Metabolizm i transport auksyn w roślinach

Metabolizm i transport auksyn w roślinach Auxin metabolism and transport in plants ANNA JAKUBOWSKA1, ELŻBIETA ZIELIŃSKA2, STANISŁAW KOWALCZYK3 Spis treści: I. Wstęp II. Biosynteza auksyn II-l. Synteza IAA zależna od tryptofanu II- l.l. Kwas indolilo-3-pirogronowy intermediatem w szlaku biosyntezy IAA II-I.2. Szlak biosyntezy IAA prowadzący przez indoiilo-3-acetaldoksym II-1.3. Tryptamina związkiem pośrednim w szlaku biosyntezy IAA II-1.4. Biosynteza IAA w szlaku prowadzącym przez indolilo-3-acetamid II-2. Synteza IAA niezależna od tryptofanu II-3. Biosynteza kwasu indolilo-3-masłowego i kwasu 4-chloroindoliIo-3-octowego III. Transport auksyn III-l.N ośniki transportujące auksyny IV. Odwracalna i nieodwracalna inaktywacja fitohormonu IV-1. Synteza i hydroliza koniugatów IAA IV-1.1. Koniugaty estrowe IV-1.2. Koniugaty amidowe IV-2. Degradacja IAA V. Podsumowanie Contents: I. Introduction II. Auxin biosynthesis II-l. Tryptophan-dependent IAA biosynthesis II-l.l. Indole-3-pyruvic acid an intermediate in IAA biosynthetic pathway II-1.2. The indole-3-acetaldoxime pathway of IAA biosynthesis II-1.3. Tryptamine an intermediate in IAA biosynthetic pathway II-1.4. Indole-3-acetamide pathway of IAA biosynthesis II-2. Tryptophan-independent IAA biosynthesis II-3. IndoIe-3-butyric acid and 4-chIoroindole-3-acetic acid biosynthesis III. Auxin transport III-l.T h e auxin transport carriers IV. Reversible and irreversible inactivation of fitohormone IV-1. Synthesis and hydrolysis of IAA conjugates IV-1.1. Ester conjugates IV-1.2. IAA-amide conjugates IV-2. Degradation pathway of IAA V. Summary Wykaz stosowanych skrótów: 4-C1-IAA kwas 4-chloroindolilo-3-octowy; 2,4-D kwas 2,4-dichlorofenoksyoctowy; IAA kwas indolilo-3-octowy; IAAld aldehyd indolilo- 3-octowy; IA-Asp indoliło-3-acetyloasparaginian; IA-Glu - indolilo-3-acetyloglutaminian; 1-O-IA-glukoza l-0-(indolilo-3-acetylo)-p-d-glukoza; IAld indolilo-3-aldehyd; IAM indolilo-3-acetamid; IAN indolilo-3-acetonitryl; IAOX indolilo-3-acetaldoksym; IBA kwas indolilo-3-masłowy; IM indolilo-3-metanol; IMG indolilo-3-metyloglukozynolat; IPA kwas indolilo-3-pirogronowy; 1-NAA kwas naftylo-l -octowy; 1-NPA kwas naftyloftalamowy; TIBA kwas trijodobenzoesowy I. Wstęp Procesy wzrostu i rozwoju roślin są regulowane przez niskocząsteczkow e endogenne substancje Dr, 2mgr, 3dr hab., prof. UMK, Zakład Biochemii Instytutu Biologii Ogólnej i Molekularnej UMK, ul. Gagarina 9, 87-100 Toruń, e-mail: anjakubo@ cc.uni.torun.pl zwane fitohormonami lub hormonami roślinnymi. Charakteryzują się one pow szechnością w ystępow a nia w roślinach, aktywnością biologiczną w bardzo niskich stężeniach, a niektóre z nich, podobnie jak hormony zwierzęce, działaniem odległym od miejsc biosyntezy. Do hormonów roślinnych zalicza się substancje zróżnicowane pod względem budowy chemicznej i aktywności fizjologicznej takie jak: auksyny, giberełiny, cytokininy, etylen i kwas abscysynowy oraz jasm onidy i brasinosteroidy [ 1]. Pierwszym zidentyfikowanym hormonem roślinnym był kwas indolilo-3-octowy (IAA), naturalna auksyna zawierająca w cząsteczce pierścień indolowy. Obecnie oprócz IAA do naturalnych auksyn zalicza się również kwas 4-chloroindolilo-3-octowy (4-C1-IAA), kwas indolilo-3-masłowy (IBA), a także niektóre związki nie zawierające pierścienia indolowego np. kwas fenylooctowy, kwas p-hydroksyfenylooctowy. Otrzymano też syntetycznie kilka związków (kwas naftylo-1-octowy, 1-NAA; kwas 2,4-dichlorofenoksyoctowy, 2,4-D), które podawane POSTĘPY BIOCHEMII 47(2), 2001 http://rcin.org.pl 169

egzogennie wywołują u roślin reakcje fizjologiczne analogiczne do tych jakie obserwuje się w przypadku naturalnych auksyn. Auksyny uczestniczą w regulacji szeregu procesów fizjologicznych takich jak wzrost, podziały i różnicowanie komórek. Regulowanie wzrostu wydłużeniowego łodyg, udział w m echanizm ach korelacji wzrostowych typu dominacji wierzchołkowej czy też funkcjonowanie w foto- i geotropizm ie są typowymi przykładam i plejotropow ego działania auksyn. Od niemal trzech dziesięcioleci prowadzone są intensywne badania w celu poznania pierwotnych m echanizmów działania auksyn. Próbą podsum ow a nia dotychczasowych osiągnięć na tym polu jest praca przeglądowa opublikowana w ostatnim czasie w Postępach Biologii Komórki [2]. Wyniki badań ostatnich lat zaowocowały pow staniem szeregu nowych koncepcji traktujących auksyny już nie tyle jako fitohormony, lecz raczej jako je den z roślinnych morfogenów [3-5]. Koncepcje te zyskują obecnie coraz szersze oparcie w wynikach badań biologii molekularnej, szczególnie badań związanych z poznawaniem mechanizmu polarnego transportu auksyn. W większości badanych procesów fizjologicznych zależność między zmianami stężenia auksyny w wąskim jego przedziale a wywoływanymi efektami ma charakter liniowy. M ożna stąd w nioskować, iż procesy bezpośrednio wpływ ające na aktualne stężenie auksyny w komórce, tkance czy organie decydują o intensywności oraz kierunku wzrostu i rozwoju rośliny. Zmiany wewnątrzkomórkowego stężenia IAA są wypadkową reakcji biosyntezy i transportu hormonu, syntezy i hydrolizy koniugatów oraz degradacji wolnej i związanej w koniugatach auksyny (Ryc. 1). Do w zrostu stężenia IAA w ko- mórce prowadzi synteza de novo, uwalnianie horm o nu z koniugatów oraz jego dokomórkowy transport, natom iast transport auksyny z kom órki, synteza koniugatów oraz reakcje utleniania prowadzące do degradacji hormonu pow odują spadek stężenia w olnego IAA. Mimo że procesy wpływające na poziom aktywnego hormonu w komórce zostały już w ogólnym zarysie poznane, to m echanizm y regulacyjne zaangażowane w kontrolę zmian stężenia wolnej auksyny w roślinie są prawie całkow icie nieznane. II. Biosynteza auksyn Wyniki wieloletnich badań biochemicznych świadczą o funkcjonowaniu w roślinach kilku dróg syntezy kwasu indolilo-3-octow ego. Hipotezy na temat działania poszczególnych szlaków biosyntezy IAA wysuwano stopniowo na podstaw ie identyfikacji związków pośrednich (intermediatów) oraz ich wzajem nych przekształceń, a także na podstaw ie badań enzymów katalizujących niektóre przemiany. Kierunek poszukiwań wyznaczały również wyniki badań prow adzonych na w ybranych bakteriach glebowych i grzybach [6]. W większości szlaków biosyntezy prekursorem IAA jest tryptofan, aminokwas zawierający w cząsteczce pierścień indolowy. Jednakże szereg nowszych doniesień wskazuje na możliwość syntezy IAA w reakcjach niezależnych od tryptofanu. W piśm iennictwie polskim zagadnienia związane z biosyntezą auksyn są skrótowo omówione w monografii wydanej pod redakcją Jankiewicza [7], natomiast w literaturze angielskojęzycznej problematyka ta prezentow ana jest w kilku publikacjach m onograficznych [8-13]. II-l. Synteza IAA zależna od tryptofanu Ryc. 1. Procesy regulujące stężenie kwasu indolilo-3-octowego (IAA) w komórce. Wyniki licznych badań prowadzonych od niemal półw iecza dowodzą, iż w zależności od gatunku rośliny, rodzaju tkanki lub organu, a przypuszczalnie również od stanu fizjologicznego rośliny IAA może być syntetyzowany z tryptofanu w czterech niezależnych szlakach przem ian [14]. Kluczowym i produktami pośrednimi poszczególnych szlaków są: kwas indolilo-3 -pirogronowy, indolilo-3-acetaldoksym, indolilo-3-acetamid oraz tryptamina (Ryc. 2). Rolę tryptofanu jako prekursora w syntezie IAA potw ierdzają wyniki najnowszych badań prowadzonych na dojrzewających w hodowli in vitro nasionach kukurydzy [15], szczytowych odcinkach koleoptyli kukurydzy [16], kiełkach fasoli [17], a także korzeniach Arabidopsis thaliana [18]. W kolejnych podroz 170 http://rcin.org.pl POSTĘPY BIOCHEMII 47(2), 2001

Ryc. 2. Szlaki zależnej od tryptofanu biosyntezy kwasu indolilo-3-octowego z zaznaczonymi najważniejszymi produktami pośrednimi: kwasem indolilo-3-pirogronowym (IPA), tryptaminą (TAM), indolilo-3-acetaldoksymem (IAOX) i indolilo-3-acetamidem (IAM) (wg [12], zmodyfikowane). działach omówione zostaną najważniejsze wyniki tych badań. I I - l.l. Kwas indoiilo-3-pirogronowy interm ediatem w szlaku biosyntezy IAA Deaminacja tryptofanu do kwasu indolilo-3-pirogronowego (IPA) jest katalizowana przez aminotransferazę, której obecność stw ierdzono u wielu gatunków roślin [14,19]. Aminotransferaza tryptofanowa w obecności 2-oksoglutaranu wykazuje in vitro stosunkowo niskie pow inow actw o względem tryptofanu oraz niską specyficzność substratową. Jednakże szczegółowe badania aminotransferazy tryptofanowej z Enterobacter cloacae bakterii żyjącej na korzeniach ogórka, potwierdzają poznane częściowo właściwości enzymu roślinnego. Enzym bakteryjny funkcjonuje w biosyntezie IPA katalizując odw racalną reakcję, w której uczestniczy 2-oksoglutaran jako kosubstrat i fosforan pirydoksalu jako kofaktor [20]. Mimo że związki pośrednie powstające w tym szlaku zidentyfikowano w kiełkach grochu, jęczm ienia, pomidora i ogórka [21-23], to labilność IPA oraz możliwość nieenzym atycznej, samorzutnej przem iany IPA do IAA utrudniają zarówno interpretację w y ników jak też identyfikację i oczyszczanie enzymów katalizujących poszczególne reakcje. W dekarboksylacjilpa, w wyniku której powstaje aldehyd indolilo-3-octowy (IAAld), uczestniczy dekarboksylaza znaleziona w tkankach pom idora [14, 22], a przebadana wszechstronnie u E. cloace [24]. Końcow ą reakcję szlaku, polegającą na utlenianiu IAAld do kwa- su indolilo-3-octowego, może katalizować dehydrogenaza zależna od NAD [cyt. za 14] lub stosunkowo dobrze poznana oksydaza aldehydowa, izolowana z epikotyli grochu, koleoptyli kukurydzy oraz ścian komórkowych jęczm ienia [25-27]. Enzym jest metaloflaw oproteiną zaw ierającą oprócz FAD jony żelaza i m olibdenu. U A. thaliana zidentyfikowano cztery geny kodujące izoenzymy oksydazy aldehydowej. Niektóre z nich utleniają IAAld, inne funkcjonują w szlaku biosyntezy kwasu abscysynowego utleniając aldehyd abscysynowy do kwasu abscysynowego [28]. Podw yższony poziom oksydazy IAAld stw ierdzono u mutanta surl (superroot 1) A. thaliana charakteryzującego się nadprodukcją IAA [28, 29]. M u tant su rl jest jednym z 13 allelicznych mutantów {alf 1-1, sur 1-1 sur 1-7, rtyl, ivrl, 2, hls3-l, rty-3), które m ają 2-17-razy więcej wolnego IAA niż rośliny dzikie [30-33]. W szystkie mutanty sąfenotypowo podobne do mutanta rty (rooty), u którego zmutowany gen został już sklonowany [32, 34]. Fenotyp podwójnego mutanta rtyaxrl-3 powstałego w wyniku krzyżówki rty z m utantem a xrl-3 o obniżonej w rażliwości na IAA jest zbliżony do rośliny dzikiej. M o żna zatem sądzić, że fenotyp mutanta rty jest następstwem podwyższonego stężenia wolnego IAA [32]. Gen RTY A. thaliana koduje białko, którego sekwencja aminokwasowa jest homologiczna z sekwencją ludzkiej am inotransferazy tyrozynowej [34]. Obserwowana nadprodukcja IAA będąca efektem mutacji sugeruje, że enzym nie funkcjonuje w syntezie, lecz raczej w degradacji IAA lub syntezie jego koniugatów. Am inotransferaza m ogłaby również uczestni POSTĘPY BIOCHEMII 47(2), 2001 171 http://rcin.org.pl

czyć w przemianie IPA do tryptofanu kontrolując w ten sposób poziom IAA powstającego z kwasu indolilo-3-pirogronowego, szczególnie w przypadku biosyntezy IAA w szlaku niezależnym od tryptofanu [10]. II-1.2. Szlak biosyntezy IAA prowadzący przez indoli- Io-3-acetaldoksym Przemianę tryptofanu do indolilo-3-acetaldoksymu (IAOX) obserwowano po raz pierwszy we frakcji błon plazmatycznych kapusty pekińskiej (Brassica campestris ssp. pekinensis), ale aktywność oksydazy tryptofanowej utleniającej Trp stw ierdzono również we frakcji błon kom órkow ych kukurydzy, tytoniu, słonecznika i grochu [35]. Z kolei indolilo-3-acetaldoksym może ulegać przekształceniom do aldehydu indolilo-3-octow ego (IAAld), indolilo-3-acetonitrylu (IAN), a w pewnych warunkach również do indolilo-3-metyloglukozynolatu (IMG) i indolilo-3-acetam idu (Ryc. 3). Przem ianę IAOX do geny kodujące izoenzymy nitrylazy (N ITl do NIT4), których ekspresja jest zróżnicowana w zależności od tkanki i fazy rozwojowej rośliny [40-42], Dwa z genów nitrylazy zostały już sklonowane, a ich produkty uzyskane w bakteryjnym układzie ekspresyjnym w y kazują in vitro aktywność hydrolityczną względem IAN [41]. Gen NIT2 udało się wprowadzić do tytoniu i uzyskać transgeniczną odm ianę zaw ierającą akty w ną nitrylazę [43]. W ostatnim czasie w yselekcjonowano trzy mutanty nitl A. thaliana, które charakteryzują się obniżoną wrażliwością na egzogennie podawany indolilo-3-acetonitryl, a jednocześnie pozostają wrażliwe na egzogenny IAA. Każdy z trzech mutantów ma pojedynczą m utację punktow ą w regionie kodującym genu NIT1 [44]. Uzyskano także transgeniczne linie A. thaliana transform owane genami N IT w pozycji sensownej i anty sensownej. Rośliny zawierające geny NIT1 i NIT2 w pozycji antysensownej mają o 75% mniej IAA i dwukrotnie więcej IAN [45]. SN H aldehyd indolilo-3-octowy (IAAld) kwas indolilo-3-octowy (IAA) aldehydu indolilo-3-octow ego (IAAld) obserw ow a no w komórkach kapusty pekińskiej [36], ale wyniki wcześniejszych doświadczeń sugerują, że reakcja tego typu zachodzi u wielu roślin z różnych grup system atycznych [37]. Najwięcej doniesień w literaturze światowej dotyczy jednak przemiany IAOX do indolilo-3-acetonitrylu (IAN) oraz hydrolizy IAN do IAA katalizowanej przez nitrylazę (aminohydrolazę nitrylową) [37-39]. Enzym uczestniczący w przemianie IAOX do IAN, częściowo oczyszczony z błon plazm atycznych siewek kapusty pekińskiej, w ykazuje wysokie powinowactwo względem IAOX (XM= 6,3 x 10'6M) [39]. Genom A. thaliana zawiera cztery Ryc. 3. Przemiany indolilo-3-acetaldoksymu prowadzące do powstawania kwasu indolilo- 3-octowego (wg [35], zmodyfikowane) U roślin z rodziny krzyżow ych IAOX może ulegać konwersji do indolilo-3-metyloglukozynolatu (IMG, glukobrazycyna) [38], z którego powstaje indolilo-3-acetonitryl w reakcji katalizowanej przez enzym nazywany mirozynazą [46]. Wydaje się, że wzmożona przemiana IMG do IAN zachodzi w sytuacji uszkodzenia tkanki na skutek zranienia lub infekcji patogenem roślinnym. W bakteriach, a przypuszczalnie również w niektórych roślinach, IAN może ulegać przem ianie katalizowanej przez hydratazę nitrylow ą do indolilo-3-acetam idu (IAM), który następnie jest przekształcany przez am idazę do IAA i amoniaku [47]. 172 POSTĘPY BIOCHEMII 47(2), 2001 http://rcin.org.pl

Obecnie uważa się, że szlak biosyntezy prowadzący przez indolilo-3-acetaldoksym i indoli- 10-3-acetonitryl funkcjonuje u przedstawicieli rodzin krzyżowych (Cruciferae), traw ( Gram inae) i bananowców (M usaceae) [ 10], a także bakterii glebowych z rodzaju Agrobacterium i bakterii symbiotycznych z grupy rizobiów [6]. 11-1.3. Szlak biosyntezy IAA prow adzący przez tryptam inę Ten szlak biosyntezy IAA rozpoczyna się od dekarboksylacji tryptofanu prowadzącej do powstania tryptaminy (Ryc. 2). Z barwinka różyczkowego (Catharanthus roseus) oczyszczono dekarboksylazę tryptofanową i sklonowano gen kodujący ten enzym [48, 49], natomiast oksydazę aminową katalizującą przemianę tryptaminy do aldehydu indolilo-3-octowego oczyszczono z epikotyli grochu [50]. Przypuszcza się, że szlak biosyntezy IAA prowadzący przez tryptaminę funkcjonuje głównie u niektórych roślin m otylkowych [14]. II-1.4. Biosynteza IAA w szlaku prowadzącym przez indoiilo-3-acetamid monas sklonowano kodujące je geny {iaam i iaah) [6]. Możliwość syntezy IAA u niektórych roślin wyższych w szlaku prowadzącym przez indolilo-3-acetamid potwierdza wykryta w ryżu aktywność hydrolazy indolilo-3-acetamidowej [51] oraz obecność indolilo-3-acetamidu zidentyfikowanego w hipokotylu wiśni japońskiej (Prunus jam asacura) [52], II-2. Synteza IAA niezależna od tryptofanu Pierwszą reakcją w tym szlaku biosyntezy IAA jest konwersja tryptofanu do amidu kwasu indoliantranilan Wyniki doświadczeń prowadzonych na początku lat 90-tych na rzęsie {Lemna gibba) sugerowały m o żliwość funkcjonowania w niektórych roślinach także innych szlaków biosyntezy IAA, niezależnych od tryptofanu [53]. Sugestie te potwierdzono w przypadku m utanta orp (ang. orange pericarp) kukurydzy, u którego na skutek mutacji w genie syntazy tryptofanowej (3 wyłączona jest przemiana indolu do tryptofanu (Ryc. 4). Mimo tego defektu kiełki m utanta orp mają niemal 50 razy więcej IAA niż rośliny kontrolne [54]. Badania izotopowe prowadzone na mutancie orp wykazały, że IAA może powstawać z 15N-antranilanu z pominięciem syntezy tryptofanu. Podobne rezultaty uzyskano w doświadczeniach prowadzonych na rzęsie [55], a także mutantach trp3-l i trp2-l A. thaliana, u których w wyniku m utacji zacnpp indolilo-3-glicerolofosforan (IPG) indolilo-3-acetonitryl (LAN) COOH a -syn ta za T rp I! trp 3-1 sery n a + P -syntaza Trp indol orp trp 2-1 H COCH OH COOH H kwas indolilo-3-pirogronowy (IPA ) kwas indolilo-3-octowy (IAA NH, tryptofan (Trp) Ryc. 4. Schemat niezależnej od tryptofanu biosyntezy kwasu indolilo-3-octowego (wg [10], zmodyfikowane) lo-3-octowego (IAM), który następnie jest hydrolizowany do IAA (Ryc. 2). Poznano bakteryjne enzymy monooksygenazę tryptofanową (IaaM) i hydrolazę indoliio-3-acetam idow ą (IaaH) katalizujące obydwie reakcje, a z Agrobacterium i Pseudo- blokowana zostaje przemiana indolilo-3-glicerolofosforanu do indolu (trp3-l) lub indolu do tryptofanu (trp2-l) (Ryc. 4) [56]. Autorzy używając 15N-antranilanu wykazali, iż u mutanta trp2-l znakowanie w IAA jest wyższe niż w tryptofanie. Również wyniki POSTĘPY BIOCHEMII 47(2), 2001 http://rcin.org.pl 173

badań prowadzonych na nasionach kukurydzy [57], a także ekstraktach kiełków kukurydzy linii dzikiej i mutanta orp potwierdzają możliwość syntezy IAA z indolu [58, 59]. Michalczuk i wsp. [60] analizując zmiany stężenia IAA w kulturach kom órkowych marchwi wykazali, że nawet w tej samej roślinie IAA może być syntetyzowany w szlaku zależnym bądź niezależnym od tryptofanu. Niezróżnicowane komórki marchwi hodowane w środow isku zaw ierającym kwas 2,4-dichlorofenoksyoctowy (2,4-D) wydajniej syntetyzują IAA w szlaku zależnym od tryptofanu, natomiast po zaindukowaniu embriogenezy somatycznej, z chwilą usunięcia syntetycznej auksyny, aktywacji ulega szlak syntezy IAA z prekursorów tryptofanu. II-3. Biosynteza kwasu indolilo-3-masłowego i kwasu 4-chloroindoliIo-3-octowego Kwas indolilo-3-masłowy (IBA) jest naturalną auksyną występującą u wielu gatunków roślin [61]. Syntetaza IBA częściowo oczyszczona z siewek kukurydzy syntetyzuje IBA z IAA i acetylocoa w reakcji zależnej od ATP analogicznej do reakcji syntezy kwasów tłuszczow ych [62]. Dotychczasowe badania prowadzone na kukurydzy, grochu i A. thaliana, dotyczyły głównie wpływu tej auksyny na ukorzenianie się roślin [61]. W niedojrzałych nasionach grochu po raz pierw szy stwierdzono obecność kwasu 4-chloroindolilo-3-octowego (4-C1-IAA) powstającego przypuszczalnie z 4-chlorotryptofanu [8]. Obecnie w iadomo, że 4-C1-IAA występuje również u innych przedstaw icieli Fabaceae, a także u sosny [63]. III. Transport auksyn Auksyny syntetyzowane w rosnących tkankach (wierzchołki wzrostu, młode liście, pąki, kwiaty, owoce) są transportowane bazypetalnie, tj. w kierunku podstawy fizjologicznej pędu. Transport fitohormonu w korzeniu jest bardziej złożony, bowiem IAA przemieszcza się z pędu w kierunku wierzchołka wzrostu korzenia (akropetalnie) w tkankach walca osiowego, a z w ierzchołka korzenia do jego podstawy (bazypetalnie) w tkance epidermalnej [64, 65]. W roślinach dwuliściennych transport IAA z komórki do komórki (transport polarny) odbywa się poprzez tkankę parenchym atyczną otaczającą wiązkę przewodzącą, natomiast u roślin jednoliściennych w epidermie [64]. Przemieszczanie się auksyny w roślinie odbywa się również poprzez tkanki przewodzące. Transport taki charakteryzuje się kierunkiem i szybkością typowymi dla określonej tkanki, a więc w fotosyntetyżujących liściach IAA przemieszcza się floemem tak jak asymilaty, natomiast w ksylemie transportow any jest w strum ieniu transpiracyjnym [64]. Problem transportu auksyn z komórki do komórki oraz z miejsca syntezy do komórki lub tkanki docelowej j est interesuj ący nie tylko ze względu na sam mechanizm przemieszczania się auksyny, ale również dlatego, że dotyka on istoty pierw otnego m echanizmu funkcjonowania fitohorm onu. Auksyny klasyfikowane dotychczas jako klasyczne hormony roślinne, od kilku lat są uważane przez niektórych badaczy za jeden z roślinnych m orfogenów koordynujących procesy różnicow ania oraz wzrostu i rozwoju organizmu wielokomórkowego [3-5, 66]. W myśl tej koncepcji funkcja auksyn wiązana jest z rolą współzależnego sygnału zbierającego i porów nującego informacje pochodzące z wielu źródeł, a następnie przenoszącego przetworzoną informację do tkanki docelowej. Na gruncie tej koncepcji szuka się obecnie odpowiedzi na pytanie dlaczego przestrzenny gradient stężenia auksyn w roślinie prow a dzi do zróżnicowanych odpowiedzi, np. wzrostu wydłużeniowego w jednym miejscu, a podziałów mitotycznych czy różnicowania komórek w innym miejscu. Spośród prow adzonych obecnie badań na szczególną uwagę zasługują doświadczenia mające na celu poznanie roli auksyn w em briogenezie, zw łaszcza roli jak ą grają w przekazyw aniu informacji dotyczących przestrzennego położenia kom órek w zględem siebie. Wyniki niezw ykle interesujących doświadczeń prow adzą do wniosku, że transport auksyn pełni podstawową funkcję w powstawaniu i utrzymywaniu polarności komórki, w ustalaniu się dwubocznej symetrii organizm u we wczesnej em briogenezie [5, 67-69], a także w radialnej inicjacji pąków liściow ych [70]. Odrębny kierunek poszukiwań związany jest z poznaniem roli transportu auksyn w różnicowaniu się wiązek przewodzących i ustalaniu się ich wzorca w liściach [71-73]. Niektóre wyniki prowadzonych badań stały się podstawą do sformułowania hipotezy tzw. kanalizacji przepływu cząstek sygnałowych, według której pierwotny szlak transportu auksyn ( kanał przepływu auksyn ) powstający z sąsiadujących ze sobą spolaryzow a nych komórek, w wyniku ich różnicowania się przekształca się w wiązkę przewodzącą. Pierwotny szlak transportu auksyn odsysa auksyny z innych kom ó rek tworząc tzw. skanalizowany transport auksyn, który utrzymuje dotychczasową bądź indukuje nową polarność komórek [74, 75], Z ukierunkowanym transportem auksyn w iążą się również reakcje tro- 174 POSTĘPY BIOCHEMII 47(2), 2001 http://rcin.org.pl

piczne roślin, bowiem nierów nom ierne rozm ieszczenie auksyny w roślinie jest bezpośrednią przyczyną asymetrycznego wzrostu zw iązanego z oddziaływ a niem sił grawitacji lub ukierunkowanego oświetlenia [76-78]. O roli transportu auksyn w morfogenezie roślin świadczą wyniki doświadczeń, w których używano inhibitorów transportu IAA (fitotropin). Kwas nafty - loftalamowy (1-NPA) i trijodobenzoesowy (TIBA) znoszą reakcje tropiczne, redukują dom inację w ierzchołkową, hamują tworzenie pąków kwiatowych i tworzenie korzeni bocznych [79-83]. Poznanie m olekularnych m echanizm ów transportu auksyn, w tym również m echanizm ów regulujących szybkość i określających kierunek transportu, staje się obecnie w arunkiem dalszego postępu badań zmierzających do wyjaśnienia pierwotnego mechanizmu działania auksyn. Problem atyka transportu auksyn była szeroko prezentow ana w angielskojęzycznym artykule przeglądowym opublikowanym przed pięcioma laty [64], dlatego niniejszy rozdział poświęcony jest w zasadzie omówieniu osiągnięć ostatnich lat. Są one także przedstawione w pracach przeglądowych opublikow anych ostatnio w czasopismach o zasięgu ogólnoświatowym [4, 65, 76, 84, 85]. III-l. Nośniki transportujące auksyny W połowie łat 70-tych zaproponowano koncepcję wyjaśniającą polarny transport auksyn na gruncie teorii chemiosmotycznej [86] (Ryc. 5). W apoplaście, gdzie odczyn jest kwaśny (ph 5,5), kwas indolilo-3-octowy ze względu na w artość pk grupy karboksylowej występuje głównie w formie niezdysocjowanej i jako związek hydrofobowy stosunkowo dobrze dyfunduje przez błonę. Forma zdysocjowana IAA jest transportowana przez specyficzny nośnik na zasadzie symportu z protonami [87]. Wyższe ph wewnątrz kom órki sprzyja dysocjacji grupy karboksylowej i ustalaniu się równowagi, w której stężenie formy zdysocjowanej jest znacznie wyższe niż w apoplaście. Zdysocjowana auksyna transportowana jest z komórki do apoplastu przez inny nośnik na zasadzie elektrogenicznego uniportu [88]. Transport IAA do wewnątrz i na zewnątrz komórki jest więc zależny od generowanej na płazmolemie siły protonom otorycznej, której składowymi są różnica ph i gradient jonowy [89]. Energozależność transportu była potwierdzana wielokrotnie w doświadczeniach prowadzonych w warunkach beztlenowych, a także w sytuacji gdy hamowano oddychanie lub rozprzęgano syntezę ATP [90]. Transport auksyn cechuje wysoka specyficzność substratowa, a jego szybkość zależy od stężenia IAA osiągając wartość maksymalną w warunkach całkowitego w ysycenia białka nośnikowego auksyną. O obecności w płazmolemie dwóch rodzajów nośników transportujących auksyny do wewnątrz i na zewnątrz komórki świadczą wyniki badań, w których stosowano inhibitory transportu - kwas naftyloftalam ow y (NPA) i kwas trijodobenzoesowy (TIBA). NPA i TIBA hamują niekompetycyjnie transport auksyn z komórki, nie wpływając na transport fitohorm onu do komórki. Udział w transporcie auksyn dwóch różnych nośników potw ierdzają pośrednio badania, w których zastosowano syntetyczne auksyny kwas 2,4-dichlorofenoksyoctowy (2,4-D) i kwas naftylo-1-octow y (1-NAA) Ryc. 5. Schemat polarnego transportu IAA z zaznaczoną lokalizacją w błonie komórkowej nośników transportujących IAA POSTĘPY BIOCHEMII 47(2), 2001 http://rcin.org.pl 175

[91]. 2,4-D transportow any jest przez nośnik przenoszący auksynę do wnętrza komórki, podczas gdy 1-NAA, nie będąc rozpoznaw any przez białko nośnikowe, wchodzi do komórki tylko na zasadzie biernej dyfuzji. W transporcie 1-NAA z kom órki uczestniczy nośnik hamowany przez NPA i TIBA, natomiast 2,4-D jedynie dyfunduje przez błonę na zewnątrz komórki [91]. W oparciu o techniki wiązania znakow a nej azydo-auksyny próbowano identyfikować i oczyszczać białka nośnikowe transportujące IAA do wnętrza komórki [92,93]. W błonach plazmatycznych cukinii zidentyfikowano polipeptydy o masie cząsteczkowej 40 i 42 kda tworzące multimeryczne agregaty, jednakże nośnikowego charakteru tych białek nie udało się potw ierdzić [93]. Zdecydowany przełom w badaniach transporterów auksyn przyniosły doświadczenia prowadzone na mutantach A. thaliana wyselekcjonowanych na podstawie zmienionych odpowiedzi na egzogennie podawaną auksynę. W ten sposób znaleziono m utanta auxl (ang. auxin-resistant) charakteryzującego się znacznie obniżoną w rażliw ością na auksyny, brakiem wrażliwości na inhibitory transportu auksyn oraz etylen [79, 94]. Po sklonowaniu genu AUX1 okazało się, że koduje on białko zbudowane z 485 reszt aminokwasowyeh posiadające 10 lub 12 domen transbłonowych [95]. Białko AUX1 jest hom ologiczne z niektórymi permeazami transportującymi aminokwasy do wnętrza komórki na zasadzie symportu z protonam i [96]. Dotychczasow e przypuszczenia, iż to produkt genu AUX1 jest nośnikiem transportującym IAA z apoplastu do wnętrza kom órki potwierdziły wyniki badań, w których obserw o wano wpływ egzogennie podawanych auksyn (IAA, 1 -NAA i 2,4-D) na reakcje tropiczne korzeni mutanta auxl. Zaobserwowano, że jedynie 1-NAA, a więc auksyna wnikająca do komórki na zasadzie biernej dyfuzji przywraca reakcję grawitropiczną korzenia [97, 98]. Ekspresję genu AUX1 badano w korzeniu transgenicznych siew ek A. thaliana transform ow a nych konstruktem zawierającym gen reporterowy GUS i promotor genu AUX1. Wyniki doświadczeń pokazują, że ekspresja GUS w korzeniu zachodzi ze zróżnicow aną intensywnością, jednak wyraźnie w y ższą w merystemie wierzchołkowym i strefie wzrostu wydłużeniowego [98]. Białko nośnikowe transportujące IAA z komórki próbowano identyfikować na podstawie wiązania znakowanych izotopowo inhibitorów wypływu auksyn z komórki. Niekom petycyjny charakter ham ow a nia transportu przez NPA sugerował jednak, że miejsca wiążące auksynę i inhibitory transportu niekoniecznie muszą znajdować się na tym samym białku. Późniejsze badania potw ierdziły te wątpliwości i w y kazały, że miejsca wiążące IAA i NPA są położone na odrębnych białkach w ystępujących w bezpośrednim sąsiedztwie lub współtworzących kompleks transportujący auksynę [99-101]. Niektóre wyniki sugerują ponadto, że białko wiążące NPA, zlokalizowane powierzchniowo na wewnętrznej stronie błony komórkowej, oddziałuje z filamentami aktyny cytoszkiełetu [102, 103], Próby oczyszczania dowiodły jednak, że NPA wiązany jest przez integralne białko błonowe o masie 23 kda [104, 105]. Przeciwciała monoklonalne skierowane przeciw białku wiążącemu NPA są wiązane na błonie plazmatycznej tylko w bazalnej części komórek parenchymatycznych pędów grochu [106]. Do poznania białek nośnikow ych transportujących auksyny z komórki przyczyniło się dopiero wyselekcjonowanie mutantów A. thaliana, które charakteryzują się defektami w odpowiedzi grawitropicznej korzeni. M utant agrl (ang. agravitropic) nie wykazuje reakcji graw itropicznej, chociaż charakteryzuje się wyższą wrażliwością na 1-NAA i obniżoną w rażliw ością na ham ujące działanie inhibitorów polarnego transportu auksyn [107, 108]. Mutant e irl (ang. ethylene intensive root) został w yselekcjonowany na podstawie braku reakcji grawitropicznej oraz braku wrażliw ości na etylen i inhibitory transportu auksyn [109]. Kolejny mutant pin2 (ang. pin-formed) nie wykazuje reakcji grawitropicznej, a ponadto posiada szereg widocznych defektów m orfologicznych korzenia [ 110]. Po sklonowaniu zm utowanych genów okazało się, że wszystkie trzy m utacje dotyczą tego samego genu. Produktem genu AGR1/EIR1/PIN2 jest białko o masie cząsteczkowej 69 kda posiadające w części N- i C-końcowej po 5 fragmentów transbłonowych przedzielonych 350 aminokwasowym fragmentem hydrofilowym (Ryc. 6). Białko wykazuje znaczącą hom ologię z bakteryjnymi transporterami, takimi jak poznany u E. coli transporter leucyny, czy białko arsb będące nośnikiem transportującym z komórki arsen. Ekspresja genu AGR1 /EIR1 /PIN 2 ograniczona jest tylko do korzenia, z wyraźnie wyższą intensywnością w strefie wzrostu elongacyjnego [107, 110]. Metodami immunochemicznymi wykazano ponadto, że białko At- PIN2 jest zlokalizowane w plazmolemie w bazalnej części komórek kory i epidermy położonych w strefie m erystem atycznej i elongacyjnej korzenia [ 110]. Poznanie m utanta p in l (ang. pin-form ed) A. thaliana przyczyniło się do zidentyfikowania nośnika transportującego IAA w kom órkach nadziemnej części rośliny [82]. M utant pin charakteryzuje się w ieloma defektam i w budowie kwiatów, kwiatostanów i 176 http://rcin.org.pl POSTĘPY BIOCHEMII 47(2), 2001

liści, przypominając osobniki rosnące w obecności inhibitorów transportu auksyn. Sklonowany gen At- PIN1 koduje białko o masie cząsteczkowej 67 kda, którego sekwencja am inokw asow a jest hom ologiczzmów regulujących wypływ auksyny z komórki. Pojedyncze doniesienia sugerują, że regulacja odbywa się na drodze fosforylacji i defosforylacji białka nośnikowego lub białka regulatorowego [115]. Garb ło n a k o m ó rk o w a c y to p la z m a 647 COOH Ryc. 6. Schemat budowy białka nośnikowego AGR1/ EIR1/PIN2 transportującego IAA z komórki (wg [107-110], zmodyfikowane) na z AGR1/EIR1/PIN2 [111]. Stosując przeciwciała poliklonalne skierowane przeciw fragmentowi zrekombinowanego białka A tpin l ustalono, że białko zlokalizowane jest w plazmolemie w bazalnej części komórek parenchym atycznych ksylem u. W asym e trycznym rozm ieszczaniu nośników transportujących IAA w obrębie kom órki uczestniczy pęcherzykowy układ sortowania i transportu białek [112]. Potwierdzają to wyniki bardzo interesujących badań, w których próbowano lokalizować białko PINI w komórkach mutantów mp (ang. monopteros) i gn (ang. gnom ) A. thaliana charakteryzujących się defektami w ustalaniu się osi apikalno-bazalnej kom ó rek. Badacze jednoznacznie wykazali, że rozm ieszczenie białka PINI u mutanta gn jest przypadkowe i nie wykazuje polarnej orientacji w odróżnieniu od asymetrycznego rozmieszczenia PINI w komórkach rośliny dzikiej lub mutanta mp [112]. Gen M P koduje czynnik transkrypcyjny wiążący się ze specyficzną sekwencją DNA tzw. elementem odpowiedzi auksynowej (Aux RE) [2, 113], natomiast gen GA koduje białko homologiczne z drożdżowymi białkami Gealp i Gea2p należącymi do rodziny białek ARF GEF (ang. guanine-nucleotide exchange fa cto r on AD P-rybosylation fa c to r) [114]. Białka ARF z rodziny małych białek wiążących GTP funkcjonują w transporcie pęcherzyków między siateczką śródplazmatyczną i aparatem Golgiego, a także w obrębie samego aparatu Golgiego. Tak więc wyniki tych badań wyraźnie sugerują, że układ transportu makromolekuł za pośrednictwem pęcherzyków opłaszczonych uczestniczy w polarnym rozmieszczeniu białek nośnikowych wewnątrz kom órki. Nadal bez odpowiedzi pozostają pytania o sposób regulacji transportu auksyn, mimo że wyniki badań białka wiążącego NPA dow odzą istnienia mechani- http://rcin.org.pl bers i wsp. [116] wyselekcjonowali mutanta rcnl (ang. roots curl in NPA) A. thaliana, u którego transport auksyn z komórki jest wyjątkowo wrażliwy na NPA. Sklonowany gen RCN1 koduje podjednostkę regulatorową A fosfatazy białkowej 2A (PP2A), co mogłoby potwierdzać funkcjonowanie mechanizmu regulacyjnego opartego na reakcjach fosforylacji i defosforylacji nośnika. IV. Odwracalna i nieodwracalna inaktywacja fitohormonu IV-1. Synteza i hydroliza koniugatów auksyn W szystkie znane naturalne auksyny występują w roślinach w formie fizjologicznie aktywnego w olnego kwasu oraz w połączeniach z innymi związkami jako tzw. koniugaty. Reakcje syntezy koniugatów polegają na utworzeniu w iązania kowalencyjnego m iędzy grupą karboksylow ą auksyny a grupą hydroksylową cukrów i inozytolu (koniugaty estrowe) lub wolnych aminokwasów, peptydów i białek (koniugaty amidowe) [8-13, 117]. Możliwość hydrolitycznego rozszczepiania takich połączeń sugeruje, że koniugaty pełnią funkcję zapasowego źródła fitohormonu, z którego stopniowo w miarę potrzeby uwalniana jest aktywna auksyna [118]. W myśl tej koncepcji reakcje syntezy koniugatów prowadzą jedynie do czasowej, odwracalnej inaktywacji fitohormonu. W iększość dotychczasow ych wyników potw ierdza główne założenia koncepcji wiążącej syntezę i hydrolizę koniugatów z utrzymaniem homeostazy hormonalnej w roślinie. Tak w idzianą rolę koniugatów auksyn potw ierdzają wyniki badań prow adzonych na tytoniu transformowanym genami iaam i iaah Agrobacterium tumefaciens [119, 120]. U zy POSTĘPY BIOCHEMII 47(2), 2001 177

skane rośliny transgeniczne m ają podniesiony poziom wolnego IAA i zdecydowanie wyższy poziom koniugatów IAA, szczególnie połączeń amidowych. Stosunek ilościowy wolnego IAA do jego koniugatów jest zróżnicowany w zależności od tkanki, co może sugerować, że synteza lub transport koniugatów podlega specyficznej regulacji w obrębie tkanki. Znaczący wzrost stężenia koniugatów obserwowano również u wspomnianego wcześniej mutanta su rl A. thaliana charakteryzującego się nadprodukcją IAA [31, 121]. Protoplasty z liści tytoniu i fragm enty tkanek A. thaliana inkubowane w środow isku zaw ierającym wolne auksyny gromadzą hormon i niemal natychmiast zaczynają syntetyzować połączenia z glukozą, kwasem asparaginowym i glutaminowym [122-124]. Przytoczone wyniki badań sugerują więc, że synteza koniugatów pom aga w utrzym aniu optymalnego dla danej tkanki stężenia wolnej auksyny. Powyższa koncepcj a nie j est j ednak j edyną propozycją odnośnie roli koniugatów auksyn w roślinie. Wszystkie znane połączenia auksyn są związkami hydrofitowymi, łatwiej rozpuszczalnymi w wodzie niż wolny IAA i dlatego mogą być formą fitohormonu sprawniej transportow aną przez tkanki przewodzące [125, 126]. Sztein i wsp. [127] badali możliwość syntezy koniugatów IAA u ponad 20 gatunków roślin z różnych grup taksonomicznych, od glonów poprzez m szaki, paprotniki do roślin okrytonasiennych. Syntezę koniugatów IAA obserwowano dopiero u mszaków, a więc przedstawicieli tej grupy systematycznej roślin, u której pojaw iają się pierw sze komórki wyspecjalizowane w transporcie wody. W dyskusjach na temat roli koniugatów auksyn nie można również pom ijać potwierdzanej dośw iadczalnie odporności koniugatów na utleniające działanie roślinnych peroksydaz [118, 128]. Ponadto wyniki niektórych badań sugerują, że np. IA-asparaginian jest związkiem pośrednim w procesie nieodw racalnej degradacji IAA [124]. Synteza koniugatów może być też pierwszym etapem szlaku detoksykacji nadmiaru IAA, który poprzez połączenia z glutationem prowadzi do kompartmentacji koniugatów IAA wewnątrz kom órki [9, 129]. IV-1.1. K oniugaty estrowe M etabolizm koniugatów estrowych poznano stosunkowo dobrze jedynie w dojrzewających nasionach i młodych siewkach kukurydzy roślinie, w której połączenia tego typu w ystępują w zdecydow a nej przewadze w porównaniu z innymi rodzajami koniugatów IAA [117]. Szczególnie bogatym źródłem połączeń estrowych jest bielm o niedojrzałych nasion kukurydzy. Ponad 50% całkowitej ilości koniugatów występuje tu w postaci nierozpuszczalnych w w o dzie celulozowych J3-l,4-glukanów, które zawierają jedną resztę IAA na 7 50 reszt glukozy [8]. Około 15% stanowią połączenia estrowe z myo-inozytolem, a ponad 30% całkowitej ilości koniugatów to związki, które oprócz inozytolu zaw ierają dodatkowo galaktozę lub arabinozę [130]. Proste estry IAA z my o-inozytolem w ystępują w form ie dwóch izom e rów konformacyjnych oraz połączeń myo-inozytolu z dwiema lub trzema resztami IAA [ 131 ]. W bielmie kukurydzy stw ierdzono ponadto śladowe ilości estrów kwasu indolilo-3-octowego z glukozą. Estrowe połączenia auksyn wykryto także w wegetatywnych tkankach kukurydzy [132,133], nasionach ryżu [134], owocach pom idora [135] oraz w tkankach kilku innych roślin [8, 117, 127, 136]. W nasionach owsa praw ie 95% IAA występuje w postaci koniugatów estrowych, głównie w formie połączeń IAA z glikoproteinam i [137]. Pierwszym etapem biosyntezy połączeń estrowych jest odwracalna reakcja prow adząca do powstania l-0-(indolilo-3-acetylo)- 3-D-glukozy (1-0-IA -glukoza) zgodnie z równaniem: UDP-glukoza + IAA 1-O-IA-glukoza + UDP Syntaza 1-O-IA-glukozy katalizująca powyższą reakcję, zidentyfikowana po raz pierwszy przez M i - chalczuka i wsp. [138, 139], została oczyszczona do stopnia homogenności [140, 141], a uzyskane przeciwciała umożliwiły sklonowanie genu iaglu [142]. Powstająca w reakcji 1-O-IA-glukoza zawiera wiązanie alkiloacylowe, które w środowisku w odnym jest połączeniem bardzo nietrwałym. W ph alkalicznym 1 -O-IA-glukoza łatwo ulega izomeryzacji dając połączenia estrowe, w których reszta IAA związana jest z węglem 2, 4 i 6 glukozy [143]. 1-O-IA-glukoza jest związkiem pośrednim w syntezie IA-rayo-inozytolu pow stającym zgodnie z rów naniem reakcji [139]: 1-O-IA-glukoza + m yoinozytol» IA-inozytol + glukoza Transferazę katalizującą przeniesienie reszty IAA z glukozy na myo-inozytol izolowano i częściowo oczyszczono z bielm a niedojrzałych nasion kukurydzy [144]. Poznawaniu enzymów uczestniczących w syntezie połączeń estrowych towarzyszą poszukiwania hydrolaz uw alniających wolne auksyny z poszczególnych koniugatów. W bielmie nasion kukurydzy, w kiełkach kukurydzy, owsa, fasoli, kapusty pekińskiej oraz w bulwach ziem niaka stw ierdzono obecność lub 178 http://rcin.org.pl POSTĘPY BIOCHEMII 47(2), 2001

częściowo oczyszczono hydrolazy uwalniające IAA zpołączeń z glukozą lub inozytolem [143, 145-147]. IV-1.2. Koniugaty am idow e Mimo że koniugaty amidowe są połączeniam i powszechnie występującym i w roślinach, to ich m etabolizm jest prawie w ogóle nieznany. Nie udało się przeprowadzić reakcji syntezy koniugatów am idowych in vitro, a w związku z tym nie jest znana reakcja prowadząca do utworzenia wiązania amidowego między IAA i aminokwasem. Najwięcej doniesień na temat występowania koniugatów amidowych dotyczy indolilo-3-acetyloasparaginianu (IA-Asp), którego metabolizm badano w nasionach soi [148], w hodowanych in vitro komórkach marchwi [149], owocach pom idora [135], a jego obecność stw ierdzono w wielu gatunkach roślin [13, 117, 127]. Innym połączeniem amidowym, zwykle tow a rzyszącym IA-Asp, jest indolilo-3-acetyloglutam inian (IA-Glu). Syntezę IA-Glu badano w nasionach soi [150], siewkach A. thaliana [123, 124, 136], ale obecność tego koniugatu potw ierdzono w tkankach wielu roślin [13, 117, 120, 127]. IAA może także tworzyć połączenia typu amidowego z innymi aminokwasami oraz peptydami. W nasionach fasoli 80% całkowitej ilości IAA występuje w postaci koniugatów z peptydami o masie cząsteczkowej 3-25 kda [151]. Obecnie nieco więcej wiadomo na tem at enzymów hydrolizujących amidowe połączenia IAA, chociaż i w tym przypadku są to zwykle pojedyncze doniesienia [147, 152]. Bartel i Fink [153] sklonowali gen ILR1 A. thaliana kodujący białko enzymatyczne, którego sekwencja aminokwasowa jest homologiczna z bakteryjnymi amidohydrolazami. Enzym hydrolizuje IA-leucynę i IA-fenyloalaninę oraz w m niejszym stopniu koniugaty innych am inokwasów. W ostatnim czasie sklonowano gen IAR3 A. thaliana, którego produkt wybiórczo hydrolizuje IA-alaninę i słabiej IA-glicynę [154]. IV-2. Degradacja IAA Utlenianie IAA prowadzące do nieodwracalnej inaktywacji fitohorm onu obniża jego poziom w w arunkach zbyt wysokiego stężenia aktywnej auksyny w komórce. Ponadto przypuszcza się, że nieodw racalna degradacja auksyny tow arzyszy każdem u zw iązaniu cząsteczki fitohormonu z receptorem i aktywacji szlaku transdukcji sygnału. Wiadomo, że wzrost wydłużeniowy komórek odbywa się tylko w warunkach ciągłego dopływu auksyny, o czym św iadczą doświadczenia z odcinaniem wierzchołka pędu rośliny prowadzące do zatrzym ania wzrostu. Dotychczasowe wyniki badań sugerują, że w zależności od rośliny, a być może również rodzaju tkanki, IAA może być degradowany w szlaku rozpoczynającym się od oksydacyjnej dekarboksylacji bądź w szlaku, w którym ulega on utlenieniu w pozycji 2 lub 3 pierścienia indolowego (Ryc. 7). Dekarboksylacja IAA może zachodzić w reakcji zależnej od H20 2 katalizowanej przez peroksydazy lub w reakcji katalizowanej przez specyficzną roślinną peroksydazę w obecności 0 2 [155]. Interesujące jest podobieństwo sekwencji aminokwasowej fragmentów niektórych roślinnych peroksydaz z białkiem ABPI (ang. auxin binding protein) wiążącym auksyny i pełniącym przypuszczalnie funkcję receptora fitohormonu [2, 155]. Produktem oksydacyjnej dekarboksylacji jest indolilo-3-m etanol (IM) ulegający dalej przekształceniom do indolilo-3-aldehydu (IAld) i kwasu indolilo-3-karboksylow ego [156-158] (Ryc. 7). Produktami oksydacyjnej dekarboksylacji IAA są ponadto: 3-hydroksymetylo-oksyindol i 3-metylenooksyindol [8, 11, 13, 159]. Reakcje degradacji IAA polegające na utlenianiu pierścienia indolowego badano w kukurydzy i nasionach sosny [11, 13, 160, 161]. Produktami tych przemian są między innymi: kwas 2-oksyindolilo-3-octowy i kwas 7-hydroksy-2- -oksyindolilo-3-octow y oraz jego pochodna glukozowa kwas 7-(0-P-glukozylo)-2-oksyindolilo-3- octowy. V. Podsumowanie Badania związane z problem atyką homeostazy hormonalnej w roślinie dotykają ważnych zagadnień dotyczących regulacji stężenia aktywnego fitohormonu w komórce. W przypadku auksyn poziom wolnego hormonu w komórce zależy od procesów biosyntezy, transportu, reakcji syntezy i hydrolizy koniugatów oraz reakcji prowadzących do nieodw racalnej degradacji fitohormonu. Przedstawione w niniejszej pracy wyniki badań dowodzą, iż w roślinach funkcjonuje kilka szlaków biosyntezy auksyn. N iektóre z tych szlaków rozpoczynają się od tryptofanu, inne natomiast od jego prekursorów takich jak indolilo-3-glicerolofosforan czy indol (Ryc. 8). N iektórzy autorzy sugerują, że zależna od tryptofanu biosynteza kwasu indolilo-3-octowego ma miejsce głównie we wczesnej embriogenezie oraz w fazie kiełkowania nasion, podczas gdy w późnej em briogenezie i w okresie wzrostu wegetatywnego fitohormon syntetyzowany jest w szlaku niezależnym od tryptofanu. Niski poziom wbudow ywania znakowa- POSTĘPY BIOCHEMII 47(2), 2001 http://rcin.org.pl 179

COOH kwas indoliio-3-octowy (IAA) indolilo-3-aldehyd (IAld) CTf, O 3 -m etylenooksyindol C O O H kwas 7 -hydroksyoksyindolilo -3 -octow y, C O O H kwas indolilo-3-karboksylow y (ICA ) kw as 7 -(0-3 -glukozylo )-oksyindolilo -3 -octow y Ryc. 7. P ro d u k ty u tle n ia n ia IA A (w g [8 ], z m o d y f ik o w a n e ) nego tryptofanu do IAA próbowano tłum aczyć koniecznością przekształcenia L-tryptofanu do D-tryptofanu, który miałby być właściwym prekursorem hormonu. Sugestie te jednak nie zyskały eksperymentalnego potw ierdzenia, natom iast szereg w yników może świadczyć o w ystępow aniu w komórce m utantów auksynowych A. thaliana brakuje m utantów auksotroficznych, co m ożna również interpretować jako potw ierdzenie funkcjonowania wielu różnorodnych szlaków biosyntezy IAA. Sklonowanie białek nośnikow ych transportujących IAA do wnętrza i na zewnątrz komórki sta- Antranilan Procesy wzrostu i rozwoju Y Indol \ Biosynteza niezależna od tryptofanu Tryptofan / Biosynteza zależna od tryptofanu > - Transport Katabolizm Koniugaty estrowe i amidowe Przechowywanie i ochrona przed degradacją / > - Transport Ryc. 8. Proponowane zależności między procesami prowadzącymi do wzrostu stężenia IAA w komórce a procesami, których efektem jest spadek poziomu wolnego hormonu w komórce odrębnych pul tryptofanu, spośród których tylko niektóre są dostępne dla enzymów uczestniczących w biosyntezie auksyny. W śród dużej liczby różnych nowi niewątpliwy postęp w badaniach transportu auksyn. D otychczasowe sugestie dotyczące polarnego rozm ieszczenia transporterów auksyn w kom órce 180 POSTĘPY BIOCHEMII 47(2), 2001 http://rcin.org.pl

uzyskały ostatecznie eksperym entalne potw ierdzenie. Nadal jednak niewiele wiemy na temat mechanizmu regulującego transport IAA, który jak wiadomo zmienia się w cyklu życiowym rośliny. Zmiany te są podporządkowane program owi rozw ojow em u rośliny, a z drugiej strony podlegają kontroli przez czynniki zewnętrzne takie jak światło czy siły grawitacji. Wyniki szeregu badań potwierdzają udział białka wiążącego NP A w m echanizm ie regulacji transportu, chociaż jego rola w tym procesie jest ciągle niejasna. Konieczne są także badania, które m ogłyby potwierdzić udział endogennych związków z grupy flawonoidów w regulacji transportu auksyn. Nadal najwięcej wątpliwości i pytań wiąże się z syntezą i hydrolizą koniugatów auksynowych. M nogość i różnorodność tych połączeń utrudnia badanie ich biosyntezy, a przez to ogranicza także możliwość określenia, które z tych związków są ważnymi połączeniam i, a które tylko pow stającym i niespecyficznie wtórnymi m etabolitam i. Podobne w ątpliw o ści mogą się rodzić w związku z niską specyficznością hydrolaz, których rola m iałaby polegać na uruchamianiu zapasowego źródła auksyn. Nie wiadomo też dlaczego w kiełkujących nasionach fasoli zachodzi biosynteza IAA, mimo że zapas zgromadzonych koniugatów nie uległ całkowitej hydrolizie [17]. Tak więc na obecnym etapie badań nie można także wykluczyć możliwości, że poszczególne koniugaty spełniają różne funkcje w metabolizmie, transporcie, a także wykazują aktywność hormonalną. M ogą to potwierdzać obserwacje dotyczące syntezy IA-Asp oraz jego przem ian, które jak się obecnie przypuszcza prowadzą do nieodwracalnej inaktywacji IAA. Również połączenia IAA z peptydami nie pełnią przypuszczalnie funkcji zapasowego źródła wolnego hormonu. Niezbyt liczne jak dotychczas badania katabolizmu IAA pokazały, że zarów no liczba jak też różnorodność produktów utleniania jest nadspodziewanie duża. Wyniki wielu z tych badań należy jednak interpretować z pew ną rezerwą, bowiem reakcje utleniania IAA badane w skrawkach tkanek lub ekstraktach niekoniecznie muszą dawać produkty identyczne z tymi, które powstają in viv o. Nie wiadomo również czy utlenianie IAA ma prowadzić j edynie do jego degradacji czy też wiąże się z funkcjonowaniem fitohormonu np. w promowaniu wzrostu elongacyjnego, zapobiegając ponownemu wykorzystaniu cząsteczki IAA. Mechanizmy regulujące poziom auksyn zapewne nie są proste, bowiem m uszą obejmować szereg procesów prowadzących do wzrostu stężenia hormonu jak też szereg dróg odw racalnego lub nieodw racalnego obniżenia jego poziomu w komórce. Regulacja tych procesów musi mieć charakter dynamiczny i powinna być kontrolowana przez bodźce środowiska zewnętrznego takie jak światło czy temperatura oraz przez sygnały wew nątrzkom órkowe związane z programem m orfogenezy danego organizmu. Piśmiennictwo A rtyku ł otrzym ano 9 października 2000 r. Zaakceptow ano do druku 5 kw ietnia 2001 r. 1. Jakubowska A, Murach AP, Kowalczyk S (1996) E W Biol Kom 23: 657-682 2. Zielińska E, Kowalczyk S (2000) Post Biol Kom 27: 155-183 3. Zajączkowski S, Wodzicki TJ, Romberger J A (1984) W:Pirson A, Zimmermann MH (red) Encyclopedia o f Plant Physiology, t. 10. Springer-Verlag Berlin Heidelberg, New York, Tokyo, str. 244-262 4. Palme K, Galweiler L (1999) Curr Opin Plant Biol 2: 375-381 5. SouterM, Lindsey K (2000) J Exp Bot 51: 971-983 6. Costacurta A, V an de r 1e y d e n J (1995) Crit Rev Microbiol 2 1 : 1-18 7. Jankiewicz L S (1997)W: Jankiewicz LS(red) Regulatory wzrostu i rozwoju roślin. Właściwości i działanie. PWN Warszawa, str. 17-40 8. Bandurski RS, Cohen JD, Slovin JP, Reinecke DM (1995) W: Davies PJ (red) Plant Hormones. Kluwer Academic Publishers, Netherlands, str. 39-65 9. Nor manly J, Slovin JP, Cohen JD (1995) Plant Physiol 107: 323-329 10. Bartel B (1997) Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 48: 51-66 11.Normanly J (1997) Physiol Plant 100: 431-442 12. Normanly J, Bartel B (1999) Curr Opin Plant Biol 2:207-213 13. Slovin JP, Bandurski RS, Cohen J D (1999) W: Hooykaas PJJ, Hall MA, Libbenga KR (red) Biochemistry and Molecular Biology o f Plant Hormones, Elsevier Science BV, str. 115-140 14. Non hebel HM, Cooney TP, Simpson R (1993) Aust J Plant Physiol 20: 527-539 15.Glawischnig E, Tomas A, Eisenreich W, Spiteller P, Bacher A, Gierl A(2000) Plant Physiol 123: 1109-1119 16. Koshiba T, Kamiya Y, lino M (1995) Plant Cell Physiol 36: 1503-1510 17. Białek J, Michalczuk L, Cohen JD (1992) Plant Physiol 100: 509-517 18. Mii 11 e r A, Hillebrand H, Weiler E W (1998) Planta 206: 362-369 19. Truelsen TA (1973) Physiol Plant 28: 67-70 20. Koga J, Syęno K, Ichikawa T, Adachi T (1994)Biochim Biophys Acta 1209: 241-247 21.Moore TC, Shaner CA (1968) Arch Biochem Biophys 127: 613-621 22. Gibson RA, Schneider EA, Wightman F (1972) J Exp Bot 23: 381-399 23. Purves WK, Brown H M (1918) Plant Physiol 61:104-106 24. K o g a J (1995) Biochim Biophys Acta 1249: 1-13 25. Miyata S, Suzuki Y, Kamisaka S, Masuda Y(1981) Physiol Plant 51: 402-406 26. Koshiba T, Saito E, Ono N, Yamamoto N, Sató M (1996) Plant Physiol 110: 781-789 27.Tsurusaki K, Takeda K, Sakurai N (1997) Plant Cell Physiol 38: 268-273 28. Sekimoto H, Seo M, Kawakami N, Komano T, Dseloire S, Liotenberg S, Marion-Poll A, Caboche M, Kamiya T, Koshiba T(1998) Plant Cell Physiol 39:433-442 POSTĘPY BIOCHEMII 47(2), 2001 http://rcin.org.pl 181

29. Seo M, Akaba S, Oritani T, Delarue M, Bellini C, CabocheM, Koshiba T (1998) Plant Physiol 116: 687-693 30. Celenza JL, Grisafi PL, Fink G G R (1995) Genes Dev 9: 2131-2142 31.Boerjan W, Cervera M T, Delarue M, Beeckman T, Dewitte W, Bellini C, Caboche M, Van Onckelen H, Van Montagu M, Inze D (1995) Plant Cell 7: 1405-1419 32. King J J, Stimart DP, Fisher RH, Bleecker AB (1995) Plant Cell 7: 2023-2037 33. Lehman A, Black R, Ecker JR(1996) Ce//85: 183-194 34. Gopalraj M, Tseng T S, Olszewski N (1996) Plant Physiol 111S: 114 35. Ludwig-Müller J, HilgrnbergW (1988) Physiol Plant 74: 240-250 36. HelmlingerJ, Rausch T, Hilgenberg W (\9&1) Phytochemistry 26: 615-618 37. Rajagopal R, Larsen P (1972) Planta 103: 45-54 38. HelmlingerJ, Rausch T, Hilgenberg W (1985) Phytochemistry 24: 2497-2502 39. Ludwig-Müller J, Hilgenberg W (1990) Physiol Plant 79: 311-318 40. Bartling D, SeedorfM, Schmidt RC, Weiler EW (1994) Proc Natl Acad Sci USA 91: 6021-6025 41.Bartel B, Fink GR (1994) Proc Natl Acad Sci USA 91: 6649-6653 42. Hillebrand H, Bartling D, Weiler EW (1998) Plant Mol Biol 36: 89-99 43. SchmidtRC, MullerA, HainR, Bartling D, Weiler E W (1996) Plant J 9: 683-691 44. Normanly J, Grisafi P, Fink GR, Bartel B (1997) Plant Cell 9: 1781-1790 45. Grsic S, Sauerteig S, Neuhaus K, Albrecht M, Rossiter J, Ludiwig-Müller J (1998) J Plant Physiol 153: 446-456 46. Searle LM, Chamberlain K, Rausch T, ButchcrDN (1982) J Exp Bot 33: 935-942 47. Kobayashi M, Suzuki T, Fujita T, Masuda M, Shimizu S (1995) Proc Natl Acad Sci USA 92: 714-718 48. Noe W, Mollenschott C, Berlin J (1984) Plant Mol Biol 3: 281-288 49. DeLuca V, Marineau C, Brisson N (1989) Proc Natl Acad Sci USA 86: 2582-2586 50. M cg ow an RE, M uir RM (1971) Plant Physiol 47: 644-64851. 51.Kawaguchi M, Kobayashi M, Sakurai A, S y 9 n o K (1991) Plant Cell Physiol 32: 143-149 52. Saotome M, Shirahata K, Nishimura R, Yahaba M, Kawaguchi M, S y n o K, Kitsuwa T, Ishii Y, Nakamura T (1993) Plant Cell Physiol 34: 157-159 53. Baldi BG, MaherBR, Slovin JP, Cohen JD (1991) Plant Physiol 95: 1203-1208 54. Wright AD, Sampson MB, Neuffer MG, Michalczuk L, Slovin JP, Cohen JD (\99\) Science 254: 998-1000 55. Rapparini F, Cohen JD, Slovin J (1999) Plant Growth Reg 27:139-144 56. Normanly J, Cohen JD, Fink G R(1993) Proc Natl Acad Sci USA 90: 10355-10359 57.RekoslavskayaNI, Bandurski R S (1 994)Phytochemistry 35: 905-909 58.1 lie N, Ostin A, Cohen ID (1991) Plant Physiol 1145: 157 59. Östin A, I lie N, Cohen JD (1999) Pant Physiol 119:173-178 60. Michalczuk L, Ribnicky DM, Cooke TJ, Cohen JD (1992) Plant Physiol 100: 1346-1353 61.Epstein E, Ludwig-Müller J (1993) Physiol Plant 88: 382-389 62. Ludwig-Müller J, Hilgenberg W (1995) Physiol Plant 94: 651-660 63. Magnus V, Ozga JA, Reinecke DM, Pierson GL, La Rue TA, Cohen JD, Brenner ML (1997) Phytochemistry 46: 675-681 64. Lomax TL, Muday GK, Rubery P H (1 995) W: Davies P J (red) Plant Hormones. Kluwer Academic Publishers, Netherlands, str. 509-530 65. L e y s e r O (1999) Curr Biol 9: R8-R10 66. Sabatini S, Beis D, Wolkenfelt H, Murfett J, Guilf oyle T, Malamy J, Benfey P, Leyser O, Bechtold N, Weisbeek P, Scheres B (1999) Cell 99: 463-472 67. Liu C M, Xu Z H, Chua N H (1993) Plant Cell 5: 621-630 68. Fischer C, Neuhaus G (1996) Plant J 9: 659-669 69. Hadfi K, Speth V, Neuhaus G (1998) Development 125: 879-887 70. Reinhardt D, Mandel T, Kuhlemeier C (2000) Plant Cell 12: 507-518 71.Nelson T, Dengler N (1997) Plant Cell 9: 1121-1135 72. Sieburth LE (1999) Plant Physiol 121: 1179-1190 73.Mattsson J, Sung ZR, Bcrleth T (1999) Development 126: 2979-2991 74. S a c h s T (1991) Development Suppl. 1: 83-93 75. Scheres B, Berleth T (1998) Curr Opin Plant Biol 1: 32-36 76. D o 1a n L (1998) Genes Dev 12: 2091-2095 77. Chen R, Rosen E, Masson PH (1999) Plant Physiol 120: 343-350 78. Rosen E, Chen R, Masson PH (1999) Trends Plant Sci 4: 407-412 79. F u j i ta H, S y 0 n o K(1996)Plant Cell Physiol 37: 1094-1101 80. C 1i n e M G (1994) Physiol Plant 90: 230-237 81. Reed RC, Brady SR, Muday G K (1998)PlantPhysiol 118: 1369-1378 82. OkadaK, UedaJ, KomakiMK, BellC J, ShimuraY (1991) Plant Cell 3: 677-684 83.Rashotte AM, Brady SR, Reed RC, Ante SJ, Muday G K (2000) Plant Physiol 122: 481-490 84. H o b b i e L J (1998) Plant Physiol Biochem 36: 91-102 85. Luschnig C, Fink GR(1999) Trends Plant Sci 4: 162-164 86. Rubery PH, Sheldrake A R (1974)Planta 118: 101-121 87. S abater M, Rubery PH (1987) Planta 171: 507-513 88. Szponarski W, Guibal O, Espuna M, Doumas P, Ros signol M, Gibrat R (1999) FEBS Lett 446: 153-156 89. Lomax TL, Mehlhorn RJ, Briggs W R (1985) Proc Natl Acad Sci USA 82: 6541-6545 90. Hertel R, Lomax TL, Briggs WR (1983) Planta 157: 193-201 91.Delbarre A, Muller P, ImhoffV, Guern J (1996) Planta 198: 532-541 92. Hicks GR, Rayle DL, Jones AM, Lomax TL (1989) Proc Natl Acad Sci USA 86: 4948-4952 93. Hicks GR, Rice MS, Lomax TL(1993) Planta 189: 83-90 94. Pickett FB, Wilson AK, Estelle M (1990) Plant Physiol 94: 1462-1466 95. Bennett MJ, Marchant A, Green HG, May ST, Ward S P, M i 11 n e r PA, Wa IkerAR, Schulz B, FeldmannK A (1996) Science 273: 948-950 96. Young GB, Jack DL, Smith DW, Saier MH (1999) Biochim Biophys Acta 1415: 306-322 97.Yamamoto M, Yamamoto KT(1998) Plant Cell Physiol 39: 660-664 98. Marchant A, Kargul J, May ST, Muller P, Delbarre A, Perrot-Rechenmann C, Bennett M 1(1999) EMBO J 18: 2066-2073 99. Morris DA, Rubery PH, Jarman J, Sabater M (1991)./ Exp Bot 42: 773-783 100. Muday GK, Brunn SA, Haworth P, Subramanian M (1993) Plant Physiol 103: 449-456 101.Wilkinson S, Morris DA (1994) Planta 193: 194-202 102. Cox DN, Muday GK (1994) Plant Cell 6: 1941-1953 103. Butler JH, Hu S, Brady SR, Dixon MW, Muday GK (1998) Plant J 13: 291-301 104. Zettl R, Feldwisch J, Boland W, Schell J, Palme K (1992) Proc Natl Acad Sci USA 89: 480-484 105. Bernasconi P, Patel BC, Reagan JD, Subramanian M V (1996) Plant Physiol 111: 427-432 106. Jacobs M, Gilbert SF (1983) Science 220: 1297-1300 107. Chen R, Hilson P, Sedbrook J, Rosen E, Caspar T, Masson PH (1998) Proc Natl Acad Sci USA 95:15112-15117 182 POSTĘPY BIOCHEMII 47(2), 2001 http://rcin.org.pl

108. Utsuno K, Shikanai T, Yamada Y, Hashimoto T (1998) Plant Cell Physiol 39: 1111-1118 109. Luschnig C, Gaxiola RA, Grisafi P, Fink GR(1998) Genes Dev 12: 2175-2187 110. Müller A, Guan C, GälweilerL, TänzlerP, Huijser P, Marchant A, Parry G, Bennett M, Wisman E, Pal me K (1998) EMBO J 17: 6903-6911 111. Gälweiler L, Guan C, Müller A, Wisman E, Mendgen K, Yephremov A, Palme K (1998) Science 282: 2226-2230 112. Steinmann T, Geldner N, Grebe M, Mangold S, Jackson CL, Paris S, Gälweiler L, Palme K, Jürgen s G (1999) Science 286: 316-318 113. Hardtke CS, Berleth T (1998) M 50717: 1405-1411 114. Peyroche A, Paris S, Jackson C L (1996) Nature 384: 479-481 115. Bernasconi P (1996) Physiol Plant 96: 205-210 116. Garbers C, DeLong A, Deruére J, Bernasconi P, Sö 11 D (1996) E M B O J15: 2115-2124 117. Cohen JD, Bandurski RS (1982)Ann Rev Plant Physiol 33: 403-430 118. H angarter RP, Good NE (1981) Plant Physiol 68: 1424-1427 119. Sitbon F, Sundberg B, Olsson O, Sandberg G(1991) Plant Physiol 95: 480-485 120. Sitbon F, Östin A, Sundberg B, Olsson O, Sandberg G (1993) Plant Physiol 101: 313-320 121. Delarue M, Muller P, Bellini C, Delbarre A (1999) Physiol Plant 107: 120-127 122. Delbarre A, Muller P, ImhoffV, Morgat J-L, Barbie r-b r y g o o H (1994) Planta 195: 159-167 123. BarrattNM, Dong W, Gage DA, Magnus V, Town C D (1999) Physiol Plant 105: 207-217 124. Östin A, Kowalczyk M, Bhalerao RP, Sandberg G (1998) Plant Physiol 118: 285-296 125. Nowacki J, Bandurski RS (1980) Plant Physiol 65: 422-427 126. Chisnell JR, Bandurski RS (1988) Plant Physiol 86: 79-84 127. Sztein AE, Cohen JD, SlovinJP, Cooke TJ(1995)zim J Bot 82: 1514-1521 128. Cohen JD, Bandurski R S (1978)Planta 139:203-208 129. Stefańska A, Kowalczyk S(2000)Kosmos49:149-159 130. Corcuera LJ, Michalczuk L, Bandurski RS (1982) Biochem J 207: 283-290 131. Ehmann A, Bandurski RS(1974) CarbohydrRes36: 1-12 132. Pengelly WL, Hall PJ, Schulze A, Bandurski RS (1982) Plant Physiol 69: 1304-1307 133. C h i s n e 11 J R (1984) Plant Physiol 74: 278-283 134. H a 11 P J (1980) Phytochemistry 19: 2121-2123 135. Catala C, Óstin A, Chamamorro J, Sandberg G, C r o z i e r A (1992) Plant Physiol 100: 1457-1463 136. Tam YY, Epstein E, Normanly J (2000) Plant Physiol 123: 589-595 137. Percival FW, Bandurski RS (1976) Plant Physiol 58: 60-67 138. Michalczuk L, Bandurski RS (1980) Biochem Biophys Res Commun 93: 588-592 139. Michalczuk L, Bandurski RS (1982) Biochem J 207: 273-281 140. Leźnicki AJ, Bandurski RS (1988) Plant Physiol 88: 1478-1480 141. Kowalczyk S, Bandurski RS (1991) Biochem J 279: 509-514 142. Szerszeń JB, Szczyglowski K, Bandurski RS(1994) Science 265: 1699-1701 143. Kowalczyk S, Bandurski RS (1990) Plant Physiol 94: 4-12 144. Kęsy JM, B andurski RS (1990) Plant Physiol 94: 1598-1604 145. Hall PJ, Bandurski RS (1986) Plant Physiol 80: 374-377 146. Jakubowska A, Kowalczyk S, Leźnicki A J (1993)7 Plant Physiol 142: 61-66 147. Ludwig-MiillerJ, Epstein E, Hilgenberg W(1996) Physiol Plant 97: 627-634 148. Cohen J D (1982) Plant Physiol 70: 749-753 149. Sasaki K, Shimomura K, Kamada H, Harada H (1994) Plant Cell Physiol 35: 1159-1164 150. Epstein E, Baldi BG, Cohen JD (1986) Plant Physiol 80: 256-258 151. Białek K, Cohen JD (1986) Plant Physiol 100:2002-2007 152. Kulek GA, Cohen JD (1993 Plant Physiol 99S: 102 153. B a r t e 1B, Fink G R (1995) Science 268: 1745-1748 154. Davies RT, Goetz DH, Lasswell J, Anderson MN, Bartel B (1999) Plant Cell 11: 365-376 155. Savitsky PA, Gazaryan IG, Tishkov VI, Lagrimini LM, Ruzgas T, Gorton L (1999) Biochem 7340: 579-583 156. Sundberg B, Sandberg G, Jensen E (198 5) Plant Physiol 77: 952-955 157. Ros Barcelo A, Pedreno MA, Ferrer MA, Sabater F, Munoz R (1990) Planta 181: 448-450 158. Sandberg G, Jensen E, Crozier A (1984)Phytochemistry 23: 99-102 159. Kobayashi S, Sugioka K, Nakano H, Nakano M, Ter o-k u b o t a S (1984) Biochemistry 23: 4589-4597 160. Reinecke DM, Bandurski RS (1988) Plant Physiol 86: 868-872 161. Ernstsen A, Sandberg G, Lundstrom K(198l)Planta 111: 47-52 POSTĘPY BIOCHEMII 47(2), 2001 http://rcin.org.pl 183