) w środowisku zasadowym tworzy z α-naftolem barwny, pomarańczowo-czerwony produkt i uwalnia się amoniak. W razie dłuższego działania NaBrO następuje odbarwienie roztworu, ponieważ barwny produkt utlenia się dalej. Dodanie roztworu mocznika stabilizuje utworzony barwnik. Reakcja ta wykorzystywana jest do ilościowego oznaczenia argininy w białkach, szczególnie bogatych w ten aminokwas.
arginina α- naftol Do 1 ml 0,1% roztworu argininy dodać 1 ml 10% roztworu NaOH i 2 krople świeżo przygotowanego 1% alkoholowego roztworu α-naftolu (w 50% EtOH). Wymieszać energicznie, a następnie dodać 0,1 ml roztworu bromianu (I) sodu i ponownie wymieszać. W celu stabilizacji pojawiającego się pomarańczowo-czerwonego barwnika dodać 0,5 ml 40% roztworu mocznika. Zapisać obserwacje i wyciągnąć odpowiednie wnioski. ZADANIE 8 REAKCJA ADAMKIEWICZA I HOPKINSA WYKRYWANIE TRYPTOFANU Jest to reakcja charakterystyczna dla tryptofanu zawierającego pierścień indolowy W obecności kwasu siarkowego i formaldehydu dwie grupy indolowe ulegają kondensacji z wydzieleniem cząsteczki wody i dają barwny fioletowy związek. Schemat przebiegu reakcji:
Do 1 ml tryptofanu dodać kilka kropli 20% kwasu mrówkowego. Po wymieszaniu, roztwór podwarstwić (po ściance) stężonym H 2 SO 4. Na granicy cieczy powstaje fioletowy pierścień. Zapisać obserwacje i wyciągnąć odpowiednie wnioski. ZAKRES MATERIAŁU 1. Aminokwasy - budowa chemiczna (wzory strukturalne, węgiel asymetryczny, węgiel ). 2. Podział aminokwasów. 3. Izomery optyczne aminokwasów (szereg D i L). 4. Punkt izoelektryczny aminokwasów (jon dwubiegunowy, kation aminokwasowy, anion aminokwasowy). 5. Pojęcia: peptyd, polipeptyd białko. 6. Peptydy- reakcja powstawania, zasady budowy. 7. Charakterystyka wiązania peptydowego. 8. Peptydy naturalne- charakterystyka. Literatura 1. Biochemia wyd.3, E. Bańkowski, Edra Urban & Partner, Wrocław, 2016. 2. Biochemia, J. M. Berg i wsp., PWN, Warszawa, 2007. 3. Biochemia Harpera, R. K. Murray i wsp., PZWL, Warszawa, 2006. 4. Cytobiochemia, L. Kłyszejko-Stefanowicz, PWN, Warszawa, 2002. 5. Biochemia kręgowców, W. Minakowski, S. Weidner, PWN, Warszawa, 2005. 6. Zarys biochemii, P. Karlson, PWN, Warszawa, 1987. 7. Ćwiczenia z biochemii, L. Kłyszejko-Stefanowicz, PWN, Warszawa, 2005. 8. Ćwiczenia z biochemii, Strzeżek J., ART, Olsztyn, 1997. 9. Ćwiczenia z biochemii, Logoń A. i in., ART, Olsztyn, 1997.