96 TESTÓW TEST IMMUNOENZYMATYCZNY DO WYKRYWANIA PRZECIWCIAŁ KLASY IgM PRZECIWKO TOXOPLASMA GONDII W LUDZKIEJ SUROWICY LUB OSOCZU

PLATELIA TOXO IgM TMB 96 TESTÓW 72751 TEST IMMUNOENZYMATYCZNY DO WYKRYWANIA PRZECIWCIAŁ KLASY IgM PRZECIWKO TOXOPLASMA GONDII W LUDZKIEJ SUROWICY LUB OSOCZU Do diagnostyki in vitro Wszystkie produkowane i wprowadzane do sprzedaży odczynniki są przygotowywane zgodnie z systemem jakości, poczynając od materiałów wyjściowych, aż do ostatecznego produktu komercyjnego. Odczynniki każdej serii podlegają oznaczeniu kontrolnemu, i są dopuszczane do użytkowania, jeśli spełniają wymagane kryteria. Odpowiednie protokoły produkcji i kontroli jakości każdej serii są przechowywane w firmie 1

SPIS TREŚCI 1 - ZASTOSOWANIE... 3 2 - ZNACZENIE KLINICZNE... 3 3 - ZASADA TESTU... 3 4 - SKŁAD ZESTAWU... 4 5 - ZALECENIA DLA UŻYTKOWNIKA... 5 6 - INNE NIEZBĘDNE MATERIAŁY I SPRZĘT... 7 7 - PRZYGOTOWANIE I PRZECHOWYWANIE ODCZYNNIKÓW... 8 8 POBIERANIE, OPRACOWYWANIE I PRZECHOWYWANIE MATERIAŁU DO BADAŃ... 9 9 - PROCEDURA... 10 10 - PROCEDURA AUTOMATYCZNA... 11 11 - OBLICZENIE I INTERPRETACJA WYNIKÓW... 11 12 - CHARAKTERYSTYKA I OGRANICZENIA TESTU... 13 13 LITERATURA... 17 2

1 - ZASTOSOWANIE Test Platelia Toxo IgM TMB służy do jakościowego oznaczania in vitro przeciwciał klasy IgM przeciwko Toxoplasma gondii w ludzkiej surowicy lub osoczu. 2 - ZNACZENIE KLINICZNE T. gondii jest pierwotniakiem wywołującym zakażenia u licznych gatunków ssaków i ptaków. Toksoplazmoza występująca u ludzi i zwierząt przeważnie przebiega bezobjawowo. Częstość występowania zakażeń w danej populacji, wykrywanych metodami serologicznymi, waha się w różnych krajach i zależy od wieku badanych. Toksoplazmoza ciężarnych może powodować poważne zaburzenia rozwoju płodu (zwłaszcza uszkodzenie funkcji mózgu), a czasami prowadzić do obumarcia płodu. Wykrycie przeciwciał IgG przeciw T. gondii u kobiet przed zapłodnieniem pozwala uzyskać pewność ochrony płodu przed zakażeniem wrodzonym, w przypadku wystąpienia toksoplazmozy w czasie ciąży. Skłonność do występowania toksoplazmozy o ostrym przebiegu występuje u chorych z nabytym zespołem niedoboru odporności (AIDS) oraz u innych osób z immunosupresją. Zakażenia te są najczęściej spowodowane reaktywacją cyst pierwotniaka, obecnych w organizmie chorego przed zakażeniem wirusem HIV. Diagnostyka zakażenia T. gondii może być skomplikowana, a izolacja pasożyta jest rzadka. Serologiczne potwierdzenie występowania przeciwciał przeciwko T. gondii świadczy o kontakcie z pasożytem i jest powszechnie akceptowane w celu określenia statusu immunologicznego pacjenta i podatności na zakażenie. Wykrywanie poszczególnych izotypów pomaga określić czas zakażenia T. gondii i zastosowanie odpowiedniego leczenia w przypadku niedawnej infekcji lub propozycję profilaktyki, obejmującej zalecenia higieniczno-dietetyczne dla kobiet w ciąży lub chemioprofilaktykę pacjentów z upośledzoną odpornością. 3 - ZASADA TESTU PLATELIA Toxo IgM TMB jest pośrednim testem immunoenzymatycznym, w którym na fazie stałej opłaszczone są przeciwciała przeciwko ludzkim łańcuchom mu wiążące obecne w próbce przeciwciała klasy IgM. Koniugat stanowią znakowane peroksydazą monoklonalne przeciwciała przeciw T.gondii, skierowane przeciwko powierzchniowemu antygenowi białkowemu, PM 30 000, który jest głównym celem immunologicznej odpowiedzi humoralnej. Etap pierwszy Rozcieńczenie próbek i inkubacja z przeciwciałami przeciwko ludzkim IgM, związanym z fazą stałą. Podczas inkubacji przez 1 godzinę w temp. 37 C, obecne w próbce przeciwciała klasy IgM zwiążą się z fazą stałą. Po inkubacji, pozostałe immunoglobuliny (łącznie z IgG) i inne białka surowicy zostają usunięte podczas płukania. 3

Etap drugi Naniesienie do studzienek roztworu zawierającego antygen T.gondii i koniugat (monoklonalne przeciwciała przeciwko T.gondii, znakowane peroksydazą). Podczas inkubacji przez 1 godzinę w temp. 37 C, przeciwciała przeciwko T.gondii, związane w poprzednim etapie, zwiążą teraz kompleks antygen T.gondii-koniugat. Nadmiar antygenu i koniugatu zostaje usunięty podczas płukania. Etap trzeci Wykrycie kompleksu: przeciwciało anty-igm przeciwciało swoiste anty-t.gondii antygen T.gondii koniugat, następuje po dodaniu roztworu zawierającego substrat dla peroksydazy i chromogen wywołujący reakcję barwną. Etap czwarty Po półgodzinnej inkubacji w temp. pokojowej, następuje zatrzymanie reakcji enzymatycznej po dodaniu 1 N kwasu siarkowego. Gęstość optyczną odczytuje się spektrofotometrycznie przy długości fali 450/620 nm. Uzyskana wartość OD jest proporcjonalna do ilości przeciwciał IgM przeciwko T.gondii w badanej próbce. Poziom przeciwciał IgM przeciwko T.gondii w badanej próbce jest określany przez porównanie OD próbki i OD surowicy wzorcowej cut-off. 4 - SKŁAD ZESTAWU Wszystkie odczynniki są przeznaczone wyłącznie do diagnostyki in vitro. Oznaczenie Charakterystyka odczynnika Opakowanie R1 Mikropłytka Mikropłytka: 12 pasków po 8 odłamywanych studzienek opłaszczonych przeciwciałami przeciwko ludzkim IgM. R2 Stężony roztwór płuczący R3 Kontrola ujemna R4a Kontrola cut-off Bufor do płukania: Bufor TRIS-NaCl ph 7.4, 1% Tween 20, stężony (10x) Konserwant: 0.01% thimerosal Kontrola nie reaktywna: Bufor TRIS-NaCl (ph 8 ± 0.2), albumina bydlęca, glicerol, E102, E122 Konserwant: < 0.5% Proclin 300 Kontrola cut-off: Ludzka surowica, słabo dodatnia pod względem przeciwciał IgM anty- T.gondii, oraz ujemna pod względem antygenu powierzchniowego wirusa hepatitis B (HBs-Ag) i przeciwciał anty-hiv1, anty-hiv2 i anty-hcv, Konserwant: < 0.01% thimerosal 1 płytka 1 fiolka 100 ml 1 fiolka 1 ml 1 fiolka 1 ml 4

R4b Kontrola dodatnia R6a Antygen R6b Koniugat (50x) Kontrola dodatnia: Bufor TRIS-NaCl (ph 8 ± 0.2), ludzka surowica, dodatnia pod względem przeciwciał IgM anty-t.gondii, oraz ujemna pod względem antygenu powierzchniowego wirusa hepatitis B (HBs-Ag) i przeciwciał anty-hiv1, anty-hiv2 i anty-hcv, albumina bydlęca, glicerol, E102 i E122 Konserwant: < 0.01% thimerosal i < 0.5% Proclin 300 Antygen T.gondii : Inaktywowany antygen T.gondii (szczep RH); liofilizowany Koniugat: Mysie przeciwciała monoklonalne przeciwko T.gondii (P30), znakowane peroksydazą chrzanu; stężony (50x) R7 Rozcieńczalnik Rozcieńczalnik próbek i koniugatu: Bufor TRIS-NaCl R8 Roztwór substratu TMB R9 Chromogen: Roztwór TMB R10 Roztwór zatrzymujący (ph 7.7 ± 0.15), albymina bydlęca, 0.1% Tween 20, Czerwień fenolowa Konserwant: < 0.01% thimerosal. Bufor do substratu: Roztwór kwasu cytrynowego i octanu sodu (ph 4.0), zawierający 0.015% H 2 O 2 i 4% DMSO. Chromogen: Roztwór zawierający czterometylobenzydynę (TMB) Roztwór zatrzymujący: 1 N kwas siarkowy Folia adhezyjna 1 fiolka 1 ml 2 fiolki 7 ml 1 fiolka 0. 4 ml 2 fiolki 80 ml 1 fiolka 60 ml 1 fiolka 5 ml 1 fiolka 28 ml 4 szt. 5 - ZALECENIA DLA UŻYTKOWNIKA Środki ostrożności Uzyskanie prawidłowego wyniku zależy od przestrzegania zasad Dobrej Praktyki Laboratoryjnej: Nie używać odczynników po upływie terminu przydatności. Podczas jednego oznaczenia używać wyłącznie odczynników o tym samym numerze serii. 5

Uwaga: Podczas danego oznaczenia można wymiennie używać następujących odczynników, lecz w jednym teście powinny być one z tej samej serii: roztwór płuczący (R2, oznaczony 10x na niebiesko), bufor do substratu (R8, oznaczony TMB buf. na niebiesko), chromogen (R9, oznaczony TMB sol. na zielono) oraz roztwór zatrzymujący (R10, oznaczony 1N na czerwono). Odczynników tych można używać również w innych testach Bio-Rad; informacji udzieli serwis techniczny. Przed użyciem przenieść odczynniki w celu stabilizacji na 30 minut do temp. pokojowej. Unikać zanieczyszczenia podczas rekonstytucji odczynników. Nie wykonywać testu w obecności kurzu ani reaktywnych par związków zasadowych, kwasów i aldehydów, które mogą wpływać na aktywność enzymatyczną koniugatu. Używać szkła dokładnie umytego i przepłukanego wodą destylowaną lub, co jest wskazane, materiałów jednorazowych. Nie dopuszczać do wysuszenia mikropłytki pomiędzy etapem płukania a dodawaniem kolejnego odczynnika. Reakcja enzymatyczna jest bardzo wrażliwa na działanie metali i jonów metali. Należy unikać kontaktu elementów metalowych z roztworami zawierającymi koniugat lub substrat. Roztwór substratu (bufor do substratu + chromogen) powinien być bezbarwny. Wystąpienie niebieskiej barwy kilka minut po rekonstytucji świadczy o nie przydatności roztworu do użycia. Roztwór należy przygotowywać w jednorazowym plastikowym pojemniku przy pomocy jednorazowych pipet lub końcówek lub używając szkła płukanego 1N kwasem solnym, wodą destylowaną i wysuszonego. Roztwór należy przechowywać w ciemności. Do każdej badanej próbki zmieniać końcówkę pipety. Płukanie studzienek jest istotnym etapem oznaczenia; należy przestrzegać przewidzianych cykli płukania oraz zwracać uwagę, czy studzienki są prawidłowo napełniane i całkowicie opróżniane. Nieprawidłowe płukanie jest przyczyną fałszywych wyników. Nigdy nie używać tego samego pojemnika na koniugat i roztwór substratu. Sprawdzać, czy pipety i sprzęt są prawidłowo nastawione oraz, czy aparatura prawidłowo pracuje. Nie zmieniać opisanej procedury. Higiena i bezpieczeństwo pracy Wszystkie odczynniki są przeznaczone wyłącznie do diagnostyki in vitro. Podczas pracy z odczynnikami należy używać rękawiczek jednorazowych. Nie pipetować ustami. Ludzkie surowice używane do przygotowania odczynników były ujemne pod względem antygenu powierzchniowego wirusa hepatitis B (HBs Ag), przeciwciał przeciwko wirusowi hepatitis C (anty-hcv) oraz przeciwciał anty- 6

HIV 1 i anty-hiv 2. Ponieważ nie ma metod absolutnie wykluczających obecność czynników zakaźnych, odczynniki pochodzące z materiału ludzkiego powinny być traktowane jako materiał potencjalnie zakaźny. Materiały mające kontakt z próbkami lub odczynnikami pochodzenia ludzkiego, w tym także zużyty roztwór płuczący, należy traktować jako skażone i dekontaminować przed wyrzuceniem. Unikać rozlania próbek i odczynników je zawierających. Rozlany odczynnik należy zmyć 10% roztworem podchlorynu. W przypadku rozlania kwasu należy go najpierw zneutralizować dwuwęglanem sodu, potem zmyć powierzchnię roztworem podchlorynu i wysuszyć bibułą. Materiał używany do czyszczenia wyrzucić do pojemnika na zanieczyszczone odpady. Próbki, materiały i produkty zanieczyszczone materiałem biologicznym dekontaminować przed wyrzuceniem. - przez moczenie w podchlorynie sodu o stężeniu końcowym 5% przez 30 minut, - lub autoklawowanie w temp. 121 C przez co najmniej 2 godziny Autoklawowanie przez co najmniej godzinę w temp. 121 C jest najlepszą metodą inaktywacji wirusów HIV i wirusów zapalenia wątroby. UWAGA: NIE AUTOKLAWOWAĆ ROZTWORÓW ZAWIERAJĄCYCH PODCHLORYN SODU. UWAGA: Niektóre odczynniki zawierają: Xi - drażniący *ProClin 300 < 0.5%: PRODUKT DRAŻNIĄCY R43 Substancja drażniąca dla skóry. S28/37 W przypadku kontaktu ze skórą, szybko przemyć dużą ilością wody z mydłem. Pracować w odpowiednich rękawiczkach Ze związkami chemicznymi należy postępować zgodnie z zasadami Dobrej Praktyki Laboratoryjnej. Unikać kontaktu skóry i błon śluzowych z buforem do substratu, chromogenem i roztworem zatrzymującym, ze względu na możliwość zatrucia, podrażnienia lub poparzenia. Karta charakterystyki substancji jest dostępna na życzenie. 6 - INNE NIEZBĘDNE MATERIAŁY I SPRZĘT Worteks Czytnik mikropłytek z filtrami 450 i 620 nm (*) Łaźnia wodna lub inkubator mikropłytek nastawiony na 37 ± 1 C (*) Pojemnik na materiał zakaźny i zanieczyszczone odpady Podchloryn sodu (wybielacz) i dwuwęglan sodu 7

Jałowa woda destylowana lub dejonizowana Cylindry miarowe na 25 ml, 50 ml, 100 ml i 1000 ml Rękawiczki lateksowe jednorazowe Okulary ochronne Bibuła Pipety lub multipipety automatyczne lub półautomatyczne, regulowane lub o stałej pojemności, pobierające od 10 µl do 1000 µl, oraz 1, 2 i 10 ml. Płuczka mikropłytek: manualna, półautomatyczna lub automatyczna (*) Próbówki jednorazowe (*) Dział Techniczny firmy udziela informacji na temat zalecanych aparatów 7 - PRZYGOTOWANIE I PRZECHOWYWANIE ODCZYNNIKÓW Zestaw należy przechowywać w temp. +2-8 C zgodnie z datą ważności, podaną na opakowaniu. Uwaga: Odczynniki są gotowe do użycia po osiągnięciu temp. pokojowej (+18-30 C). 1) Odczynniki gotowe do użycia Odczynnik 1 (R1): Mikropłytka Każda płytka zawierająca 12 pasków jest zapakowana oddzielnie w foliową torebkę. Należy ją przeciąć na wysokości 0.5 1 cm ponad linią i wyjąć potrzebną liczbę pasków. Pozostałe paski szczelnie zamknąć i przechowywać w temp. +2-8 C. Po otwarciu oryginalnego opakowania studzienki mikropłytek zachowują zdolność reakcyjną przez 1 miesiąc w temp. +2-8 C, przechowywane w szczelnie zamkniętej torebce. Odczynnik 3 (R3), Odczynnik 4a (R4a), Odczynnik 4b (R4b), Odczynnik 4c (R4c), Odczynnik 10 (R10): Odczynniki przechowywane w temp. +2-8 C są trwałe, również po otwarciu, zgodnie z datą ważności. 2) Odczynniki do rekonstytucji Odczynnik 2 (R2): Roztwór płuczący 10x stężony Rozcieńczyć wodą destylowaną 1:10, wymieszać. Do manualnego płukania 12 pasków potrzeba 350 ml rozcieńczonego roztworu płuczącego (R2d). Rozcieńczony roztwór do płukania można przechowywać 2 tygodnie w temp. +2-8 C. Roztwór stężony można przechowywać w temp. +2-25 C. Odczynnik 6a (R6a): Antygen T.gondii Liofilizowany antygen należy uwodnić przez dodanie do każdej fiolki 7 ml rozcieńczalnika R7. Zrekonstytuowany roztwór antygenu R6a-w powinien być całkowicie przezroczysty. Uwaga: Zmętnienie świadczy o nie przydatności odczynnika. 8

Rozpuszczony antygen R6a należy zużyć w czasie 30 minut od przygotowania. Nie wykorzystany roztwór można przechowywać 3 miesiące po podzieleniu na porcje po 1.1 ml i zamrożeniu w temp. -20 C. Rozmrożonych porcji nie zamrażać ponownie. Odczynnik 6b (R6b): Stężony koniugat Aby otrzymać rozcieńczony koniugat (R6b-w) na jedną mikropłytkę, należy rozcieńczyć 0.3 ml stężonego 50x koniugatu R6b w 15 ml rozcieńczalnika (R7). Dobrze wymieszać. Otrzymaną objętość podzielić na 10, aby otrzymać ilość koniugatu roboczego (R6b-w) potrzebną na 1 pasek zawierający 8 studzienek. Rozcieńczony koniugat należy zużyć w czasie 30 minut od przygotowania. Roztwór koniugatu: Odczynnik 6a-w (R6a-w) + Odczynnik 6b-w (R6b-w) Dodać równe objętości zrekonstytuowanego antygenu R6a i roboczego roztworu koniugatu R6b. Dla 1 płytki należy zmieszać 12 ml R6a i 12 ml R6b; dobrze wymieszać. Roztwór należy zużyć w czasie 4 godzin od przygotowania. Aby otrzymać ilość potrzebną na 1 pasek = 8 studzienek, podane objętości należy podzielić przez 12. Roztwór wywołujący reakcję barwną: Odczynnik R8 (R8)+ odczynnik 9 (R9): Rozcieńczyć chromogen (R9) w stosunku 1:11 w buforze do substratu (R8) (np. 1 ml R9 + 10 ml R8). Odczynnik jest stabilny przez 6 godzin w temp. pokojowej (+18-30 C), w ciemności. 8 POBIERANIE, OPRACOWYWANIE I PRZECHOWYWANIE MATERIAŁU DO BADAŃ 1. Zalecanym rodzajem próbek jest surowica lub osocze, pobrane na antykoagulant (EDTA, cytrynian, heparyna). 2. Postępowanie z próbkami: Próbki krwi należy pobrać zgodnie z rutynową procedurą, z wkłucia dożylnego. Próbki krwi przed odwirowaniem pozostawić do powstania skrzepu. Próbówki z próbkami przez cały czas powinny być zamknięte. Po odwirowaniu jak najszybciej oddzielić surowicę lub osocze od skrzepu i przenieść do szczelnie zamykanej próbówki. Jeśli test będzie wykonany w ciągu 7 dni, próbki można przechować w temp. +2-8 C. Jeśli test będzie wykonany później, lub próbki będą transportowane, należy je zamrozić w temp. -20 C lub niższej. Próbki można zamrozić i rozmrozić najwyżej 3 razy. Po rozmrożeniu próbki należy dokładnie wymieszać przed oznaczeniem. 1. Na oznaczenie nie wywiera wpływu obecność w surowicy 90 g/l albuminy, 100 mg/l bilirubiny, poziom lipemii odpowiadający 36 g/l trójglicerydów, ani hemoliza wynosząca do 10 g/l hemoglobiny. 9

2. Nie ogrzewać próbek. 9 - PROCEDURA Należy postępować dokładnie wg opisanej procedury. Podczas każdego testu oznaczyć surowice wzorcowe, co zapewni walidację testu. Przestrzegać zasad Dobrej Praktyki Laboratoryjnej. 1. Zanotować rozkład nanoszenia próbek i kontroli. 2. Przygotować rozcieńczony roztwór płuczący R2d (patrz rozdział 7). 3. Wyjąć potrzebną liczbę pasków (R1), pozostałe zamknąć ponownie w oryginalnym opakowaniu. 4. Przepłukać mikropłytkę jeden raz rozcieńczonym roztworem płuczącym (R2d). Osuszyć odwróconą mikropłytkę na bibule. 5. Rozcieńczyć badane próbki oraz kontrole w stosunku 1:101, dodając 10 µl próbki lub kontroli do 1 ml rozcieńczalnika (R7). Po rozcieńczeniu wymieszać próbki na worteksie. 6. Podczas manualnego wykonania testu, nanieść 200 µl rozcieńczonych kontroli oraz badanych próbek w następujący sposób: Studzienka 1A: Studzienka 1B: Studzienka 1C: Studzienka 1D: Studzienka 1E, 1F, 1G, etc.: 200 µl kontroli ujemnej (R3). 200 µl kontroli cut-off (R4a). 200 µl kontroli cut-off (R4a). 200 µl kontroli dodatniej (R4b). 200 µl próbki. 7. Zakryć szczelnie mikropłytkę folią adhezyjną. Inkubować w łaźni wodnej z termostatem lub w inkubatorze mikropłytek przez 1 godzinę ± 5 minut w temp. 37 C ± 1 C. 8. Przygotować roztwór koniugatu (R6a-w + R6b-w), łącząc równe objętości rozcieńczonego koniugatu (R6b-w) i zrekonstytuowanego antygenu T.gondii (R6a-w) na 15 minut przed końcem pierwszej inkubacji. Dobrze wymieszać (patrz rozdział 7). 9. Zdjąć folię adhezyjną. Zaaspirować zawartość studzienek (do pojemnika z podchlorynem sodu). Wykonać 3 cykle płukania rozcieńczonym roztworem płuczącym (R2d) i osuszyć odwróconą mikropłytkę na bibule (patrz rozdział 10). 10. Do wszystkich studzienek nanieść po 200 µl roztworu koniugatu i antygenu. Roztwór delikatnie wstrząsnąć przed użyciem. 11. Zakryć szczelnie mikropłytkę folią adhezyjną. Inkubować w łaźni wodnej z termostatem lub w inkubatorze mikropłytek przez 1 godzinę ± 5 minut w temp. 37 C ± 1 C. 12. Zdjąć folię. Zaaspirować zawartość studzienek (do pojemnika z podchlorynem sodu). Wykonać 4 cykle płukania jak powyżej i osuszyć odwróconą mikropłytkę na bibule. 10

13. Natychmiast nanieść do wszystkich studzienek po 200 µl roboczego roztworu substratu (R8 + R9, patrz p. 7). Pozostawić reakcję w ciemności na 30 ± 5 minut w temp. pokojowej (18-30 C). Nie zakrywać folią adhezyjną. 14. Zatrzymać reakcję enzymatyczną przez dodanie do każdej studzienki 100 µl R10, w tej samej kolejności, w której dodawany był roztwór substratu. 15. Wytrzeć spód mikropłytki i w ciągu 30 minut od zatrzymania reakcji zmierzyć gęstość optyczną (OD) każdej studzienki w czytniku mikropłytek, przy długości fali 450/620 nm. Przed odczytem chronić płytkę od światła. 16. Przed opisem wyników sprawdzić zgodność kolejności odczytu z ustalonym na początku rozkładem studzienek, oraz zgodność pomiędzy odczytem spektrofotometrycznym a wizualnym. 10 - PROCEDURA AUTOMATYCZNA Płukanie: Należy dokładnie przestrzegać podanych cykli płukania, aby optymalnie wykorzystać właściwości testu. - Płuczka LP 35: Po włączeniu płuczki zatwierdź parametry płukania. Wybierz numer pomiędzy 1 a 20 i zatwierdź. Następnie wybierz podstawową procedurę 086 i rodzaj płytki. Po nastawieniu parametrów płuczka powraca do trybu płukania. - Inne płuczki Należy skontaktować się z serwisem Bio-Rad w celu adaptacji i dostosowania procedur. Odczyt: Wszystkie obliczenia, walidacja wyników, wykreślenie krzywej wzorcowej i określenie statusu immunologicznego każdego pacjenta w stosunku do T.gondii (wynik w IU/ml), są wykonywane automatycznie przez czytnik mikropłytek wyposażony w filtry 450 i 620 nm, dostępny w Bio-Rad. Inne aparaty: Należy skontaktować się z serwisem Bio-Rad w celu adaptacji i dostosowania procedur. 11 - OBLICZENIE I INTERPRETACJA WYNIKÓW 1) Kontrola jakości Do każdego oznaczenia należy włączyć wszystkie surowice kalibracyjne. Aby wyniki testu były ważne, muszą być spełnione odpowiednie kryteria: Wartości gęstości optycznej: - OD R3 0.1 - OD R4b 1.0 Współczynniki: - OD R4a / OD R3 3.0 - OD R4b / OD R4a 1.8 11

Jeśli nie spełnione są kryteria kontroli jakości, test należy powtórzyć. 2) Obliczenie wartości cut-off, współczynnika próbki i indeksu fiksacji próbki Wartość cut-off OD M R4a jest to średnia wartość pomiarów OD, uzyskanego dla kontroli cut-off R4a (kontrola o niskim, granicznym poziomie przeciwciał). Wynik można przedstawić w postaci współczynnika: Współczynnik próbki = OD próbki / OD M R4a Jeśli gęstość optyczna próbki przekracza wartość cut-off OD M R4a, do wyrażenia wyniku można zastosować indeks fiksacji: Indeks fiksacji = (OD próbki - OD M R4a) / (OD R4b - OD M R4a)*10 3) Interpretacja wyników OD cut-off Współczynnik próbki Wynik Interpretacja/zalecenia OD próbki < OD M R4a x 0.80 Współczynnik < 0.8 Ujemny Prawdopodobnie nie ma zakażenia T.gondii OD próbki OD M R4a x 0.80 OD próbki < OD M R4a Współczynnik 0.8 Współczynnik < 1 Wątpliwy Wynik należy potwierdzić po 10-20 dniach dla drugiej próbki. Oznaczyć ilościowo IgG anty-t.gondii. OD próbki OD M R4a Współczynnik 1 Dodatni Wynik należy potwierdzić po 10-20 dniach dla drugiej próbki. Oznaczyć ilościowo IgG anty-t.gondii. Indeks fiksacji pozwala półilościowo wyrazić wyniki dla dwóch próbek od tego samego pacjenta. Wartość indeksu pomiędzy 0 i 1 charakteryzuje próbki z wynikiem wątpliwym. Ograniczenia testu Diagnozę niedawnego zakażenia pierwotniakiem można postawić dopiero po połączeniu danych klinicznych i wyników testu serologicznego. Wynik uzyskany dla jednej próbki nie wystarcza do potwierdzenia niedawnego zakażenia. Dopiero znamienny wzrost poziomu przeciwciał IgG anty-t.gondii w dwóch próbkach pobranych w odstępie co najmniej trzech tygodni, oznaczanych jednocześnie, pozwala diagnozować świeże zakażenie, powinien jednak być interpretowany jako świadectwo niedawno nabytego zakażenia. Obecność przeciwciał IgM przeciw T.gondii nie jest dowodem świeżego zakażenia pasożytem, gdyż przeciwciała IgM mogą utrzymywać się miesiącami, a czasem latami po zakażeniu. Po wykryciu przeciwciał IgM należy ilościowo oznaczyć poziom przeciwciał IgG w próbce pobranej 2-3 tygodnie później. Jeśli w przypadku pierwotnego zakażenia próbka jest pobrana zbyt wcześnie, przeciwciała przeciw T.gondii mogą jeszcze nie występować na wykrywalnym poziomie. Wówczas należy oznaczyć drugą próbkę, pobraną 2 tygodnie później. 4) Najczęstsze problemy Wyniki nie ważne lub nie interpretowalne najczęściej są spowodowane przez: Nie odpowiednie płukanie mikropłytki. 12

Zanieczyszczenie próbek ujemnych próbką o wysokim poziomie przeciwciał. Zanieczyszczenie roztworu substratu czynnikiem utleniającym (wybielacz, jony metali). Zanieczyszczenie roztworu zatrzymującego reakcję. 5) Przykład obliczenia Uwaga: Podane wartości służą jako przykład i nie należy podstawiać ich w miejsce uzyskanych wyników. Wyniki Studzienka OD (450/620 nm) Współczynnik próbki Indeks fiksacji R3 0.028 R4a 0.691 R4a 0.700 R4b 1.494 Wynik Próbka 1 0.109 0.15 0.0 Ujemny Próbka 2 1.096 1.57 5.0 Dodatni Próbka 3 2.096 3.01 17.5 Dodatni Walidacja testu - Wartości gęstości optycznej. OD R3 0.100 OD R4b 1.000 - Współczynniki. OD R4a / OD R3 3. OD R4b / OD R4a 1.8 Obliczenie wartości cut-off - OD M R4a = 12 - CHARAKTERYSTYKA I OGRANICZENIA TESTU Ocenę właściwości testu prowadzono oznaczając próbki pobrane do suchych próbówek, do próbówek z separatorem surowicy, próbówek zawierających aktywator skrzepu lub próbówek z różnymi antykoagulantami (EDTA, heparyna, cytrynian). 1. Właściwości Przedstawione poniżej dane, dotyczące właściwości testu Platelia Toxo IgM TMB uzyskano, badając świeże próbki surowicy, pobrane od kobiet w ciąży i od pacjentów z immunosupresją, a także oznaczając zamrożone próbki surowicy, uprzednio oznaczone jako dodatnie lub ujemne. 13

Badania porównawcze W teście Platelia Toxo IgM TMB i w innym, komercyjnym teście EIA oznaczano równolegle ogółem 607 próbek, pochodzących od losowo wybranych kobiet w ciąży. Podczas obliczeń do określenia względnej swoistości i czułości wyniki wątpliwe włączono do wyników dodatnich. Platelia Toxo IgM TMB Wynik Ujemny Wątpliwy Dodatni Ogółem Ujemny 556 1 8 565 Inny test EIA Wątpliwy 2 1 5 8 Dodatni 4 0 30 34 Ogółem 562 2 43 607 Wyniki badań (ośrodek 1) Względna swoistość 557 / 562 99.1% (97.8% - 99.7%) Względna czułość 41 / 45 91.1% (77.9% - 97.1%) Względna zgodność 587 / 607 96.7% (95.28% - 98.13%) Wyniki wątpliwe 2 / 607 0.33% Swoistość Swoistość testu Platelia Toxo IgM TMB badano w 2 niezależnych ośrodkach. Testowano surowice uprzednio oznaczone komercyjnymi testami w technice EIA. Na podstawie uzyskanych wyników określono swoistość testu. Do wyjaśnienia niezgodności stosowano test aglutynacji. Podczas obliczeń do określenia swoistości testu wyniki wątpliwe włączono do dodatnich. - ośrodek 1: 100% (263 / 263) - ośrodek 2: 100% (557 / 557) ogółem: 100% (820 / 820) Czułość Czułość testu Platelia Toxo IgM TMB badano w 2 niezależnych ośrodkach. Testowano surowice uprzednio oznaczone komercyjnymi testami w technice EIA. Na podstawie uzyskanych wyników określono czułość testu. Do wyjaśnienia niezgodności stosowano test aglutynacji. Podczas obliczeń do określenia czułości testu wyniki wątpliwe zaliczono do dodatnich. - ośrodek 1: 100% (80 / 80) - ośrodek 2: 100% (100 / 100) ogółem: 100% (180 / 180) 14

W teście Platelia Toxo IgM TMB oznaczano także próbki z panelu serokonwersji (ośrodek 1 i 2) oraz z panelu post-infekcyjnego (ośrodek 1): 97 próbek (ośrodek 1) 48 próbek od 14 pacjentów (ośrodek 2) Dla badanej populacji uzyskano 100% czułości dla tej populacji. Częstość występowania We Francji, w okolicach Paryża, wyniki dodatnie pod względem przeciwciał IgM przeciwko T.gondii uzyskano dla 7.4% badanych osób: 2. Powtarzalność Powtarzalność wewnątrz-testowa 4 próbki (1 ujemna i 3 dodatnie) oznaczano 30 razy w tym samym teście. Współczynnik zmienności dla próbek dodatnich był niższy niż 2%. Próbki PRÓBKA UJEMNA PRÓBKA DODATNIA 1 PRÓBKA ODATNIA 2 PRÓBKA DODATNIA 3 Średnia 0.06 1.17 1.81 2.92 Odchylenie Standardowe Współczynnik Zmienności 0.01 0.02 0.03 0.03 11.23 1.51 1.74 1.15 Powtarzalność pomiędzy-testowa 4 próbki (1 ujemną i 3 dodatnie) oznaczało dwóch techników w triplikacie przez 5 dni. Współczynnik zmienności dla próbek dodatnich był niższy niż 3%. 15

Próbki PRÓBKA UJEMNA PRÓBKA DODATNIA 1 PRÓBKA DODATNIA 2 PRÓBKA DODATNIA 3 Średnia 0.06 1.19 1.83 2.96 Odchylenie Standardowe Współczynnik Zmienności 0.01 0.027 0.05 0.08 10.92 2.28 2.98 2.78 3. Reakcje krzyżowe Oznaczono 239 próbek, dodatnich po względem markerów mogących dawać potencjalne reakcje krzyżowe. Swoistość wynosiła 100% (239 / 239) = brak reakcji krzyżowych. Dodatni marker dla: Liczba próbek Reaktywność CMV IgG 5 0 CMV IgM 5 0 VZV IgM 10 0 VZV IgG 10 0 Świnka IgG 10 0 Świnka IgM 8 0 Różyczka IgG 5 0 Różyczka IgM 5 0 EBV IgG 10 0 EBV IgM 9 0 Różyczka IgG 10 0 Różyczka IgM 10 0 HSV IgG 10 0 HSV IgM 10 0 HIV 63 0 Szpiczak 10 0 RF 37 0 ANA 10 0 HAMA 2 0 Ogółem 239 0 16

13 LITERATURA 1. ANDERSON S.E. and REMINGTON J.S. :The diagnosis of toxoplasmosis. Southern Med. J. 1975; 68, 1433-1443 2. BELANGER F., DEROUIN F., GRANGEOT-KEROS L., MEYER L. and the HEMOCO and SEROCO Study Groups : Incidence and risk factors of toxoplasmosis in a cohort of Human immunodeficiency virus-infected patients (1988-1995). Clinical Infectious Diseases 1999; 28, 575-581 3. BULLOCK S.L., and WALLS, K.W. : Evaluation of some of the parameters of the enzyme-linked immunospecific assay. J. Inf. Dis. (Suppl.) 136: 2, S279- S285 4. DAFFOS, FORESTIER F., CAPELLA-PAVLOVSKY M., THULLIEZ P., AUFRANT C., VALENTI D. and COX L. : Prenatal management of 746 pregnancies at risk for congenital toxoplasmosis. New Eng. J. Med. 1988; 318, 271-275 5. DECOSTER A., DARCY F., CARON A., VINATIER D., HOUZE DE L AULNOIS D., VITTU G., NIEL G., HEYER F., LECOLIER B., DELCROIX M., MONNIER J.C., DUHAMEL M. and CAPRON A. : Anti-P30 IgA antibodies as prenatal markers of congenital Toxoplasma infection. 1992; 87, 310-315 6. DEROUIN F., LEPORT C., PUEYO S., MORLAT P., LETRILLART B., CHENE G., ECOBICHON J.L., LUFT B., AUBERTIN J., HAFNER R., VILDE J.L., SALAMON R. and ANRS 005/ACTG 154 Trial Group Predictive value of Toxoplasma gondii antibody titres on the occurrence of toxoplasmic encephalitis in HIV-infected patients.aids 1996; 10, 1521-1527 7. DESMONTS G., COUVREUR J., THULLIEZ Ph., SAINT JOIGNY G. and COLIN J. : Sérodiagnostic de la Toxoplasmose, des méthodes simples, pour des questions précises. Le concours médical 1985; 107-03, 227-234 8. DUBEY J.P. and BEATTIE C.P. : Toxoplasmosis of animal and man. CRC Press (1988) 9. JENUM P.A., STRAY-PEDERSEN B., MELBY K.K., KAPPERUD G., WHITELAW A., ESKILD A. and ENG J. : Incidence of Toxoplasma gondii infection in 35 940 pregnant women in Norway and pregnancy outcome for infected women. J. Clin. Microbiol. 1998; 36, 2900-2906 10. JENUM P.A. and STRAY-PEDERSEN B. : Development of specific immunoglobulins G, M, and A following Toxoplasma gondii infection in pregnant women in Norway and pregnancy outcome for infected women. J. Clin. Microbiol. 1998; 36, 2907-2913 11. JENUM P.A., STRAY-PEDERSEN B. and GUNDERSEN A.G. : Improved Diagnosis of primary Toxoplasma gondii infection in early pregnancy by determination of anti-toxoplasma immunoglobulin G avidity. J. Clin. Microbiol. 1997 ; 35, 1972-1977 12. LAPPALAINEN M., KOSKELA P., KOSKINIEMI M., AMMALA P., HILESMAA V., TERAMO K., RAIVIO K.O., REMINGTON J.S., HEDMAN K.: Toxoplasmosis acquired during pregnancy: improved serodiagnosis based on avidity of IgG. J. Infect. Dis. 1993; 41, 155-158 17

13. LECOLIER B. and PUCHEU : Usefulness of IgG avidity analysis for the diagnosis of toxoplasmosis. Path. Biol. 1993; 42, 2 155-158 14. LEBECH M., JOYNSON D.H.M., SEITZ H.M. THULLIEZ P., GILBERT R.E., DUTTON G.N., OVLISEN B. and PETERSEN E., : Classification system and case definition of Toxoplasma gondii infection in immunocompetent pregnant women and their congenitally infected offspring. Eur. J. Microbiol. Infect. Dis. 1996; 15, 799-805 15. LUFT B.J. and REMINGTON J.S. : Toxoplasmic encephalitis. Clinical Infectious Diseases 1992; 15, 211-222 16. NAESSENS A., HEUNINCKX W., FOULON W. and LAUWERS S. : Evaluation of seven commercially available enzyme immunoassays for immunoglobulin G and M antibody detection of Toxoplasma gondii. Immunol. Infect. Dis. 1993; 3, 258-262 17. PETITHORY J.C., REITER-OWONA I., BERTHELOT F., MILGRAM M., DE LOYE J. and PETERSEN E. : Performance of European laboratories testing serum samples for Toxoplasma gondii. Eur. J. Microbiol. Infect. Dis. 1996; 15, 45-49 18. REMINGTON J.S. and DESMONTS G. : Toxoplasmosis in infectious disease of the fetus and newborn infant. JS Remington and JO Klein, eds. WB Saunders Co., Philadelphia 1976; 191-332 19. SABIN A.B., and FELDMAN H.A. : Dyes as microchemical indicators of a new immunity phenomenon affecting a protozoan parasite (Toxoplasma), Science 1948; 108: 660-663 20. SANTORO F., AFCHAIN D., PIERCE J.R., CESBRON J.Y., OVLAQUE G. and CAPRON A. : Serodiagnosis of Toxoplasma infection using a purified parasite protein P30. Clin. Exp. Immunol. 1885; 62, 262-269 21. SHARMA S.D., MULLENAX J., ARAUJO F.G., ERLICH H.A. and REMINGTON J.S. : Western Blot analysis of the antigens of Toxoplasma gondii recognized by human IgM and IgG antibodies. J. Immunol. 1983; 131: 977-983 22. SULHANIAN A., NUGUES C., GARIN J.F., PELLOUX H., LONGUET P., SLIZEWICZ B. and DEROUIN F. : Serodiagnosis of toxoplasmosis in patients with acquired or reactivating toxoplasmosis and analysis of the specific IgA antibody response by ELISA, agglutination and immunoblotting. Immunol. Infect. Dis. 1993; 3, 63-69 23. SULZER A.J. and HALL EC. : Indirect fluorescent antibody tests for parasitic diseases : IV Statistical study of variation in the indirect fluorescent antibody (IFA) test for toxoplasmosis. Amer. J. Epidemiol. 1967; 86: 401-407 24. WILSON M., REMINGTON J.S., CLAVET C., VARNEY G., PRESS C., WARE D. and the FDA TOXOPLASMOSIS AD HOC WORKING group : Evaluation of six commercial kits for detection of human immunoglobulin M. antibodies to Toxoplasma gondii. J. Clin. Microbiol. 1997; 35, 3112-3115 25. WONG S.Y. and REMINGTON J.S. : Biology of Toxoplasma gondii. AIDS 1993; 7, 299-316 18

STRESZCZENIE PROCEDURY WYKONANIA TESTU 1. Ustaw inkubator na 37 ± 1 0 C. 2. Rozcieńcz chromogen R9 1:11 w buforze do substratu R8 (roztwór do reakcji enzymatycznej). 3. Rozcieńcz wodą destylowaną 1:10 roztwór płuczący R2 10x (R2d). 4. Przepłucz jeden raz paski rozcieńczonym roztworem płuczącym (R2d). 5. Rozcieńcz badane próbki oraz kontrole w R7 stosunku 1:101. 6. Nanieść 200 µl rozcieńczonych kontroli i badanych próbek w sugerowany sposób: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A R3 S5 B R4a S6 C R4a S7 D R4b S8 E S1 S9 F S2 S10 G S3 S11 H S4 S12 7. Inkubacja przez godzinę w temp. 37 C ± 1 C. 8. Przygotuj roztwór T. gondii Ag (R6a-w) oraz roztwór koniugatu (R6b-w). 9. Zaaspirować zawartość studzienek i przepłukać 3 razy roztworem do płukania (R2d). 10. Do wszystkich studzienek nanieść po 200 µl roboczego roztworu koniugatu. 11. Inkubacja przez godzinę w temp. 37 C ± 1 C. 12. Zaaspirować zawartość studzienek i przepłukać 4 razy roztworem do płukania (R2d). 13. Do wszystkich studzienek nanieść po 200 µl roztworu do reakcji enzymatycznej (R8 + R9). 14. Inkubacja w ciemności, przez 30 minut, w temperaturze pokojowej (+18-30 C ). 15. Dodać do każdej studzienki po 100 µl roztworu zatrzymującego reakcję (R10). 16. Zmierzyć absorbancję w czytniku mikropłytek, przy długości fali 450/620 nm. 19

- CE marking (European directive 98/79/CE on in vitro diagnostic medical devices) - Marquage CE (Directive européenne 98/79/CE relative aux dispositifs médicaux de diagnostic in vitro) - Marcado CE (Directiva europea 98/79/CE sobre productos sanitarios para diagnóstico in vitro) - EG Markierung (Europäische Richtlinie 98/79/EG über In-vitro-Diagnostika) - Marchiatura CE (Direttiva europea 98/79/CE relativa ai dispositivi medico-diagnostici in vitro) - Marcação CE (Directiva europeia 98/79/CE relativa aos dispositivos médicos de diagnóstico in vitro) - CE-märkning (Europa direktiv 98/79/EG om medicintekniska produkter lör in vitro-diagnostik) - CE-mærkningen (Europa direktiv 98/79/EF om medicinsk udstyr til in vitro-diagnostik) IVD - For in vitro diagnostic use - Catalogue number - Pour diagnostic in vitro REF - Référence catalogue - Para diagnóstico in vitro - Número de catálogo - In vitro-diagnostikum - Bestellnummer - Per uso diagnostico in vitro - Numero di catalogo - Para uso em diagnóstico in vitro - Número de catálogo - In vitro diagnostik - Katalognummer - In vitro diagnose - Katalognummer - Manufacturer EC REP - Authorised Representative - Fabricant - Représentant agréé - Fabricante - Representante autorizado - Hersteller - Bevollmächtigter - Produttore - Distributore autorizzato - Fabricante - Representante Autorizado - Tillverkad av - Auktoriserad representant - Fremstillet af - Autoriseret repræsentant LOT - Batch code - Expiry date YYYY/MM/DD - Code du lot - Date de peremption AAAA/MM/JJ - Código de lote - Estable hasta AAAA/MM/DD - Chargen-Bezeichnung - Verwendbar bis JJJJ/MM/TT - Codice del lotto - Da utilizzare prima del AAAA/MM/GG - Código do lote - Data de expiração AAAA/MM/DD - Batch nr. - Utgångsdatum År/Månad/Dag - Batchkoden - Anvendes før ÅÅÅÅ/MM/DD - Storage temperature limitation - Consult Instruction for use - Limites de températures de stockage - Consulter le mode d'emploi - Temperatura limite - Consulte la instrucción para el uso - Lagerungstemperatur - Siehe Gebrauchsanweisung - Limiti di temperatura di conservazione - Consultare le istruzioni per uso - Limites de temperatura de armazenamento - Consulte o folheto informativo - Temperaturbegränsning - Se instruktionsanvisning vid användning - Temperaturbegrænsning - Se instruktion før brug i 162

The other languages which are required in conformity to the European Directive can be obtained from your local Bio-Rad agent. Les autres langues requises par la Directive Européenne sont disponibles auprès de votre représentant Bio-Rad local. Los otros idiomas que se requiren para la conformidad de la Directiva Europea puede ser obtenida en su oficina local Bio-Rad. Die anderen Sprachen, die in Übereinstimmung mit der europäischen IVD Direktive benötigt werden, erhalten Sie über Ihre lokale Bio-Rad Niederlassung. Le altre lingue che sono richieste in conformità con le Direttive Europee possono essere ottenute dal locale agente Bio-Rad. As restantes línguas, obrigatórias em conformidade com a Directiva Europeia, podem ser obtidas através da subsidiária Bio-Rad mais próxima de si. Övriga språk som krävs i enlighet med EG-direktivet kan erhållas från din lokala Bio-Rad-representant. De øvrige sprog som kræves i henhold til EU direktiv kan fås ved henvendelse til den lokale Bio-Rad leverandør. 163