Recenzja rozprawy doktorskiej mgr Wojciecha Rymaszewskiego pt. Analiza naturalnej zmienności w obrębie gatunku Arabidopsis thaliana

Transkrypt

1 Prof. dr hab. Iwona Szarejko Katedra Genetyki Wydział Biologii i Ochrony Środowiska Uniwersytet Śląski w Katowicach Recenzja rozprawy doktorskiej mgr Wojciecha Rymaszewskiego pt. Analiza naturalnej zmienności w obrębie gatunku Arabidopsis thaliana (L.) Heynh jako narzędzie badania procesów aklimatyzacji roślin do wzrostu w warunkach ograniczonej dostępności wody Przedstawiona do recenzji rozprawa doktorska Pana mgr Wojciecha Rymaszewskiego została wykonana pod kierunkiem Pana Prof. dr hab. Jacka Henniga oraz Pani Dr Christine Granier, ko-promotora tej pracy, w dwóch ośrodkach badawczych: Instytucie Biochemii i Biofizyki PAN w Warszawie oraz Laboratory of Plant Ecophysiological Responses to Environmental Stresses (INRA-SupAgro), Montpellier, Francja. Większość przedstawionych w rozprawie wyników została już opublikowana w prestiżowym czasopiśmie Plant Physiology (IF 6.456), a mgr W. Rymaszewski jest pierwszym autorem tej publikacji (Rymaszewski W, Vile D, Bediee A, Dauzat M, Luchaire N, Kamrowska D, Granier C, Hennig J (2017) Stress-Related Gene Expression Reflects Morphophysiological Responses to Water Deficit. Plant Physiol 174: ) Przedmiot rozprawy i jego naukowe znaczenie Przedmiotem rozprawy doktorskiej Pana mgr Wojciecha Rymaszewskiego jest kompleksowa analiza zależności między morfo-fizjologicznymi i molekularnymi mechanizmami odpowiedzi Arabidopsis thaliana na stres niedoboru wody. Problematyka pracy nawiązuje do bardzo aktualnych wyzwań naukowych, a mianowicie do poznania mechanizmów odpowiedzi roślin na stres suszy, która jest jednym z najgroźniejszych stresów środowiskowych ograniczających prawidłowy wzrost i rozwój roślin oraz głównym czynnikiem powodującym straty w rolnictwie. Rośliny na drodze ewolucji wykształciły wiele różnych strategii pozwalających na ich przystosowanie do okresowego niedoboru wody w glebie. Wyróżnia się zazwyczaj trzy główne mechanizmy odpowiedzi na ten stres: ucieczkę przed suszą, unikanie odwodnienia oraz tolerancję dehydratacji, polegającą na dostosowaniu metabolizmu rośliny do warunków stresu. Realizowanie przez roślinę złożonych procesów prowadzących do tolerancji na stres możliwe

2 jest dzięki istnieniu korelacji w zmianach gospodarki wodnej na poziomie morfologicznym, anatomicznym, fizjologicznym oraz molekularnym w różnych etapach rozwoju rośliny. Identyfikacja tych korelacji ma nie tylko znaczenie poznawcze dla zrozumienia mechanizmów odpowiedzi roślin na stres, lecz również duże znaczenie praktyczne w otrzymywaniu odmian roślin uprawnych o zwiększonej tolerancji na niedobór wody. Z tych względów tematykę rozprawy mgr W. Rymaszewskiego uważam za bardzo aktualną i nadzwyczaj ważną merytorycznie. Szczegółowe cele rozprawy, obiekt badań i zastosowane metodyki badawcze Główne cele badań podjętych przez Doktoranta obejmowały: (1) określenie związków między morfo-fizjologiczną i molekularna odpowiedzią roślin na różne rodzaje stresu niedoboru wody (deficyt stały i progresywny), (2) stworzenie modeli do przewidywania reakcji roślin na stres, oraz (3) identyfikację zależności między odpowiedzią badanych genotypów a warunkami klimatycznymi w miejscach ich pochodzenia. Obiektem badań była modelowa roślina dwuliścienna Arabidopsis thaliana, dla której istnieje bogactwo materiałów genetycznych, dostępnych dla badaczy. Obok powszechnie używanych mutantów insercyjnych oraz linii z nadekspresją lub kontrolowaną ekspresją genów, publicznie dostępne są także kolekcje ekotypów reprezentujących naturalną zmienność genetyczną, pochodzące z różnych siedlisk eko-klimatycznych. W swych badaniach Doktorant wykorzystał 18 ekotypów Arabidopsis, z których większość pochodziła z różnych rejonów Europy, a pozostałe z USA, Indii, Tadżykistanu, Libii i Przylądka Dobrej Nadziei. Na podkreślenie zasługuje sposób wyboru materiału badań - Doktorant wykorzystał w tym celu ilościową analizę ekspresji genu aneksyny1 (ANN1), stanowiącego marker odpowiedzi na suszę. Badając za pomocą RT-qPCR ekspresję ANN1 w 94 ekotypach Arabidopsis, wyselekcjonował do badań ekotypy o różnym pochodzeniu geograficznym, reprezentujące szerokie spektrum ekspresji tego genu. Tak wybrany materiał wykorzystał w dwóch osobnych eksperymentach, w których analizował odpowiedź roślin na stały i progresywny deficyt wody. W warunkach stałego niedoboru wody testował jego umiarkowany i silny deficyt (mild water deficit MWD i severe water deficit SWD, odpowiednio). Stres progresywny polegał zaprzestaniu podlewania aż do osiągnięcia bardzo niskiej zawartości wody w glebie (2,5 x niższej niż w traktowaniu SWD) i stopniowym wznawianiu podlewania aż do osiągnięcia zawartości wody takiej jak w kontroli. Badania prowadzone przez mgr W. Rymaszewskiego obejmowały: - analizę 13 cech morfologicznych i fizjologicznych przeprowadzoną z wykorzystaniem platformy do fenotypowania roślin PHENOPSIS - analizę ekspresji 16 genów związanych z reakcją roślin na stresy środowiskowe z wykorzystanie RT-qPCR - analizę sekwencji promotorowych genów w poszukiwaniu polimorfizmów leżących u podstaw naturalnej zmienności w ich ekspresji

3 - modelowanie odpowiedzi na stres na poziomie morfo-fizjologicznym w oparciu o analizę ekspresji genów - określenie odpowiedzi badanych ekotypów na progresywny deficyt wody i porównanie tej odpowiedzi do reakcji na deficyt stały - identyfikację zależności między warunkami klimatycznymi w miejscach pochodzenia badanych ekotypów a ich odpowiedzią na stres niedoboru wody. Realizacja wymienionych badań była możliwa dzięki połączeniu przez Doktoranta wysokoprzepustowych metod fenotypowania roślin, technik biologii molekularnej, narzędzi bioinformatycznych oraz zaawansowanych metod statystycznych zastosowanych do analizy zależności między badanymi czynnikami. Wykorzystanie przez Doktoranta platformy PHENOPSIS było kluczowe dla przeprowadzenia doświadczeń, w których rośliny rosły w określonych warunkach stresu przez cały okres wegetacji. Pozwoliło to, z jednej strony na stałą kontrolę warunków doświadczenia (w tym utrzymania zawartości wody w glebie na zadanym poziomie), z drugiej zaś na wykorzystanie technik obrazowania do analizy cech morfologicznych dla wielu roślin jednocześnie. System umożliwił także wykonanie w sposób automatyczny zdjęć w podczerwieni dla określenia temperatury liści oraz pomiarów fluorescencji chlorofilu dla ustalenia wydajności fotosyntezy badanych genotypów. Pomiary pozostałych analizowanych cech były wykonane przez Doktoranta. Na szczególne podkreślenie zasługuje wszechstronna analiza statystyczna uzyskanych przez Doktoranta wyników, która pozwoliła Mu na wyciągnięcie dobrze udokumentowanych wniosków. Przed przeprowadzeniem analizy statystycznej, dla każdej badanej cechy, a także dla ekspresji genów obliczono współczynnik odpowiedzi (response ratio), zwany też w literaturze indeksem stresu, będący stosunkiem wartości cechy w warunkach optymalnego nawodnienia do wartości tej cechy w warunkach stresu. Dla zapewnienie spójności danych, obliczone współczynniki były poddane transformacji logarytmicznej (ln). Podsumowując, zastosowane w pracy materiały i metody badawcze były właściwie dobrane dla osiągnięcia założonych przez Doktoranta celów, a ich opis w większości jest wyczerpujący i klarowny. Najważniejsze uzyskane wyniki W rozprawie przedstawiono wyniki starannie zaplanowanych i opisanych analiz, a za najważniejsze z nich uważam: 1. Wykazanie, że ekotypy A. thaliana pochodzące z różnych stref klimatycznych charakteryzują się istotnie różną odpowiedzią na stres niedoboru wody na poziomie morfo-fizjologicznym i realizują różne strategie unikania lub tolerancji stresu. 2. Stwierdzenie, że podobnie jak cechy morfo-fizjologiczne, także ekspresja genów związanych z odpowiedzią na stres niedoboru wody wykazuje wysoką naturalną zmienność genetyczną wśród badanych form.

4 3. Wykazanie, że odpowiedź ekotypów na niedobór wody na poziomie morfofizjologicznym i molekularnym jest blisko skorelowana. Wywołane stresem zmiany powierzchni rozety korelują ze zmianami ekspresji genów NDL1, CHS i GA2OX6, zmiany transpiracji korelują ze zmianami ekspresji genów ANN2 and MYB44, a zmiany zawartości wody ze zmianami ekspresji genu NCED3. 4. Stwierdzenie, że zmiany cech morfo-fizjologicznych wywołane niedoborem wody korelują z poziomem ekspresji genów w warunkach dobrego nawodnienia. Jest to jeden z najbardziej znaczących wyników tej pracy, gdyż pozwolił on Doktorantowi na stworzenie modeli do przewidywania odpowiedzi roślin na stały niedobór wody, w oparciu o ekspresję genów w warunkach optymalnego podlewania. Wskazane przez Doktoranta geny mogą służyć jako markery morfo-fizjologicznej odpowiedzi na stres niedoboru wody bez potrzeby przeprowadzania eksperymentu suszowego. 5. Wykazanie, że w warunkach progresywnego deficytu wody badane ekotypy różnią się między sobą pod względem zmian w wielkości rozety, zmian wydajności fotosyntezy i przeżywalności. 6. Wykazanie, że jedynie zmiany wielkości rozety w warunkach progresywnego stresu korelują ze zmianami tej cechy w warunkach stałego deficytu wody. 7. Wykazanie, że przeżywalność roślin oraz wskaźniki wydajności fotosystemu II w progresywnym stresie nie są skorelowana z żadnymi cechami morfo-fizjologicznymi, co potwierdza hipotezę o odmiennych mechanizmach odpowiedzi na ostry i umiarkowany deficyt wody. 8. Wskazanie, że reakcje ekotypów na niedobór wody, w szczególności przeżywalność i zmiany powierzchni rozety liściowej, związane są ze zmiennymi klimatycznymi, dotyczącymi temperatury, opadów i ewapotranspiracji w miejscu pochodzenia ekotypów. Należy jeszcze dodać, że przeprowadzona przez Doktoranta analiza sekwencji promotorów badanych w pracy genów nie wykazała zależności pomiędzy liczbą kopii motywów wiązania czynników transkrypcyjnych (TF-binding motiffs) w promotorach, a poziomem ekspresji tych genów. Ocena formalna pracy Praca przygotowana jest wyjątkowo starannie, może wręcz stanowić wzór edytorski dla podobnych opracowań. Układ i organizację wszystkich rozdziałów, jak i klarowny język, oceniam bardzo pozytywnie. We Wstępie wyczerpująco przedstawiono aktualne zagadnienia związane z fizjologią i genetyką odpowiedzi stres niedoboru wody, problematykę metodologii badań nad różnymi rodzajami stresu (w tym technologie wysokoprzepustowego fenotypowania) oraz wykorzystanie naturalnej zmienności w badaniach adaptacji do stresu u Arabidopsis thaliana. Tak skonstruowany wstęp dobrze uzasadnia zasadność podjętych przez

5 Doktoranta badań. Cele pracy są jasno sformułowane. Podobnie, w klarowny i przejrzysty sposób skonstruowany jest rozdział Materiały i Metody. Brakuje mi w nim tylko szerszego uzasadnienia wyboru konkretnych 16 genów, których ekspresję badano w pracy. Doktorant ograniczył się do zamieszczenia ich listy w rozdziale Metody, a Wynikach przedstawił geny w podziale na kilka funkcjonalnych grup, wśród których znalazła się bardzo szeroko rozumianą grupa genów związanych z metabolizmem biologicznie aktywnych cząsteczek. Dlatego chciałabym w tym miejscu zapytać, czym kierował się Doktorant, wybierając te, a nie inne geny z poszczególnych grup? Wyniki ujęto w trzy główne rozdziały przedstawiające: (1) morfo-fizjologiczną i molekularną odpowiedź badanych ekotypów na stały niedobór wody, (2) odpowiedź na progresywny stres oraz (3) rolę klimatu w kształtowaniu się naturalnej genetycznej zmienności analizowanych cech. Dokumentacja wyników jest przejrzysta i kompletna, a opis wyników bardzo dobrze uporządkowany. Dyskusja została opracowana w sposób wyczerpujący, z dużą znajomością problematyki nawiązującej do procesów uczestniczących w odpowiedzi stresowej na poziomie fizjologicznym i molekularnym. Na szczególne podkreślenie zasługuje bardzo wnikliwa analiza możliwych przyczyn leżących u podłoża obserwowanych korelacji między ekspresją określonych genów a zmianami cech mofrofizjologicznych pod wpływem deficytu wody. Jedynie rozdział Wnioski może budzić pewne zastrzeżenia, gdyż część wniosków stanowi właściwie podsumowanie wyników badań. Brakuje mi w tej części wyraźnego wskazania, które z badanych genów mogłyby zostać wykorzystane jako markery odpowiedzi roślin na stały deficyt wody. Jako temat do dyskusji, chciałbym także zapytać Doktoranta, jak widzi ewentualne wykorzystanie wyników swojej pracy w praktycznej hodowli roślin. Wnioski końcowe Stwierdzam, że rozprawa Pana mgr Wojciecha Rymaszewskiego spełnia wszelkie wymogi stawiane rozprawom doktorskim. Dostarcza ona oryginalnych wyników, wnoszących postęp do badań w zakresie odpowiedzi roślin na stres abiotyczny. Autor wykazał się bardzo dobrą znajomością literatury naukowej dotyczącej problematyki swych badań, umiejętnością stawiania hipotez naukowych, właściwego planowania eksperymentów oraz opanowaniem warsztatu naukowego, obejmującego nowoczesne metody badawcze z zakresu biologii molekularnej, bioinformatyki i modelowania. Pokazana w rozprawie zdolność mgr W. Rymaszewskiego do krytycznej oceny uzyskanych wyników i wyważonego wnioskowania świadczy o Jego dojrzałości naukowej. Otrzymane wyniki badań są oryginalne i zawierają oczywisty element nowości naukowej. O ich wadze świadczy fakt opublikowania większości prezentowanych w rozprawie badań w prestiżowym międzynarodowym czasopiśmie Plant Physiology. Biorąc powyższe pod uwagę, zwracam się do Rady Naukowej Instytutu Biochemii

6 i Biofizyki Polskiej Akademii Nauk w Warszawie o dopuszczenie pan mgr Wojciecha Rymaszewskiego do dalszych etapów przewodu doktorskiego. Jednocześnie, sformułowana powyżej ocena upoważnia mnie do postawienia wniosku o wyróżnienie bardzo wartościowej rozprawy doktorskiej Pana mgr Wojciecha Rymaszewskiego odpowiednią nagrodą. Katowice 2 marca 2018 Prof. dr hab. Iwona Szarejko

7