Analiza asocjacji całego genomu w celu poznania regulacji zawartości kwasów tłuszczowych w nasionach rzepaku (Brassica napus L.) Katarzyna Gacek Instytut Hodowli i Aklimatyzacji Roślin - Państwowy Instytut Badawczy Oddział w Poznaniu Nauka dla hodowli i Nasiennictwa Roślin Uprawnych Zakopane 1.2.2017
Olej rzepakowy Tłuszcze = triacyloglicerole (TAG) estry glicerolu i kwasów tłuszczowych CELE ŻYWIENIOWE Źródło NNKT: linolowy i linolenowy (omega-6 i omega-3) 10x więcej niż w oliwie z oliwek Korzystny stosunek tych kwasów: 2:1 (oliwa 10:1) Zawiera tokoferole (wit.e), fitosterole, beta-karoten CELE PRZEMYSŁOWE Olej wysoko oleinowy nisko linolenowy stabilny w wysokich temperaturach Produkcja biopaliw, pasz, smarów, klei, farb, lakierów, rozpuszczalników itd Cele żywieniowe vs przemysłowe różna zawartość kwasów tłuszczowych
Biosynteza kwasów tłuszczowych Synteza kwasów rozpoczyna się w plastydach, wynikiem jest powstanie kwasów palmitynowego, stearynowego, oleinowego Kwasy te eksportowane są do retikulum endoplazmatycznego (ER) Modyfikacja kwasów np. elongacja, desaturacja: desaturaza FAD2 kwas linolowy oraz desaturaza FAD3 kwas linolenowy Formowanie triacylogliceroli (TAGs) Geny kodujące enzymy biorące udział w biosyntezie tłuszczu są dobrze poznane ale regulacja tych genów jest wciąż słabo znana
Jakie geny regulują zawartość kwasów tłuszczowych w nasionach rzepaku?
Brassica napus Rzepak: ALLOTETRAPLOID (AACC 2n=38), spontaniczne przekrzyżowanie B. rapa (AA) oraz B. oleracea (CC) Genom uległ potrojeniu wiele kopii genów w ramach rodzin genowych, dużo sekwencji powtórzonych Utrudnione przeniesienie wiedzy z rośliny modelowej A.thaliana do rzepaku
Cechy użytkowe - kompleksowa regulacja genowa Ważne agronomicznie cechy rzepaku (wzrost i rozwój roślin, odpowiedź na środowisko, szkodniki i choroby) są kontrolowane przez wiele genów Geny współgrają ze sobą funkcjonując w sieciach Sabaghian et al., 2015 Nature Scientific Reports Geny regulujące wzrost u roślin (A.thaliana) Identyfikacja KLUCZOWYCH genów regulujących kompleksową cechą (synteza kwasów tłuszczowych) jest wyzwaniem
Analiza asocjacji GWAS (genome-wide association study ) Populacja mapująca Populacja linii/odmian (ZRÓŻNICOWANIE) Genotypowanie DNA: (SNPs, delecje/insercje) Fenotypowanie Analiza asocjacji GWAS Geny kandydującewalidacja - marker Hodowla wspomagana markerami molekularnymi
Fenotypowanie populacji mapującej Populacja mapująca: rodzice, linie wsobne rekombinacyjne (RIL324xRIL622) oraz 60 linii DH rzepaku ozimego 1. Wzrost roślin w pokoju hodowlanym 2. Wernalizacja (4ºC) 3. Hodowla do stadium dojrzałości w szklarni
Kwasy tłuszczowe w nasionach rzepaku (chromatografia gazowa GC FAME) Zróżnicowana zawartość kwasów tłuszczowych w liniach DH w porównaniu z rodzicami Transgresja alleli w liniach DH Gacek K i in., Frontiers in Plant Science, 2017
Genotypowanie
Genotypowanie Illumina MiSeq dostępność nowych technologii badania genomu sekwenatory genomowe Illumina HiSeq Mniejsze genomy, celowane geny Wysokoprzepustowy, centra genomowe Pacific Biosciences PacBio Wysokoprzepustowy, centra genomowe długie odczyty Wybór metody: stosunek koszt - ilość danych
Sewencjonowanie populacji mapującej Fragmentacja DNA (sonifikacja) Przyłączenie adaptorów Połączenie prób, sekwencjonowanie Illumina HiSeq Dane sekwencji dla każdej z prób
Genotypowanie populacji mapującej Genom rzepaku skim based Odczyty z sekwenatora Głębokie pokrycie płytkie pokrycie skim based Zsekwencjonowany genom Odpowiednia dla populacji rekombinacyjnej (mapującej), dla której genotypy rodziców są znane Skim based : Zsekwencjonowano genom rodziców z pokryciem 7x oraz linie DH 1x
Genotypowanie populacji mapującej skim based Przyrównanie sekwencji odczytów do genomu referencyjnego rzepaku (Chalhoub et al., 2014), program SOAPaligner v2.21 Zidentyfikowano 90,205 SNPów, program SGSautoSNP Analiza asocjacji GWAS polimorfizm pojedynczego nukleotydu (SNP)
Asocjacja GWAS Powiązanie SNP na chromosomie A05 z kwasem oleinowym i linolowym Gacek K i in., Frontiers in Plant Science, 2017
Geny kandydujące Candidate gene Nearest genes c Position d Allele FDR adjusted p-value f Annotation g BnaA05g22550 a BnaA05g22540, BnaA05g22610 17158994 C/T 0.415746 Cyclic Nucleotide binding factor 1 (CNBT1) (1) BnaA05g22710 a BnaA05g22680, Bna05g22740 17234557 T/A 0.415746 CBL-interacting serine/threonine-protein kinase1 (CIPK1) EST B.napus a Bna05g22950 17443201 A/G 0.415746 Nuclear fusion defective 2 (NFD2) no gene prediction a,b Bna05g23070 Bna05g23080 17491191 G/C 0.415746 a 0.344113 b unknown repeats a,b Bna05g23110 PLDP1(2, 3) Bna05g23210 17529591 C/T 0.415746 a 0.344113 b repeats 0.415746 a repeats repeats a,b Bna05g23110 PLDP1(2, 3) Bna05g23210 17539208 A/G 0.344113 b 0.415746 a Small cysteine BnaA05g23370 a,b Bna05g23360 17712452 A/C 0.344113 b rich protein (SCR-LIKE22) 0.415746 a 17712458 G/T 0.344113 b EST B.napus a Bna05g23360 17729054 A/G 0.415746 unknown BnaA05g23430 a Bna05g23360 17741099 C/G 0.415746 TRZ4, trnase Bna05g23520 a,b Bna05g23560 17777977 G/T 0.415746 a 0.344113 b Malonyl-CoA Synthase (AAE13) (4) EST B.napus a Bna05g23360 Bna05g23560 17782780 A/G 0.415746 unknown EST B.napus a,b Bna05g23670 FAD5, BnaA05g23680 FAD5 (5) 17889752 A/T 0.415746 a 0.344113 b UDP-Glycosyltransferase protein Transposable element a,b BnaA05g23720, BnaA05g23740 PLDALPHA1 (6) 17920979 C/G 0.415746 a 0.344113 b TE BnaA05g23770 a,b BnaA05g23760, BnaA05g23790 FATB (7) 17939130 T/G 0.415746 a 0.344113 b Fbox BnaA05g23870 a,b BnaA05g23830 BnaA05g23880 17986390 C/T 0.415746 a 0.344113 b mitochondrial,glutaredoxin BnaA05g23930 a BnaA05g23880 18018284 G/C 0.415746 Pentatricopeptide repeat (TPR)-like BnaA05g23960 a,b BnaA05g23880 18027976 A/G 0.415746 a unknown 0.344113 b EST B.napus a BnaA05g23880 18029252 A/G 0.415746 unknown Metabolizm tłuszczów: EST B.napus a,b BnaA05g23880 18043857 A/T 0.415746 a 0.344113 b unknown 0.415746 a repeats repeats a,b BnaA05g23880 18045779 A/T 0.360659 b 0.415746 a TE Transposable element a,b BnaA05g23880 18046273 G/A 0.344113 b 0.415746 a UDP-Glycosyltransferase EST B.napus a,b BnaA05g23880 18057640 C/A 0.344113 b protein 0.415746 a UDP-Glycosyltransferase protein EST B.napus a,b BnaA05g23880 18047838 G/A 0.344113 b 0.415746 a UDP-Glycosyltransferase protein EST B.napus a,b BnaA05g23880 18047852 C/T 0.344113 b BnaA05g24090 b BnaA05g24100 18140199 C/G 0.344113 Transducin/WD40 repeat-like superfamily protein PLDP1 AAE13 PLDALPHA1 FAD5 FATB BnaA05g24230 a,b BnaA05g24130 18182396 a G/T 0.415746 Legume lectin family protein 18182414 a,b C/T 0.415746 0.344113 18182687 b C/T 0.344113 Gacek K i in., Frontiers in Plant Science, 2017
Podsumowanie i dalsza praca Zmienność genetyczna oraz fenotypowa populacji RIL324xRIL622 pozwoliły zidentyfikować geny kandydujące regulujące zawartość kwasu oleinowego i linolowego w nasionach rzepaku Dalsza walidacja genów kandydujących Wiele z zidentyfikowanych genów znane w regulacji zawartością kwasów tłuszczowych co potwierdza skuteczność metody Analiza asocjacji dla innych cech użytkowych rzepaku - markery
Podziękowania IHAR-PIB Poznań Iwona Bartkowiak Broda Krzysztof Michalski Laurencja Szała Stanisław Spasibionek Teresa Piętka Uniwersytet Przyrodniczy w Poznaniu Jan Bocianowski University of Western Australia Jacqueline Batley Dave Edwards Philipp Bayer Kenneth Chan Anita Severn-Ellis University of Queensland Manuel Zander
Dziękuję za uwagę