ANTYGENY ASPERGILLUS SERODIAGNOSTYKA ASPERGILOZY METODĄ IMMUNOPRECYPITACJI

Transkrypt

1 ANTYGENY ASPERGILLUS y Aspergillus y Aspergillus fumigatus Wzorcowa surowica dodatnia Aspergillus fumigatus Wzorcowa surowica dodatnia Aspergillus SERODIAGNOSTYKA ASPERGILOZY METODĄ IMMUNOPRECYPITACJI 1

2 1- ZASTOSOWANIE KLINICZNE W ofercie firmy Bio-Rad znajdują się rodzaje antygenów Aspergillus służą do diagnostyki serologicznej aspergilozy metodą immunoprecypitacji. Diagnostyka aspergilozy poprzez wykrycie swoistych przeciwciał w surowicy pacjenta jest często łatwiejsza od bezpośredniej identyfikacji grzybów w hodowli. 2- ZASADA METODY y produkowane przez Bio-Rad mają zastosowanie w różnych reakcjach immunoprecypitacji, szczególnie w metodach: IMMUNOELEKTROFOREZY (IEP) IMMUNOELEKTROFOREZY PRZECIWSTAWNEJ (ES) Metody diagnostyki aspergilozy oparte na immunoprecypitacji charakteryzują się wysoką swoistością dzięki wykrywaniu przeciwciał skierowanych przeciw dwóm enzymom, chymotrypsynie i katalazie, zawartym w ekstrakcie antygenowym. Aktywność tych enzymów można wykryć w łukach precypitacyjnych. 3- POSTAĆ TESTU y Aspergillus fumigatus, nr kat fiolki liofilizowanych antygenów; zawartość każdej należy zrekonstytuować w 1 ml jałowej wody destylowanej (wystarcza na około 10 reakcji). - metaboliczny Aspergillus fumigatus - somatyczny Aspergillus fumigatus y Aspergillus, nr kat fiolki liofilizowanych antygenów; zawartość każdej należy zrekonstytuować w 1 ml jałowej wody destylowanej (wystarcza na około 10 reakcji). - metaboliczny Aspergillus flavus - metaboliczny Aspergillus nidulans - metaboliczny Aspergillus niger - metaboliczny Aspergillus terreus Dodatnia surowica wzorcowa Aspergillus fumigatus, nr kat fiolka liofilizowanej surowicy króliczej, zawierającej przeciwciała przeciw Aspergillus fumigatus; zawartość należy zrekonstytuować w 1 ml jałowej wody destylowanej. Dodatnia surowica wzorcowa Aspergillus nr kat fiolki liofilizowanej surowicy króliczej, zawierającej przeciwciała przeciw Aspergillus; zawartość każdej należy zrekonstytuować w 1 ml jałowej wody destylowanej (wystarcza na około 10 reakcji). - Surowica wzorcowa Aspergillus flavus - Surowica wzorcowa Aspergillus nidulans - Surowica wzorcowa Aspergillus niger - Surowica wzorcowa Aspergillus terreus 2

3 4- SKŁAD 2 rodzaje antygenów: metaboliczny, będący filtratem z 10-dniowej hodowli płynnej, wytrząsanej w temp. 30 C. somatyczny lub komórkowy, wyekstrahowany z młodej grzybni nie zawierającej zarodników (3-dniowa hodowla w temp. 30 C), oddzielonej od podłoża i zmiksowanej. 5- PRZECHOWYWANIE Odczynniki liofilizowane: w temp. 2-8 C, w suchym miejscu, są trwałe zgodnie z datą ważności podaną na opakowaniu zestawu. Odczynniki zrekonstytuowane: rozporcjowane mogą być przechowywane przez kilka miesięcy zamrożone w temp. -20 C. Nie zamrażać ponownie odczynników. 6- PRÓBKI 1. Materiałem do wykonania testu jest wyłącznie surowica pobrana do suchej próbówki. 2. Zalecane postępowanie z próbkami: - Próbki krwi należy pobrać zgodnie z rutynową procedurą. - Próbki krwi przed odwirowaniem pozostawić do powstania skrzepu. - Próbówki z próbkami przez cały czas powinny być zamknięte. - Po odwirowaniu jak najszybciej oddzielić surowicę i przenieść do szczelnie zamykanej próbówki. - Jeśli test będzie wykonany w ciągu 24 godzin, próbki można przechować w temp. 2-8 C. - Jeśli test będzie wykonany później, lub próbki będą transportowane, należy je zamrozić w temp. -20 C lub niższej. - Próbki można zamrozić i rozmrozić najwyżej 1 raz. - Po rozmrożeniu próbki należy dokładnie wymieszać przed oznaczeniem. 3. Nie badano wpływu na oznaczenie wysokiego poziomu albuminy ani bilirubiny. Nie używać próbek lipemicznych ani zhemolizowanych. 4. Nie ogrzewać próbek. 7- PROCEDURA A) INNE NIEZBĘDNE MATERIAŁY Barbital sodu (weronal, sól sodowa kwasu 5,5-dwuetylobarbiturowego) Kwas solny Woda destylowana Barbital (kwas 5,5-dwuetylobarbiturowy) Glicyna Bufor TRIS 0.05 M ph 7 Agaroza 30% H 2 O 2 Ester naftylowy N-acetylo-DL-fenyloalaniny 3

4 Dwumetyloformamid Diazoblue B B) IMMUNOELEKTROFOREZA (fot.1) Immunoelektroforezę (Grabar) przeprowadza się na mikroskopowym szkiełku podstawowym, w 1% żelu z oczyszczonego agaru lub agarozy w buforze weronalowym ph 8.2 (z dodatkiem mertiolanu 1/10 000). W żelu wyciąć rowek o wymiarach 60 mm długość x 2 szerokość mm i przy jego końcu wyciąć 2 dołki o średnicy 2 mm, w odległości 4 mm od siebie (patrz diagram). Do dołków nanieść po 20 µl nie rozcieńczonych antygenów. Do końców szkiełka na 90 przyłożyć napięcie 5 V/cm. Do centralnego rowka nanieść surowicę i przez 48 godzin pozwolić jej na dyfuzję w żelu, umieszczając go w wilgotnej atmosferze w temp. pokojowej (18-30 C). Trzeciego dnia zanurzyć szkiełka na 24 godziny w roztworze do płukania. Czwartego dnia odczytać wynik reakcji. Do odczytania delikatnie zaznaczonej precypitacji można zabarwić żel błękitem Coomasiego. C) IMMUNOELEKTROFOREZA PRZECIWSTAWNA (rys.1) Immunoelektroforezę przeciwstawną (Bussard) przeprowadza się w żelu agarozowym lub w octanie celulozy. Jest to prosta, czuła i szybka metoda, szczególnie przydatna do badania dużej liczby próbek. W żelu agarozowym na szkiełku podstawowym wyciąć dołki o średnicy 2 mm w sposób przedstawiony na diagramie. y nanieść od strony katody (-), surowice od strony anody (). Odległość pomiędzy dołkami powinna wynosić 6 mm. Do odpowiednich dołków nanieść antygen nie rozcieńczony oraz rozcieńczony ½ i ¼ i po 20 µl badanych próbek surowicy. Przyłożyć napięcie 5 V/cm na 90. Po zakończeniu migracji od razu odczytać wynik reakcji. Jeśli trzeba zabarwić żel błękitem Coomasiego, należy wykonać przedtem 2 kolejne płukania: w surowicy fizjologicznej (przez noc) i w wodzie destylowanej (przez 24 godziny), a następnie wysuszyć żel. Zaleca się równoległe wykonanie testu dla kontroli dodatniej, nanosząc ją w ten sam sposób, jak antygeny. D) IDENTYFIKACJA AKTYWNOŚCI ENZYMATYCZNEJ Powstające w wyniku reakcji immunoelektroforezy łuki precypitacyjne są oznaczane jako C i J (patrz diagram) i wykazują aktywność jednego z enzymów: C chymotrypsyny i J katalazy. Obecność tych enzymów można potwierdzić za pomocą swoistych reakcji (Biguet i wsp.) E) PRZYGOTOWANIE ODCZYNNIKÓW 1) BUFORY - BUFOR WERONALOWY ph 8.2 Barbital sodu g 1 N HCl 23 ml H 2 O do 1000 ml 4

5 - BARBITAL BARBITAL SODU TRIS GLICYNA (BBNaTG) ph 8.8 A Barbital sodu 65 g Barbital g H 2 O do 5000 ml B Glicyna Tris H 2 O 281 g 226 g do 5000 ml Po zmieszaniu równych objętości roztworu A i B powstaje bufor o ph 8.8 i osmolarności ) 1% AGAROZA (wag. / obj.) Agaroza H 2 O 10 g 500 ml Agarozę całkowicie rozpuścić w wodzie, doprowadzając do wrzenia, a następnie schłodzić do około 60 C i dodać lekko ogrzany: Bufor weronalowy ph ml lub Bufor BBNaTG ph ml (rozcieńczony 1:2 wodą destylowaną) 3) KATALAZA Do agarozy do immunoelektroforezy dodać 30% H 2 O 2, rozcieńczony w buforze Tris 0.05 M ph 7 (0.3 ml H 2 O 2 50 ml buforu). Reakcja dodatnia: wokół łuku precypitacyjnego występują pęcherzyki gazu. 4) CHYMOTRYPSYNA - ROZTWÓR A Ester naftylowy N-acetylo-DL-fenyloalaniny Dwumetyloformamid - ROZTWÓR B Diazoblue B Bufor Tris 0.05 M. ph mg 2 ml 10 mg 18 ml Oba roztwory A* i B* zmieszać bezpośrednio przed użyciem i w mieszaninie inkubować membranę do immunoelektroforezy przeciwstawnej przez 30 w temp. 37 C. Wyjąć membranę z mieszaniny i inkubować przez noc, w temp. 37 C, 18 ml roztworu B. Przepłukać membranę wodą. Reakcja dodatnia: purpurowe zabarwienie łuku precypitacyjnego będące wynikiem aktywności chymotrypsyny. 5

6 F) TABELA ZBIORCZA P.J. SVENDSEN MANUEL OF QUANTITATIVE IMMUNOELECTROPHORESIS, FURLARGET UNIVERSITY, OSLO. ED.: EXELSEN KROLL-WEEXE. ASPERGILLUS ANTIGENS ANALYSIS (tabela) Immunoelektroforeza Fot. 1 Immunoelektroforeza przeciwstawna 1 lub 2: y S: surowica pacjenta Sr: surowica wzorcowa Rys. 1 Bufory Napięcie Czas Barwienie 5 v/cm 90 Coomassie Blue buforze weronalowym ph 8.2 buforze BBNaTG ph 8.8 buforze weronalowym ph 8.2 buforze BBNaTG ph v/cm 60 5 v/cm v/cm 60 Coomassie Blue Katalaza Chymotrypsyna Fot. 2 Fot. 3 buforze weronalowym ph 8.2 buforze BBNaTG ph 8.8 buforze weronalowym ph 8.2 buforze BBNaTG ph v/cm v/cm 60 5 v/cm v/cm 60 Rozcieńczony H 2 O 2 * Reakcja dodatnia: pęcherzyki wokół łuku J Roztwory A* i B* Reakcja dodatnia: Purpurowa barwa łuku C * patrz punkt 6: procedura (E Przygotowanie odczynników) 8- INTERPRETACJA Wystąpienie charakterystycznego łuku precypitacji pomiędzy dołkiem z badaną surowicą a naniesionym do dołka antygenem Aspergillus potwierdza aspergilozę. Jako metoda szybsza, immunoelektroforeza przeciwstawna jest preferowana do testów przesiewowych. Uzyskane wyniki dodatnie należy potwierdzić metodą immunoelektroforezy. Wykrycie aktywności chymotrypsyny i katalazy potwierdza swoistość metody i uzyskanego wyniku. W aspergilozie oskrzelowo-płucnej oraz aspergilozie uogólnionej, dodatnie wyniki testów immunoprecypitacji uzyskuje się w 80-90% przypadków. W grzybniaku kropidlakowym reakcje są wysoce dodatnie: występuje 5 do 10 łuków oraz łuków C. W alergicznym zapaleniu oskrzeli reakcje dodatnie występują w 50% przypadków. 6

7 Przeciwciała precypitujące pojawiają się na późnym etapie zakażenia: w niektórych przypadkach zostają wykryte dopiero w kolejnej próbce, pobranej po upływie miesiąca po pierwszej. 9- CHARAKTERYSTYKA TESTU / KONTROLA JAKOŚCI A) ŁUKI PRECYPITACYJNE Właściwości antygenów Aspergillus są kontrolowane przy pomocy surowic dodatnich (surowicy króliczej anty-aspergillus, uzyskanej w wyniku immunizacji zwierząt mieszaniną wystandaryzowanych antygenów A.fumigatus i wystandaryzowanymi antygenami metabolicznymi A.flavus, A.niger, A.nidulans i A.terreus). Wystąpienie łuków precypitacyjnych podczas immunoelektroforezy (ph = 8.2) somatyczny A.fumigatus metaboliczny A.fumigatus metaboliczny A.flavus metaboliczny A.nidulans metaboliczny A.niger metaboliczny A.terreus Dodatnia surowica wzorcowa Anty- A.fumigatus Anty-A.flavus Anty- A.nidulans Anty-A.niger Anty-A.terreus 4 do 8 łuków do 5 łuków do 5 łuków do 5 łuków do 5 łuków - 3 do 5 łuków B) Aktywność enzymatyczna łuków precypitacyjnych Wykrycie aktywności enzymatycznej katalazy Wykrycie aktywności enzymatycznej chymotrypsyny Immunoelektroforeza (ph=8.2) po dodaniu H 2 O 2 pęcherzyki gazu wokół łuku J, potwierdza aktywność katalazy Immunoelektroforeza przeciwstawna (ph=8.2) po inkubacji z roztworami A i B, purpurowa barwa łuku C, potwierdza aktywność chymotrypsyny 10- KONTROLA JAKOŚCI PRODUCENTA Odczynniki zostały przygotowane zgodnie z systemem jakości, poczynając od materiałów wyjściowych, aż do ostatecznego produktu komercyjnego. Odczynniki 7

8 każdej serii podlegają oznaczeniu kontrolnemu i są dopuszczane do użytkowania, jeśli spełniają wymagane kryteria. Bio-Rad posiada protokoły produkcji i kontroli jakości każdej serii. 11- OGRANICZENIA METODY Do potwierdzenia aspergilozy niezbędne są dane kliniczne oraz wyniki badań radiologicznych i laboratoryjnych (mikrobiologiczne, histologiczne i serologiczne). Dodatni wynik uzyskany bez uwzględnienia całości obrazu klinicznego należy traktować ostrożnie. 8

9 12- RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES 1. BIGUET J.; TRAN VANKY P.; FRUIT J. ; ANDRIEU S. : Identification d une activité chymotrypsique au niveau de fractions remarquables de l extrait antigénique d Aspergillus fumigatus. Répercussion sur le diagnostic immunologique de l Aspergillose. REV. IMMUNOL. (1967) 31, pp DROUHET E.; CAMEY L. ; SEGRETAIN G. : Valeur de l immunoprécipitation et de l immunofluorescence indirecte dans les Aspergilloses bronchopulmonaires. ANN. INST. PASTEUR (1972) 123, pp DROUHET E. ; DUPONT B. : Infections mycosiques et parasitaires au cours des traitements immunosuppresseurs. PATHOL. BIOL. (1976) 24, pp LONGBOTTOM J.L. : Immunological aspects of infection and allergy due to Aspergillus Species. MUKOSEN (1978), supp. 1 pp SEGRETAIN G.; DROUHET ; MARIAT F.; Diagnostic de laboratoire en mycologie médicale (1979, 4e édition), MALOINE Edt. PARIS 150 pages. 20

10 - CE marking (European directive 98/79/CE on in vitro diagnostic medical devices) - Marquage CE (Directive européenne 98/79/CE relative aux dispositifs médicaux de diagnostic in vitro) - Marcado CE (Directiva europea 98/79/CE sobre productos sanitarios para diagnóstico in vitro) - EG Markierung (Europäische Richtlinie 98/79/EG über In-vitro-Diagnostika) - Marchiatura CE (Direttiva europea 98/79/CE relativa ai dispositivi medico-diagnostici in vitro) - Marcação CE (Directiva europeia 98/79/CE relativa aos dispositivos médicos de diagnóstico in vitro) - CE-märkning (Europa direktiv 98/79/EG om medicintekniska produkter lör in vitro-diagnostik) - CE-mærkningen (Europa direktiv 98/79/EF om medicinsk udstyr til in vitro-diagnostik) IVD - For in vitro diagnostic use - Catalogue number - Pour diagnostic in vitro REF - Référence catalogue - Para diagnóstico in vitro - Número de catálogo - In vitro-diagnostikum - Bestellnummer - Per uso diagnostico in vitro - Numero di catalogo - Para uso em diagnóstico in vitro - Número de catálogo - In vitro diagnostik - Katalognummer - In vitro diagnose - Katalognummer - Manufacturer EC REP - Authorised Representative - Fabricant - Représentant agréé - Fabricante - Representante autorizado - Hersteller - Bevollmächtigter - Produttore - Distributore autorizzato - Fabricante - Representante Autorizado - Tillverkad av - Auktoriserad representant - Fremstillet af - Autoriseret repræsentant LOT - Batch code - Expiry date YYYY/MM/DD - Code du lot - Date de peremption AAAA/MM/JJ - Código de lote - Estable hasta AAAA/MM/DD - Chargen-Bezeichnung - Verwendbar bis JJJJ/MM/TT - Codice del lotto - Da utilizzare prima del AAAA/MM/GG - Código do lote - Data de expiração AAAA/MM/DD - Batch nr. - Utgångsdatum År/Månad/Dag - Batchkoden - Anvendes før ÅÅÅÅ/MM/DD - Storage temperature limitation - Consult Instruction for use - Limites de températures de stockage - Consulter le mode d'emploi - Temperatura limite - Consulte la instrucción para el uso - Lagerungstemperatur - Siehe Gebrauchsanweisung - Limiti di temperatura di conservazione - Consultare le istruzioni per uso - Limites de temperatura de armazenamento - Consulte o folheto informativo - Temperaturbegränsning - Se instruktionsanvisning vid användning - Temperaturbegrænsning - Se instruktion før brug 82

11 The other languages which are required in conformity to the European Directive can be obtained from your local Bio-Rad agent. Les autres langues requises par la Directive Européenne sont disponibles auprès de votre représentant Bio-Rad local. Los otros idiomas que se requiren para la conformidad de la Directiva Europea puede ser obtenida en su oficina local Bio-Rad. Die anderen Sprachen, die in Übereinstimmung mit der europäischen IVD Direktive benötigt werden, erhalten Sie über Ihre lokale Bio-Rad Niederlassung. Le altre lingue che sono richieste in conformità con le Direttive Europee possono essere ottenute dal locale agente Bio-Rad. As restantes línguas, obrigatórias em conformidade com a Directiva Europeia, podem ser obtidas através da subsidiária Bio-Rad mais próxima de si. Övriga språk som krävs i enlighet med EG-direktivet kan erhållas från din lokala Bio-Rad-representant. De øvrige sprog som kræves i henhold til EU direktiv kan fås ved henvendelse til den lokale Bio-Rad leverandør. Bio-Rad 3, boulevard Raymond Poincaré Marnes-la-Coquette France Tel. : 33 (0) /2003 Fax.: 33 (0) code: