CANDIDA ANTIGENS. Antygeny Candida Wzorcowa surowica dodatnia Candida SERODIAGNOSTYKA KANDYDOZY METODĄ IMMUNOPRECYPITACJI

Transkrypt

1 CANDIDA ANTIGENS Antygeny Candida Wzorcowa surowica dodatnia Candida SERODIAGNOSTYKA KANDYDOZY METODĄ IMMUNOPRECYPITACJI 1

2 1 - ZNACZENIE KLINICZNE W ofercie firmy Bio-Rad znajdują się różne rodzaje antygenów Candida albicans do diagnostyki serologicznej kandydozy metodą immunoprecypitacji. Ze względu na częste ujemne wyniki hodowli krwi, duże znaczenie podczas diagnostyki kandydozy mają testy serologiczne, pozwalające wykryć w surowicy pacjenta swoiste przeciwciała przeciwko antygenom grzybów. W przypadku dodatniej hodowli krwi, metoda serologiczna pozwala zweryfikować pochodzenie izolatu i wykluczyć kontaminację. 2 - ZASADA METODY Antygeny Bio-Rad mogą być używane w różnych reakcjach immunoprecypitacji. Sa one przydatne szczególnie w dwóch technikach: IMMUNOELEKTROFOREZA (IEP) ELEKTROSYNEREZA (ES) 3 - POSTAĆ TESTU Candida albicans antigens, nr kat fiolki liofilizowanych antygenów do rekonstytucji w 1 ml jałowej wody destylowanej (około 10 reakcji). - Antygen metaboliczny Candida albicans - Antygen somatyczny Candida albicans Candida albicans positive control serum, nr kat fiolka liofilizowanej surowicy króliczej anty-candida albicans do rekonstutucji w 1 ml jałowej wody destylowanej. 4 - SKŁAD Antygeny (2 rodzaje): Antygen metaboliczny, uzyskany przez filtrację hodowli płynnej po 10 dniach inkubacji w temperaturze 30 C. Antygen somatyczny lub komórkowy, uzyskany z młodej hodowli grzybni (3 dni, bez zarodników) rozgniecionej i wytrząsanej w temperaturze 30 C. 5 - PRZECHOWYWANIE Odczynniki liofilizowane, przechowywane w temperaturze 2-8 C, w suchym miejscu, są trwałe zgodnie z datą ważności podaną na opakowaniu zestawu. Odczynniki zrekonstytuowane: odczynniki można przechowywać przez kilka miesięcy zamrożone w temperaturze -20 C, rozporcjowane. Nie zamrażać ponownie rozmrożonych odczynników. 6 - PRÓBKI 1. Materiałem do wykonania testu jest wyłącznie surowica pobrana do suchej próbówki. 2. Zalecane postępowanie z próbkami: - Próbki krwi należy pobrać zgodnie z rutynową procedurą. - Próbki krwi pozostawić do powstania skrzepu przed odwirowaniem. - Próbówki z próbkami przez cały czas powinny być zamknięte. - Po odwirowaniu jak najszybciej oddzielić surowicę i przenieść do szczelnie zamykanej próbówki. - Jeśli test będzie wykonany w ciągu 24 godzin, próbki można przechować w temperaturze 2-8 C. - Jeśli test będzie wykonany później, lub próbki będą transportowane, należy je zamrozić w temperaturze -20 C lub niższej. - Rekomendowane jest by próbki zamrażać jeden raz. Po rozmrożeniu próbki należy dokładnie wymieszać przed oznaczeniem. 2

3 3. Nie badano wpływu na oznaczenie wysokiego poziomu albuminy ani bilirubiny. Nie używać próbek lipemicznych ani zhemolizowanych. 4. Nie ogrzewać próbek. 7 - PROCEDURA A) INNE NIEZBĘDNE MATERIAŁY Barbital sodu (weronal) Kwas solny Woda destylowana Barbital Glicyna Bufor Tris 0.05 M ph 7 Agaroza B) IMMUNOELEKTROFOREZA (fot.1) Immunoelektroforezę (Grabar) można wykonać na mikroskopowym szkiełku podstawowym. Przygotować 1% żel z oczyszczonego agaru lub agarozy w buforze weronalowym ph 8.2 (z dodatkiem mertiolanu 1/10 000). W żelu wyciąć rowek o wymiarach 60 mm długości i 2 mm szerokości i po obu jego stronach wyciąć 2 dołki o średnicy 2 mm, w odległości 4 mm od siebie (patrz diagram). Do dwóch bocznych dołków nanieść 20 µl nie rozcieńczonego antygenu. Do końców szkiełka przyłożyć napięcie 5 v/cm na godzinę i 30 minut. Do centralnego rowka nanieść surowicę i przez 48 godzin pozwolić jej na dyfuzję w żelu, umieszczając go w komorze wilgotnej w temperaturze pokojowej (18-30 C). Trzeciego dnia zanurzyć szkiełka na 24 godziny w roztworze do płukania. Czwartego dnia odczytać wynik reakcji. Do odczytania delikatnych linii precypitacji może być niezbędne zabarwienie żelu błękitem Coomasiego. C) ELEKTROSYNEREZA (rys.1) Elektrosynerezę (Bussard) lub elektroforezę przeciwstawną można wykonać w żelu agarozowym lub w octanie celulozy. Jest to prosta, czuła i szybka metoda, pozwalająca na przebadanie dużej liczby surowic. W żelu agarozowym na szkiełku podstawowym wyciąć dołki w sposób przedstawiony na diagramie: antygeny nanieść od strony katody (-), surowice od strony anody (). Dołki powinny mieć 2 mm średnicy, a odległość pomiędzy nimi powinna wynosić 6 mm. Do odpowiednich dołków nanieść antygen nie rozcieńczony oraz rozcieńczony ½ i ¼ i po 20 µl badanych próbek surowicy. Przyłożyć napięcie 5 v/cm na godzinę i 30 minut. Po zakończeniu migracji od razu odczytać wynik. Jeśli niezbędne jest barwienie błękitem Coomasiego, należy je poprzedzić 2 kolejnymi płukaniami: w surowicy fizjologicznej (przez noc) i w wodzie destylowanej (przez 24 godziny), a następnie należy wysuszyć żel. Zaleca się równoległe wykonanie testu dla kontroli dodatniej w ten sam sposób, jak dla antygenów. D) PRZYGOTOWANIE ODCZYNNIKÓW 1) BUFORY - BUFOR WERONALOWY ph 8.2 Barbital sodu g 1 N HCl 23 ml do 1000 ml - BARBITAL BARBITAL SODU TRIS GLICYNA (BBNaTG) ph 8.8 A. Barbital sodu 65 g Barbital g do 5000 ml 3

4 B. Glicyna Tris 281 g 226 g do 5000 ml Po zmieszaniu równych objętości roztworu A i B powstanie bufor o ph 8.8 i osmolarności ) 1% AGAROZA (WAGOWO / OBJĘTOŚCIOWO) Agaroza 10 g 500 ml Agarozę zagotować, a następnie schłodzić (do około 60 C) i dodać: Bufor weronalowy ph ml lub Bufor BBNaTG ph ml (rozcieńczony 50% wodą destylowaną) E) TABELA ZBIORCZA Immuno-elektroforeza Immunoelektroforeza przeciwstawna 1 lub 2: Antygeny S: surowica pacjenta Sr: surowica wzorcowa Rys. 1 Fot.1 Bufory Napięcie Czas Barwienie 5 v/cm 90 Błękit minut Coomasiego bufor weronalowy ph 8.2 bufor barbital sodu tris glicyna weronal ph 8.8 bufor weronalowy ph 8.2 bufor barbital sodu tris glicyna weronal ph v/cm 60 minut 5 v/cm 90 minut 10 v/cm 60 minut Błękit Coomasiego 8 - INTERPRETACJA Wystąpienie charakterystycznych łuków precypitacji w teście immunoprecypitacji z zastosowaniem antygenu Candida albicans świadczy o zakażeniu drożdżakami Candida. Jako metoda szybsza od immunoelektroforezy, elektrosynereza jest metodą preferowaną do wykrywania zakażenia. Uzyskane wyniki dodatnie należy jednak potwierdzić metodą immunoelektroforezy. Łuki precypitacyjne stają się widoczne po pierwszych 24 godzinach, lecz ostateczny odczyt należy wykonać czwartego dnia. Po zabarwieniu błękitem Coomasiego stają się widoczne drobne szczegóły. Najczęściej powstają łuki precypitacyjne, wskazujące na aktywność enzymatyczną. Można je zidentyfikować w specjalnych reakcjach (Biguet i wsp.), lecz nie jest to niezbędne w rutynowej diagnostyce. Jeden łuk precypitacyjny wystarczy do potwierdzenia zakażenia Candida albicans. Liczba łuków wzrasta, gdy zakażenie obejmuje różne organy, podczas kandydemii i podwyższonej temperatury ciała, utrzymującej się przez ponad 10 dni, zapalenia wsierdzia, oraz w przewlekłej śluzówkowoskórnej kandydozie ziarniniakowej. 4

5 9 - WŁAŚCIWOŚCI TESTU / KONTROLA JAKOŚCI A) CANDIDA ALBICANS ANTIGENS Właściwości antygenów Candida albicans są kontrolowane przy pomocy surowicy dodatniej (surowicy króliczej anty-candida albicans, uzyskanej w wyniku immunizacji wystandaryzowanymi antygenami metabolicznymi i somatycznymi). Immuno-elektroforeza (ph = 8.2) Wystąpienie łuków precypitacyjnych Antygen somatyczny Antygen metaboliczny Antygen C.albicans / dodatnia surowica wzorcowa anty-c.albicans 3 do 6 łuków 2 do 4 łuków Antygen C.albicans / dodatnia surowica wzorcowa anty-aspergillus - - B) POSITIVE CONTROL SERUM Immuno-elektroforeza (ph = 8.2) Wystąpienie łuków precypitacyjnych Antygen somatyczny Antygen metaboliczny Dodatnia surowica wzorcowa anty-c.albicans / antygen C.albicans 3 do 6 łuków 2 do 4 łuków Dodatnia surowica wzorcowa anty- C.albicans / antygen Aspergillus KONTROLA JAKOŚCI PRODUCENTA Wszystkie odczynniki są produkowane oraz sprzedawane zgodnie z naszym Systemem Jakości, zaczynając od otrzymania surowców do wykonania finalnego produktu. Każda seria odczynników jest poddana kontroli jakości i dopuszczona do sprzedaży po uzyskaniu określonych kryteriów. Dane dotyczące procesu produkcji oraz kontroli jakości każdej serii odczynników są archiwizowane u producenta OGRANICZENIA METODY Rozpoznanie kandydozy można postawić na podstawie zgodności danych klinicznych oraz wyników badań radiologicznych i biologicznych (mikrobiologicznych, histologicznych i serologicznych); dodatnie wyniki tylko jednego parametru należy traktować ostrożnie LITERATURA 1. DROUHET E. et B. DUPONT : Infections mycosiques et parasitaires au cours des traitements immunosuppresseurs. PATHOL. BIOL. (1976) 24, DROUHET E. : Antigènes des Candida-Application à l'étude de l'immunité humorale et du diagnostic immunologique. REV. FRANC. ALLERGOL. (1976) 16, n 5, (33 réf.). 3. DROUHET E. ; Systemic Candidosis and its immunology. MYKOSEN (1978) Suppl 1, (16 réf.). 4. FRISK A. : Serological aspects of candidosis. CURRENT THERAP. RESEARCH. (1977) 22, n 1, (12 réf.). 5. HARDING S.A.; SANDFORD G.R.; MERZ W.G.: Three serologic tests for candidiasis. AM.J.CLIN.PATHOL. (1976) 65, n 6, pp (24 réf.). 6. SEGRETAIN G.; DROUHET E.; MARIAT F.: Diagnostic de laboratoire en mycologie médicale. (1979-4e edition). MALOINE Edit. PARIS, 150 pages. 2 1

6 - CE marking (European directive 98/79/CE on in vitro diagnostic medical devices) - Marquage CE (Directive européenne 98/79/CE relative aux dispositifs médicaux de diagnostic in vitro) - Marcado CE (Directiva europea 98/79/CE sobre productos sanitarios para diagnóstico in vitro) - EG Markierung (Europäische Richtlinie 98/79/EG über In-vitro-Diagnostika) - Marchiatura CE (Direttiva europea 98/79/CE relativa ai dispositivi medico-diagnostici in vitro) - Marcação CE (Directiva europeia 98/79/CE relativa aos dispositivos médicos de diagnóstico in vitro) - CE-märkning (Europa direktiv 98/79/EG om medicintekniska produkter lör in vitro-diagnostik) - CE-mærkningen (Europa direktiv 98/79/EF om medicinsk udstyr til in vitro-diagnostik) IVD - For in vitro diagnostic use - Catalogue number - Pour diagnostic in vitro REF - Référence catalogue - Para diagnóstico in vitro - Número de catálogo - In vitro-diagnostikum - Bestellnummer - Per uso diagnostico in vitro - Numero di catalogo - Para uso em diagnóstico in vitro - Número de catálogo - In vitro diagnostik - Katalognummer - In vitro diagnose - Katalognummer - Manufacturer EC REP - Authorised Representative - Fabricant - Représentant agréé - Fabricante - Representante autorizado - Hersteller - Bevollmächtigter - Produttore - Distributore autorizzato - Fabricante - Representante Autorizado - Tillverkad av - Auktoriserad representant - Fremstillet af - Autoriseret repræsentant LOT - Batch code - Expiry date YYYY/MM/DD - Code du lot - Date de peremption AAAA/MM/JJ - Código de lote - Estable hasta AAAA/MM/DD - Chargen-Bezeichnung - Verwendbar bis JJJJ/MM/TT - Codice del lotto - Da utilizzare prima del AAAA/MM/GG - Código do lote - Data de expiração AAAA/MM/DD - Batch nr. - Utgångsdatum År/Månad/Dag - Batchkoden - Anvendes før ÅÅÅÅ/MM/DD - Storage temperature limitation - Consult Instruction for use - Limites de températures de stockage - Consulter le mode d'emploi - Temperatura limite - Consulte la instrucción para el uso - Lagerungstemperatur - Siehe Gebrauchsanweisung - Limiti di temperatura di conservazione - Consultare le istruzioni per uso - Limites de temperatura de armazenamento - Consulte o folheto informativo - Temperaturbegränsning - Se instruktionsanvisning vid användning - Temperaturbegrænsning - Se instruktion før brug 65

7 The other languages which are required in conformity to the European Directive can be obtained from your local Bio-Rad agent. Les autres langues requises par la Directive Européenne sont disponibles auprès de votre représentant Bio-Rad local. Los otros idiomas que se requiren para la conformidad de la Directiva Europea puede ser obtenida en su oficina local Bio-Rad. Die anderen Sprachen, die in Übereinstimmung mit der europäischen IVD Direktive benötigt werden, erhalten Sie über Ihre lokale Bio-Rad Niederlassung. Le altre lingue che sono richieste in conformità con le Direttive Europee possono essere ottenute dal locale agente Bio-Rad. As restantes línguas, obrigatórias em conformidade com a Directiva Europeia, podem ser obtidas através da subsidiária Bio-Rad mais próxima de si. Övriga språk som krävs i enlighet med EG-direktivet kan erhållas från din lokala Bio-Rad-representant. De øvrige sprog som kræves i henhold til EU direktiv kan fås ved henvendelse til den lokale Bio-Rad leverandør. Bio-Rad 3, boulevard Raymond Poincaré Marnes-la-Coquette France Tel. : 33 (0) /2003 Fax.: 33 (0) code: