MARKERY MIKROSATELITARNE Badania laboratoryjne prowadzone w Katedrze Genetyki i Ogólnej Hodowli Zwierząt SGGW w ramach monitoringu genetycznego wykorzystują analizę genetyczną markerów mikrosatelitarnych. Aby uzmysłowić sobie, czym jest marker genetyczny wystarczy skorzystać z prostego porównania. Marker genetyczny może być cechą widoczną w organizmie, taką jak kolor oczu, lub oznaczaną innymi metodami - jak grupy krwi. Na podstawie takich markerów wyznaczane są podobieństwa i różnice między poszczególnymi osobnikami. Markery mikrosatelitarne nie są widoczne wprost i muszą być identyfikowane w laboratorium przy pomocy nowoczesnego sprzętu do analizy genetycznej, ale podobnie jak wyżej wspomniane grupy krwi potrafią charakteryzować osobnika w sposób niezwykle dokładny i są niepowtarzalne - podobnie do linii papilarnych. MARKER GENETYCZNY KOLOR OCZU GRUPA KRWI SEKWENCJE MIKROSATELITARNE Aby markery były przydatne do identyfikowania osobników powinny być tak dobrane, żeby badana populacja wykazywała pod ich względem różnorodność - polimorfizm. Im bardziej polimorficzny marker, czyli im więcej różnorodnych jego form obecnych jest w populacji, tym więcej możliwości kombinacji tych form może wystąpić u pojedynczego osobnika. Należy jednak pamiętać, że ssaki są organizmami posiadającymi geny występujące parami, a więc liczba różnych form u pojedynczego osobnika dla jednego markera nie przekroczy dwóch. W związku z tym, że markery genetyczne są fragmentami DNA warto przypomnieć sobie budowę całej cząsteczki DNA czyli kwasu deoksyrybonukleinowego. DNA składa się z dwóch nici połączonych ze sobą wiązaniami chemicznymi. Najmniejszym elementem budulcowym pojedynczej nici DNA jest nukleotyd. W skład każdego nukleotydu wchodzi cukier (deoksyryboza), reszta fosforanowa oraz zasada azotowa - adenina (A), cytozyna (C), guanina (G) lub tymina (T). Liczba par zasad (pz) określa długość fragmentu DNA (Ryc. 1). C A G T G T A T G C A A T nić dwuniciowy fragment G T C A C A T A C G T T A nić DNA para zasad Ryc. 1 Na rycinie przedstawiono fragment DNA o długości 13 par zasad (pz). W zapisie sekwencji nukleotydów przyjęło się stosować zasadę, że nukleotyd zawierający cytozynę oznaczany jest literą C, adeninę literą A itd. W cząsteczce DNA nici połączone są ze sobą wiązaniami, które wytwarzają się pomiędzy poszczególnymi zasadami azotowymi. Wiązania te tworzą się wyłącznie pomiędzy parami adenina-tymina i cytozynaguanina.
Marker mikrosatelitarny (Short Tandem Repeats - STR, Simple Sequence Repeats - SSR) to taki fragment nici DNA, który składa się z serii powtórzonych wielokrotnie dwóch (lub więcej) nukleotydów na jednej i analogicznie na drugiej nici DNA (Ryc. 2). Na drodze ewolucji wykształciło się wiele różnych odmian w obrębie takich powtórzeń, każda z odmian składa się z tego samego motywu, ale powtórzonego mniej lub więcej razy. Na obu końcach takiego fragmentu znajduje się układ nukleotydów tworzący tzw. sekwencję flankującą, obejmującą powtórzenia. Sekwencje flankujące, są to fragmenty DNA charakterystyczne dla danego markera i identyczne u wszystkich osobników tego samego gatunku. Różnorodność markerów mikrosatelitarnych polega na tym, że w obrębie danego fragmentu - pomiędzy sekwencjami flankującymi może występować różna liczba powtórzeń określonego odcinka DNA. Na długość markera u danego osobnika, podaną w parach zasad, składa się więc długość sekwencji flankujących i długość fragmentu pomiędzy nimi. Znając sekwencje flankujące, czyli identyfikujące początek i koniec markera, można przy użyciu techniki o nazwie PCR (Polimerase Chain Reaction) wydobyć dany marker z całego DNA konkretnego osobnika, a następnie przy pomocy analizatora genetycznego sprawdzić jaką formę (ile powtórzeń) przyjmuje badany marker u tego osobnika. Jeśli marker mikrosatelitarny składa się z powtórzonych dwadzieścia razy dwóch par zasad, a sekwencje flankujące mają długość po 25 par zasad (z każdej strony), to łączna długość DNA zawierająca cały marker to 25 pz + (20 x 2 pz) + 25 pz = 90 pz. T A T G C A A T G T G T G T G T G T G G C A T T G A T A C G T T A C A C A C A C A C A C C G T A A C sekwencja flankująca region powtórzeń sekwencja flankująca Ryc. 2 Przykładowa sekwencja mikrosatelitarna zawierająca pięciokrotnie powtórzony motyw GT (odpowiada mu motyw CA na drugiej nici), znajdujący się pomiędzy dwiema sekwencjami flankującymi. Długość tego fragmentu wynosi 25 pz. Dla zobrazowania, posłużmy się markerem genetycznym o nazwie ETH010. Załóżmy, że w wyniku analizy genetycznej w populacji żubra zidentyfikowano trzy różne formy tego markera: 207 pz, 209 pz, 211 pz. Jak widać każda forma różni się od pozostałych długością będącą wielokrotnością dwóch pz, czyli powielonego motywu. Jak wcześniej wspomniano ssaki są organizmami posiadającymi geny występujące parami, więc u danego osobnika mogą wystąpić dwie różne (np. 207 pz /209 pz; 207 pz /211 pz lub 209 pz /211 pz), bądź dwie takie same formy (np. 207 pz /207 pz; 209 pz /209 pz lub 211 pz /211 pz) badanego markera.
allel 1 allel 2 Zastąpimy teraz wynik opisany w postaci liczby par zasad (pz) kolorami (Ryc. 3): 207 pz żółty 209 pz czerwony 211 pz szary. Jeśli osobnik posiada dwie identyczne wersje markera określamy ten układ mianem układu homozygotycznego. Jeśli osobnik posiada dwie różne wersje markera określamy ten układ mianem układu heterozygotycznego. PODRÓŻNA Ryc. 3 Wyniki analizy genetycznej markera ETH010 przeprowadzonej u 6 osobników Na rycinie nr 3 u trzech osobników (POCZCIWA, POMAGIER, POTWOREK) markery występują w układzie homozygotycznym, ale za każdym razem innym. Zatem w badanej grupie zwierząt widzimy już trzy różne formy (allele) tego samego genu. Większą osobniczą różnorodność genetyczną wykazują pozostałe trzy osobniki (PODRÓŻNA, POLATLAS, POCZTYLION). Marker występuje u nich w układzie heterozygotycznym, czyli każdy osobnik posiada dwie różne jego wersje. Jeśli będziemy kojarzyć osobniki o takich samych układach homozygotycznych ich potomstwo będzie identyczne. Jeśli skojarzymy osobniki o różnych układach homozygotycznych, potomstwo będzie heterozygotyczne. Np. układ heterozygotyczny, obecny o osobnika PODRÓŻNA mógłby powstać w wyniku skojarzenia osobników POCZCIWA i POTWOREK. Jeśli parę rodzicielską będą stanowiły osobniki heterozygotyczne (np. PODRÓŻNA i POLATLAS) u ich potomstwa może ujawnić się jedna z wielu kombinacji (Ryc. 4). Ryc. 4 Szachownica przedstawiająca wynik kojarzenia osobnika PODRÓŻNA (czerwony/szary) i osobnika POLATLAS (żółty/czerwony). U potomstwa mogą pojawić się kombinacje: czerwony/żółty, szary/żółty, czerwony/czerwony i szary/czerwony.
Badania genetyczne obejmują jednocześnie kilkanaście markerów mikrosatelitarnych. Wyniki dla sześciu przykładowych osobników zostały przedstawione na poniższej rycinie (Ryc. 5). Ryc. 5 Wyniki analizy genetycznej markerów AGLA239, BM1818, BM1824, MM012, SPS115, EBMS044, ETH010, ETH225 i TGLA325 przeprowadzonej u 6 osobników. Wynik dla dwóch przykładowych markerów zaznaczono za pomocą czarnych ramek. Dla każdego z tych 9 różnych markerów zastosowano ten sam schemat kolorystyczny tzn. jeśli w markerze wykryto dwie różne wersje, to pierwsza - o mniejszej liczbie pz (krótsza) zawsze znakowana jest kolorem żółtym, druga (dłuższa) kolorem czerwonym. Jeśli wykryto trzy wersje markera np. ETH010, to najdłuższa wersja znakowana jest kolorem szarym.
Wynik analizy genetycznej dla konkretnego osobnika stanowi zbiór wyników dla 9 markerów mikrosatelitarnych i należy odczytywać go z wiersza oznakowanego imieniem tego osobnika (Ryc. 6): Ryc. 6 Wyniki analizy genetycznej markerów AGLA239, BM1818, BM1824, MM012, SPS115, EBMS044, ETH010, ETH225 i TGLA325 przeprowadzonej u 6 osobników. Wynik dla konkretnego osobnika POCZCIWA zaznaczono za pomocą czarnej ramki. OCENA POPULACJI NA PODSTAWIE WYNIKÓW ANALIZY GENETYCZNEJ Znając wyniki analizy markerów mikrosatelitarnych dla poszczególnych osobników w populacji można sprawdzić, czy osobniki tworzące tę populację wykazują podobieństwo, czy różnorodność pod względem badanych markerów. Jeśli w badanej populacji w obrębie licznych markerów zaobserwujemy brak różnorodności, to z bardzo dużym prawdopodobieństwem możemy stwierdzić, że w obrębie innych nieprzebadanych markerów i genów populacja również wykazuje brak różnorodności. Stanowi to podstawę do takiego planowania kojarzeń, aby zapobiegać dalszemu spadkowi różnorodności, gdyż wiąże się on z większą podatnością na choroby, gorszym przystosowaniem do zmieniających się warunków środowiskowych itp. Plan kojarzeń powinien zatem zawierać taki dobór osobników, w którym do rozrodu w pierwszej kolejności preferowane będą osobniki posiadające unikatowe cechy na tle populacji (np. rzadkie wersje markerów). Aby ustalić, które wersje markerów są rzadkie w populacji można skorzystać z wykresu poniżej (Wyk. 1). Przedstawia on częstość występowania poszczególnych form/wersji w obrębie całej populacji przebadanej pod kątem zmienności 9 markerów mikrosatelitarnych. Zgodnie z zasadą, że cała badana populacja reprezentuje 100% różnych form danego markera, ideałem byłoby, gdyby każda z wykrytych form występowała w niej z taką samą częstością co pozostałe. Jednak w wyniku np. uczestniczenia w rozrodzie tylko wybranych osobników częstość występowania poszczególnych form ulga zmianie. Przewaga występowania jednej formy danego markera nad pozostałymi wynika
z omówionych już konsekwencji kojarzeń osobników o tym samym genotypie. Jeśli homozygotyczny samiec będzie przez zbyt długi okres czasu krył w tym samym stadzie i dojdzie do kojarzeń krewniaczych, podobne układy homozygotyczne rozprzestrzenią się. Taka sytuacja widoczna jest w przypadku markera SPS115, EBMS044 i ETH225. Dla tych trzech markerów wyodrębniono po dwie różne formy, ale w każdym przypadku jedna forma znacząco dominuje pod względem frekwencji nad drugą. Wykres 1. Częstość występowania różnych form markerów AGLA293, BM1818, BM1824, MM012, SPS115, EBMS044, ETH010, ETH225 i TGLA325 w obrębie całej przebadanej populacji. Zatem, wyniki analizy mikrosatelit, podobnie jak wyniki analizy rodowodów mogą i powinny być brane pod uwagę nie tylko gdy wybieramy zwierzęta do rozrodu, ale również gdy podejmujemy decyzje dotyczące wymiany osobników pomiędzy stadami.
PORÓWNANIE LINII BIAŁOWIESKIEJ I BIAŁOWIESKO-KAUKASKIEJ Wykres 2. Porównanie częstości występowania różnych form markerów AGLA239, BM1818, BM1824, MM012, SPS115, EBMS044, ETH010, ETH225 i TGLA325 pomiędzy dwiema liniami hodowlanymi żubra Bison bonasus. Linia białowiesko-kaukaska została oznaczona skrótem LC, a linia białowieska skrótem LB. Wykorzystując wyniki analizy markerów mikrosatelitarnych można dokonywać również porównania pomiędzy populacjami. Na wykresie powyżej (Wyk. 2) porównano populację żubrów należącą do linii białowiesko-kaukaskiej (LC) oraz populację należącą do linii białowieskiej (LB). Z tego porównania wynika, że obie populacje różnią się od siebie pod względem częstości występowania różnych form w poszczególnych markerach. Niestety w obu populacjach bardzo niska jest częstość występowania krótszej z form zidentyfikowanych w obrębie markera SPS115 (około 0,3). Dodatkowo w populacji LC w obrębie markera TGLA325 występuje forma (oznaczona kolorem szarym) z częstością 0,423, która w ogóle nie jest obecna w populacji LB.