2015/04 1- ZASTOSOWANIE

Transkrypt

1 Platelia EBV-VCA IgG 1 płytka TEST IMMUNOENZYMATYCZNY DO JAKOŚCIOWEGO WYKRYWANIA PRZECIWCIAŁ KLASY IgG PRZECIWKO WIRUSOWI EPSTEIN-BARR (PRZECIWKO ANTYGENOWI KAPSYDOWEMU) W SUROWICY LUDZKIEJ 2015/04 1- ZASTOSOWANIE Test immunoenzymatyczny do jakościowego oznaczania przeciwciał klasy IgG przeciwko antygenowi kapsydowemu wirusa Epstein-Barr (VCA) w surowicy ludzkiej. Test Platelia EBV-VCA IgG, stosowany w połączeniu z innymi testami serologicznymi do wykrywania zakażenia wirusem EB, jak Platelia EBV-VCA IgM, Platelia EB-NA-1 IgG i Platelia EBV-EA-D IgG), służy do diagnostyki mononukleozy zakaźnej. 2 ZNACZENIE KLIN ICZNE Pierwszy opis wykrycia wirusa Epstain-Barr wykonali Epstain, Achong, i Barr w 1964 roku, na podstawie badania, w mikroskopie elektronowym, hodowli limfoblastów pobranych od pacjenta z chłoniakiem Burkitta. Wirus EB został włączony do rodziny herpeswirusów ze względu na charakterystyczną morfologię. Zakażenie EBV może manifestować się szerokim spektrum objawów klinicznych. Większość zakażeń pierwotnych jest wynikiem transmisji wirusa poprzez ślinę w dzieciństwie z manifestacją subkliniczną. W USA 50% dzieci wykazuje przeciwciał anty-ebv przed upływem 5 roku życia; 80% w chwili osiągnięcia dorosłości. Raportowano także zakażenia w wyniku transfuzji. U młodych osób dorosłych zakażenie wirusem EB może manifestować się w postaci mononukleozy zakaźnej, z nietypowymi objawami takimi jak zapalenie gardła z gorączką, zapalenie migdałków, uogólnione powiększenie węzłów chłonnych, złe samopoczucie, ból głowy, bóle mięśniowe, powiększenie śledziony i wątroby, wysypka i leukocytoza. Uczniowie szkół wyższych i personel wojskowy są często przytaczanymi przykładami populacji o wysokiej śmiertelności w przebiegu mononukleozy zakaźnej. Postuluje się, iż w wyniku pierwotnej infekcji EBV, limfocyty B stają się nosicielami genomu wirusa i odpowiadają za zakażenie latentne trwające w ciągu życia. Reaktywacja zakażenia EBV lub nasilona aktywacja EBV została udokumentowana u pacjentów z immunodeficytami oraz immunosupresją, np. u biorców przeszczepów, osób z nowotworami, kobiet w ciąży, osób w podeszłym wieku. Brak jest zgodny w zakresie rozpoznania EBV jako czynnika etiologicznego schorzenia zwanego przewlekłym zakażeniem EBV lub przewlekłą mononukleozą. Wirus Epsteina-Barr jest także związany z występowaniem dwóch nowotworów u ludzi, chłoniaka Burkitta i raka jamy nosowogardłowej. Metodą hybrydyzacji DNA wykazano obecność genomu EBV w materiałach biopsyjnych z tych nowotworów. Chłoniak Burkitta występuje przede wszystkim w saharyjskiej części Afryki, zwłaszcza u dzieci, oraz na Nowej Gwinei. U pacjentów z chłoniakiem diagnozuje się zazwyczaj malarię, sugeruje się, iż jest ona czynnikiem towarzyszącym. Rak jamy nosowo-gardłowej występuje w Azji, najwięcej przypadków jest notowanych w południowych Chinach, i może być związany z czynnikami genetycznymi i środowiskowymi. Chłoniaki z limfocytów B, podobne do afrykańskiego chłoniaka Burkitta, opisano ostatnio u chorych na AIDS. Pacjenci ci są predysponowani do zakażenia EBV z powodu stanu ogólnej immunosupresji. Obecnie, diagnostyka ostrej mononukleozy zakaźnej opiera się najczęściej na wykrywaniu przeciwciał heterofilnych. Jednakże, nawet dla 20% pacjentów z pierwotnym zakażeniem EBV można uzyskać wynik ujemny w teście na obecność przeciwciał heterofilnych. Ponadto, w przypadku komercyjnych, szybkich testów szkiełkowych do wykrywania przeciwciał heterofilnych, wyniki fałszywie dodatnie występują z częstością do 7%; wynikają one z błędów technicznych i subiektywnego odczytu aglutynacji krwinek czerwonych 3 ZASADA OZNACZENIA Testy immunoenzymatyczne (ELISA) firmy Bio-Rad wykorzystują zdolność materiałów biologicznych (np. antygenów) do adsorbowania się na plastikowych powierzchniach, takich jak polistyren (faza stała). Test Platelia EBV-VCA IgG wykorzystuje technikę ELISA, w której oczyszczony chromatografią powinowactwa antygen VCA jest związany z dołkami mikropłytki. W wyniku kontaktu antygenu z surowicą pacjenta, obecne w surowicy swoiste przeciwciała zwiążą się z antygenem, tworząc na fazie stałej kompleksy antygen-przeciwciało. Nadmiar przeciwciał zostaje usunięty podczas płukania. Następnie dodawany jest koniugat kozie przeciwciała przeciwko ludzkim immunoglobulinom IgG, znakowane peroksydazą, które wiążą się z utworzonym kompleksem antygen-przeciwciało. Nadmiar koniugatu zostaje usunięty podczas płukania, następnie dodawany jest substrat dla peroksydazy, czterometylobenzydyna (TMB). O obecności przeciwciał IgG przeciwko antygenowi EBV-VCA w badanej surowicy świadczy powstanie niebieskiej barwy. Zatrzymanie reakcji enzymatycznej następuje po dodaniu 1N kwasu siarkowego; studzienki zmieniają barwę na żółtą. Natężenie barwy jest proporcjonalne do stężenia przeciwciał w surowicy. Gęstość optyczną odczytuje się spektrofotometrycznie w czytniku mikropłytek. 1

2 Test Platelia EBV-VCA IgG wykorzystuje przede wszystkim antygen kapsydowy wirusa VCA do wykrywania przeciwciał klasy IgG swoistych dla zakażenia EBV. Przeciwciała te są wykrywane podczas nieobecności przeciwciał heterofilnych. Przeciwciała IgG anty-ebv-vca powstają wkrótce po zakażeniu i osiągają najwyższy poziom po 3-4 tygodniach. Następnie ilość ich spada i na niskim poziomie utrzymuje się przez całe życie. Czułość, swoistość i powtarzalność testu ELISA jest porównywalna do innych metod serologicznych, wykrywających przeciwciała, jak immunofluorescencja, odczyn wiązania dopełniacza, hemaglutynacja i radioimmunologia. 4 SKŁAD ZAESTAWU Odczynniki są przeznaczone wyłącznie do diagnostyki in vitro. Oznaczenie Charakterystyka odczynnika Opakowanie R1 Microplate Mikropłytka: 12 pasków po 8 studzienek opłaszczonych oczyszczonym (zinaktywowanym) antygenem kapsydu wirusa EB; w foliowej torebce z pochłaniaczem wilgoci. 1 R2 R3 R4a R4b R5 R6 R7 R9 R10 Concentrated Washing Solution (20x) Non Reactive control Positive Control I Positive Control II Calibrator Conjugate Diluent I Chromogen TMB Stopping Solution Stężony bufor do płukania (20x): Bufor Tris (ph 7.2 ± 0.2), 1% Tween 20 Konserwant: 0.1% Proclin 300 Kontrola ujemna (ludzka) pod względem przeciwciał IgG anty-ebv-vca, ujemna pod względem HBs Ag i przeciwciał anty-hcv, anty-hiv-1 i anty-hiv-2. Konserwant: azydek sodu (<0.1%) i pen/strep (0.01%) Kontrola dodatnia I (ludzka) pod względem przeciwciał IgG anty-ebv-vca, ujemna pod względem HBs Ag i przeciwciał anty-hcv, anty-hiv-1 i anty-hiv-2. Konserwant: azydek sodu (<0.1%) i pen/strep (0.01%) Kontrola dodatnia II (ludzka) pod względem przeciwciał IgG anty-ebv-vca, ujemna pod względem HBs Ag i przeciwciał anty-hcv, anty-hiv-1 i anty-hiv-2. Konserwant: azydek sodu (<0.1%) i pen/strep (0.01%) Kalibrator (ludzki) dla przeciwciał IgG anty-ebv-vca, ze swoistym dla zestawu czynnikiem, podanym na opakowaniu zewnętrznym, ujemny pod względem HBs Ag i przeciwciał anty-hcv, anty-hiv-1 i anty-hiv-2. Konserwant: azydek sodu (<0.1%) i pen/strep (0.01%) Koniugat: Kozie przeciwciała przeciwko ludzkim IgG, znakowane peroksydazą chrzanu Konserwant: 0.1% ProClin 300 i gentamycyna. Rozcieńczalnik I: gotowy do użycia bufor (ph 7.5 ± 0.2) Konserwant: 0.1% ProClin 300 Substrat/chromogen (gotowy do użycia): Czterometylobenzydyna (TMB) Nie używany odczynnik musi być szczelnie zamknięty; w przeciwnym razie w studzienkach powstanie osad. Roztwór zatrzymujący (gotowy do użycia): 1 N kwas siarkowy Instrukcja użytkownika 1 x 50 ml 1 x 0.4 ml 1 x 0.4 ml 1 x 0.4 ml 1 x 0.4 ml 1 x 16 ml 1 x 30 ml 1 x 15 ml 1 x 15 ml 1 szt. 5 ZALECENIA DLA UŻYTKOWNIKA Zalecenia Uzyskanie prawidłowego wyniku zależy od przestrzegania zasad Dobrej Praktyki Laboratoryjnej: Nie używać odczynników po upływie terminu przydatności. Podczas jednego oznaczenia używać wyłącznie odczynników o tym samym numerze serii. UWAGA: Podczas danego oznaczenia można wymiennie używać następujących odczynników, lecz w jednym teście powinny być one z tej samej serii: roztwór płuczący (R2), substrat/ chromogen (R9) oraz roztwór zatrzymujący (R10). Odczynników tych można używać wspólnie z testami Bio-Rad: Platelia EBV-VCA IgM, Platelia EB-NA-1 IgG i Platelia EBV-EA-D IgG; dalszych informacji udzieli nasz serwis techniczny. Przed użyciem przenieść odczynniki w celu stabilizacji na 30 minut do temp. pokojowej. Unikać zanieczyszczenia podczas rekonstytucji odczynników. Nie wykonywać testu w obecności kurzu ani reaktywnych par związków zasadowych, kwasów i aldehydów, które mogą wpływać na aktywność enzymatyczną koniugatu. Używać szkła dokładnie umytego i przepłukanego wodą destylowaną, lub, co jest wskazane, materiałów jednorazowych. Nie dopuszczać do wysuszenia mikropłytki pomiędzy etapem płukania a dodawaniem kolejnego odczynnika. Reakcja enzymatyczna jest bardzo wrażliwa na działanie metali i jonów metali. Należy unikać kontaktu elementów metalowych z roztworami zawierającymi koniugat lub substrat. Roztwór chromogen/substrat powinien być bezbarwny. Wystąpienie barwy świadczy o nie przydatności roztworu do użycia. Do każdej badanej próbki zmieniać końcówkę pipety. 2

3 Płukanie studzienek jest istotnym etapem oznaczenia; należy przestrzegać przewidzianych cykli płukania, oraz zwracać uwagę, czy studzienki są prawidłowo napełniane i całkowicie opróżniane. Nieprawidłowe płukanie jest przyczyną fałszywych wyników. Nigdy nie używać tego samego pojemnika na koniugat i roztwór substrat/chromogen. Sprawdzać, czy pipety i sprzęt są prawidłowo nastawione oraz, czy aparatura prawidłowo pracuje. Nie wprowadzać zmian do procedury oznaczenia. HIGIENA I BEZPIECZEŃSTWO PRACY Odczynniki przeznaczone wyłącznie do diagnostyki in vitro. Podczas pracy z odczynnikami należy używać rękawiczek jednorazowych. Nie pipetować ustami. Ludzkie surowice używane do przygotowania odczynników były ujemne pod względem antygenu powierzchniowego wirusa hepatitis B (HBs Ag), przeciwciał przeciwko wirusowi hepatitis C (anty-hcv) oraz przeciwciał przeciwko ludzkim wirusom niedoboru odporności HIV-1 i HIV-2. Ponieważ nie ma metod absolutnie wykluczających obecność czynników zakaźnych, odczynniki pochodzące z materiału ludzkiego powinny być traktowane jako materiał potencjalnie zakaźny. Materiały mające kontakt z próbkami lub odczynnikami pochodzenia ludzkiego, w tym także zużyty roztwór płuczący, należy traktować jako materiał zakaźny. Unikać rozlania próbek i odczynników je zawierających. W przypadku rozlania zmyć 10% roztworem podchlorynu sodu. W przypadku rozlania kwasu należy go najpierw zneutralizować dwuwęglanem sodu, wytrzeć i dopiero zmyć powierzchnię 10% roztworem podchlorynu i osuszyć bibułą. Materiał używany do czyszczenia wyrzucić do pojemnika na odpady. Próbki, materiały i produkty zanieczyszczone materiałem biologicznym zawsze należy dekontaminować przed wyrzuceniem. - przez moczenie w 5% podchlorynie sodu przez 30 minut, - lub autoklawowanie w temp. 121 C przez co najmniej 2 godziny Autoklawowanie przez co najmniej godzinę w temp. 121 C jest najlepszą metodą inaktywacji wirusów HIV i wirusa zapalenia wątroby typu B. UWAGA: NIE AUTOKLAWOWAĆ ROZTWORÓW ZAWIERAJĄCYCH PODCHLORYN. Z odczynnikami chemicznymi należy pracować i utylizować je zgodnie z zasadami Dobrej Praktyki Laboratoryjnej. Unikać kontaktu substratu/chromogenu oraz roztworu zatrzymującego ze skórą i błonami śluzowymi, ze względu na możliwość zatrucia, podrażnienia lub oparzenia. Niektóre odczynniki zawierają azydek sodu jako konserwant. Związek ten może reagować z miedzią i ołowiem w kanalizacji, tworząc wybuchowe azydki metali. Aby zapobiec gromadzeniu się azydków w rurach, po wylaniu inaktywowanych odczynników do zlewu należy spłukać dużą ilością wody. W celu zapoznania się z zaleceniami dotyczącymi zagrożeń i środków ostrożności związanych z niektórymi substancjami chemicznymi zawartymi w niniejszym zestawie należy skorzystać z piktogramów wskazujących rodzaj zagrożenia znajdujących się na etykietach i w informacjach zamieszczonych na końcu instrukcji obsługi. Karta charakterystyki jest dostępna na stronie internetowej 6 INNE NIEZBĘDNE MATERIAŁY I SPRZĘT Worteks Czytnik mikropłytek* z filtrami 450 nm Pojemnik na materiał zakaźny i zanieczyszczone odpady Podchloryn sodu (wybielacz) i dwuwęglan sodu Jałowa woda destylowana lub dejonizowana Cylindry miarowe Rękawiczki jednorazowe Okulary ochronne Bibuła Pipety lub multipipety automatyczne lub półautomatyczne, regulowane lub o stałej pojemności, pobierające 10 µl, 100 µl i1000 µl. Płuczka mikropłytek: manualna, półautomatyczna lub automatyczna * Próbówki jednorazowe * Informacji w sprawie wyposażenia w sprzęt udzieli serwis techniczny Bio-Rad 7 PRZYGOTOWANIE I PRZECHOWYWANIE ODCZYNNIKÓW Zestaw należy przechowywać w temp C zgodnie z datą ważności wydrukowana na opakowaniu (z wyjątkiem specjalnych instrukcji). Przed użyciem przenieść odczynniki w celu stabilizacji na 30 minut do temp. pokojowej ( C). Po użyciu, odczynniki od razu schować do lodówki. 3

4 1) Odczynniki gotowe do użycia Odczynnik 1 (R1): mikropłytka Każda płytka zawierająca 12 pasków jest zapakowana oddzielnie w foliową torebkę. Należy ją przeciąć na wysokości cm ponad linią i wyjąć potrzebną liczbę pasków. Pozostałe paski szczelnie zamknąć i przechowywać w temp C. Po otwarciu oryginalnego opakowania studzienki mikropłytek zachowują zdolność reakcyjną przez 1 miesiąc w temp. 2-8 C, przechowywane w szczelnie zamkniętej torebce. Odczynnik 3 (R3): kontrola ujemna Odczynnik 4a (R4a): kontrola dodatnia I Odczynnik 4b (R4b): kontrola dodatnia II Odczynnik 5 (R5): kalibrator Odczynnik 6 (R6): koniugat Odczynnik 7 (R7): rozcieńczalnik II Odczynnik 9 (R9): roztwór substrat / chromogen Odczynnik 10 (R10): roztwór zatrzymujący 2) Odczynniki do rekonstytucji: Odczynnik 2 (R2): roztwór płuczący stężony 20x 50 ml stężonego 20x roztworu rozcieńczyć w 1.0 l wody destylowanej lub dejonizowanej, wymieszać. Rozcieńczony roztwór do płukania można przechowywać 5 dni w temp C. 8 PRÓBKI Próbki krwi należy pobierać zgodnie z rutynową procedurą. Oznaczenie powinno być wykonane z nie rozcieńczonej surowicy. Jak najszybciej należy oddzielić surowicę od skrzepu lub czerwonych krwinek, aby uniknąć hemolizy. Silna hemoliza może wpływać na wynik testu. Próbki z widocznymi cząstkami organicznymi należy odwirować przed oznaczeniem. Cząstki lub agregaty fibryny w próbce mogą być przyczyną fałszywie dodatnich wyników. Jeśli test będzie wykonany w ciągu 5 dni, próbki można przechować w temperaturze +2-8 C. Jeśli test będzie wykonany później, należy je zamrozić w temp. -20 C na kilka miesięcy. Unikać powtórnego odmrażania/zamrażania. Do transportu próbki (najlepiej zamrożone) należy zapakować zgodnie z przepisami określającymi zasady przewożenia materiałów zakaźnych. NIE UŻYWAĆ PRÓBEK ZANIECZYSZCZONYCH, SILNIE LIPEMICZNYCH, ŻÓŁTACZKOWYCH, ZHEMOLIZOWANYCH I ZINAKTYWOWANYCH TERMICZNIE. 9 PROCEDURA OZNACZENIA Należy postępować dokładnie wg opisanej procedury. Podczas każdego testu używać kalibratora i surowic wzorcowych, co zapewni walidację testu. Przestrzegać zasad Dobrej Praktyki Laboratoryjnej. 1. Zanotować rozkład nanoszenia próbek i kontroli. 2. Przygotować rozcieńczony roztwór płuczący R2 (patrz p.7). 3. Wyjąć potrzebną liczbę pasków (R1), pozostałe zamknąć ponownie w oryginalnym opakowaniu. Paski do testu umieścić w ramce mikropłytki. Pozostawić 1 studzienkę na ślepą próbę, 3 na kalibrator, i po 1 na każdą z kontroli: ujemną, dodatnią I i dodatnią II A B1 S2 B R3 S3 C R4a S4 D R4b S5 E R5 S6 F R5 S7 G R5 S8 H S1 S9 4. Wszystkie próbki, kontrole i kalibrator przed naniesieniem wymieszać na worteksie Rozcieńczyć badane próbki, kalibrator i kontrole 1:81, (np. 10 µl µl) w rozcieńczalniku próbek I (R7), w próbówce lub na płytce do rozcieńczeń. 5. Do studzienek nanieść po 100 µl rozcieńczonych kontroli R3, R4a i R4b, kalibratora R5 oraz rozcieńczonych badanych próbek. Do pierwszej studzienki nanieść 100 µl rozcieńczalnika I (R7) jako ślepą próbę. 6. Inkubować mikropłytkę w temp. pokojowej (21-25 C) przez 20 ± 2 minuty. 7. Zaaspirować zawartość studzienek (do pojemnika z podchlorynem sodu). Wykonać 5 cykli płukania za pomocą 300 µl roztworu płuczącego i osuszyć odwróconą mikropłytkę na bibule. 8. Do wszystkich studzienek nanieść po 100 µl gotowego do użycia koniugatu (R6). 9. Inkubować mikropłytkę w temp. pokojowej (21-25 C) przez 20 minut ± 2 minuty. 10. Zaaspirować zawartość studzienek (do pojemnika z podchlorynem sodu). Wykonać 5 cykli płukania za pomocą 300 µl roztworu płuczącego i osuszyć odwróconą mikropłytkę na bibule. 4

5 11. Do wszystkich studzienek szybko nanieść po 100 µl roztworu chromogenu/substratu (R9). 12. Pozostawić reakcję w ciemności na 10 minut (± 2 minuty) w temp. pokojowej (21-25 C). Nie zakrywać folią adhezyjną. Studzienki zawierające przeciwciała IgG anty-ebv-vca zmienią barwę na niebieską. 13. Zatrzymać reakcję enzymatyczną przez dodanie do każdej studzienki 100 µl roztworu zatrzymującego. O zatrzymaniu reakcji świadczy zmiana barwy studzienek z niebieskiej na żółtą. 14. Odczekać co najmniej 5 minut i odczytać wyniki. Wytrzeć spód mikropłytki i w ciągu 30 minut od zatrzymania reakcji zmierzyć gęstość optyczną (OD) każdej studzienki w czytniku mikropłytek, przy długości fali 450 nm, wobec ślepej próby. (przed odczytem chronić płytkę przed światłem) 15. Przed opisem wyników sprawdzić zgodność kolejności odczytu z ustalonym na początku rozkładem studzienek, oraz zgodność pomiędzy odczytem spektrofotometrycznym a wizualnym. 10 OBLICZENIE I INTERPRETACJA WYNIKÓW 1. Obliczenie średniej absorbancji 1. Średnia wartość OD (gęstość optyczna) kalibratora cut-off: Obliczyć średnią dla trzech wartości uzyskanych dla kalibratora R5. Jeśli jedna z wartości odbiega od pozostałych o ponad 15%, należy ja pominąć i obliczyć średnią z dwóch pozostałych. 2. Współczynnik korekcji: współczynnik przypisany do każdej serii odczynników, stosowany jest w celu uwzględnienia codziennej zmienności temperatury pokojowej i czasu trwania poszczególnych etapów. Wartość współczynnika jest podana na etykiecie kalibratora. 3. Wartość OD kalibratora cut-off: Dla każdego oznaczenia wartość ta wynika z pomnożenia czynnika korekcji przez średnią OD kalibratora cut-off, obliczona w p Wartość ISR: Obliczenie współczynnika statusu immunologicznego (Immune Status Ratio) dla każdej próbki przez podzielenie wartości OD próbki przez wartość OD kalibratora cut-off, obliczona w p. 3. Przykład: Wartości OD uzyskane dla kalibratora = 0.380, 0.400, Średnia OD dla kalibratora = Czynnik korekcji = 0.5 Wartość cut-off kalibratora = 0.5 x = OD próbki = Wartość ISR = / = Walidacja testu 1. Ślepa próba (odczyt wobec powietrza): przy 450 nm OD < 0.150: OD RB < Kontrola ujemna R3 (odczyt wobec ślepej próby): przy 450 nm OD R Każdy kalibrator R5 (odczyt wobec ślepej próby): przy 450 nm OD R Kontrola dodatnia R4b (odczyt wobec ślepej próby): przy 450 nm OD R Wartość ISR dla kontroli ujemnej, kontroli dodatniej I i kontroli dodatniej II powinna mieścić się w zakresie podanym na fiolce. Jeśli nie spełnione są kryteria kontroli jakości, uzyskane wartości wykraczają poza podane zakresy, test należy powtórzyć. 3. Interpretacja wyników Wartość ISR (współczynnik statusu immunologicznego) należy interpretować następująco: Wartość Wynik Interpretacja 0.90 Ujemny Niewykrywalne przeciwciała IgM anty-ebv-vca Wątpliwy Próbki należy oznaczyć powtórnie 1.10 Dodatni Znamienne miano przeciwciał IgM anty-ebv-vca. Wskazuje na aktualne lub niedawne zakażenie. 1. Zalecane wyrażenie uzyskanego wyniku: W teście Platelia EBV-VCA IgG uzyskano następujący wynik: Nie można zamiennie przyjmować wartości uzyskanych inną metodą. Określona wartość uzyskana dla przeciwciał IgG nie może być uznawana za miano przeciwciał. 2. Diagnostyka zakażenia EBV, w celu uzyskania pełnego obrazu zakażenia, obejmuje analizę wyników uzyskanych dla czterech rodzajów przeciwciał: IgG przeciwko antygenowi jądrowemu (EB-NA), IgG przeciwko wczesnemu antygenowi (EBV-EA), IgG i IgM przeciwko antygenowi kapsydu (EBV-VCA). Właściwa diagnostyka zakażenia EBV opiera się na czterech powyższych testu, i zwyczajowo nie powinna bazować na wyniku pojedynczego oznaczenia. 3. Próbki dla których mimo powtórzenia oznaczenia uzyskano wynik wątpliwy, należy oznaczyć inną metodą, np. immunofluorescencyjną (IFA). Jeśli wynik nadal jest niejednoznaczny, należy pobrać i oznaczyć kolejną próbkę. 4. Charakterystykę testu prowadzono z wykorzystaniem jednego kalibratora. Jeżeli potrzebna jest liniowa krzywa odpowiedzi w teście, użytkownik powinien użyć minimum dwóch dodatkowych kalibratorów. 5. Aby ocenić wzrost miana przeciwciał w surowicach pobieranych sekwencyjnie, obie próbki muszą być oznaczone w duplikacie, w jednej serii. Aby stwierdzić znamienny wzrost poziomu przeciwciał, średnia wartość ISR dla obu (z ostrej fazy i z rekonwalescencji) musi być większa od

6 4. Prewalencja Około 80-90% dorosłej populacji w USA posiada przeciwciała IgG anty-ebv-vca. Miano przeciwciał może być różne w zależności od metody wykrywania. Przeciwciała IgG przeciwko EBV powstają wkrótce po zakażeniu i osiągają szczyt po 3-4 tygodniach od wystąpienia objawów. Następnie ilość ich stopniowo maleje i na niskim poziomie utrzymują się przez całe życie. Podwyższony poziom przeciwciał przeciwko EBV występuje u pacjentów z rakiem jamy nosowo-gardłowej, chłoniakiem Burkitta, chorobą Hodgkina, sarkoidozą i układowym toczniem rumieniowatym. 5. Ograniczenia metody 1. Postępowanie niezgodne z opisana procedurą może spowodować uzyskanie wyników wątpliwych. Wyniki nie interpretacyjne mogą być spowodowane: - Niedostatecznym płukaniem mikropłytki - Niewłaściwym czasem inkubacji - Zanieczyszczeniem próbek ujemnych próbkami dodatnimi - Zanieczyszczeniem roztworu substratu/chromogenu czynnikami utleniającymi (wybielacz, jony metali..) - Zanieczyszczeniem roztworu zatrzymującego Dla surowic zanieczyszczonych, żółtaczkowych, lipemicznych, zhemolizowanych lub inaktywowanych termicznie można uzyskać fałszywe wyniki; oznaczenie należy powtórzyć. Właściwości testu nie zostały ustalone dla próbek innych niż surowica. 2. Wynik testu należy interpretować w świetle objawów klinicznych i wyników innych testów laboratoryjnych. Test jest przeznaczony przede wszystkim do wykrywania przeciwciał IgG w próbkach surowicy. Dodatnie wyniki uzyskane dla noworodków należy interpretować ostrożnie, gdyż dziecko może mieć biernie przeniesione przez łożysko przeciwciała IgG od matki. U dzieci poniżej 6 miesiąca życia zdecydowanie lepszym wskaźnikiem zakażenia EB są przeciwciała IgM. Wyniki uzyskane w teście są jedynie elementem diagnostyki zakażenia. Należy je interpretować w świetle historii choroby pacjenta, objawów klinicznych i wyników innych testów laboratoryjnych. Nie badano właściwości testu dla próbek od pacjentów z rakiem jamy nosowo-gardłowej, chłoniakiem Burkitta, z innymi stanami uogólnionego powiększenia węzłów chłonnych, związanymi z zakażeniem EBV, oraz z innymi chorobami poza mononukleozą zakaźną, związanymi z zakażeniem EBV. Wynik uzyskany w teście Platelia EBV-VCA IgG dla pacjentów podlegających immunosupresji należy interpretować ostrożnie. Właściwości testu nie badano dla populacji dziecięcej. Znaczący wzrost poziomu przeciwciał wskazuje na niedawną stymulację antygenową. Brak wzrostu poziomu przeciwciał nie wyklucza niedawnego lub aktualnego zakażenia. Próbka może być pobrana na bardzo wczesnym etapie zakażenia, przed pojawieniem się wykrywalnego miana przeciwciał. W takich przypadkach, przy podejrzeniu zakażenia wirusem EB, zaleca się oznaczenie miana w klasie IgM, lub pobranie kolejnej próbki po dniach i jednoczesne oznaczenie obu próbek; serokonwersja potwierdza pierwotne zakażenie. Obecność przeciwciał IgG przeciwko wirusowi EB nie chroni przed zakażeniem. Obliczenie wartości ISR dla pojedynczej próbki nie koreluje z nasileniem objawów klinicznych mononukleozy zakaźnej. 11 CHARAKTERYSTYKA TESTU 1. Względna czułość i swoistość dla próbek surowicy Za pomocą testu Platelia EBV-VCA IgG oraz komercyjnego testu opartego na metodzie IFA oznaczono 205 losowo wybranych próbek surowicy. Próbki pochodziły od dawców krwi z dużego uniwersytetu w Kalifornii i z departamentu Zdrowia dla Wschodnich Stanów Zjednoczonych. Uzyskano następujące wyniki (tabela poniżej): Platelia EBV- VCA IgG Pierwszy test komercyjny IFA Wynik Dodatni Ujemny Dodatni Wątpliwy 1 0 Ujemny 2 9 Drugi komercyjny test IFA do wykrywania IgG antyebv-vca został użyty do wyjaśnienia wyników fałszywie dodatnich uzyskanych dla 2 próbek w badaniu pierwszym testem IFA. Wynik wątpliwy, uzyskany w teście Platelia EBV-VCA IgG został uznany jako nieokreślony i pominięto go podczas obliczenia względnej czułości i swoistości: Swoistość: 100% (11/11) Czułość: 100% (193/193) 6

7 2. Powtarzalność (zgodność wewnątrz-testowa) Powtarzalność wewnątrz-testową dla testu Platelia EBV-VCA IgG określono oznaczając 3 próbki surowicy (ujemną, niskododatnią i dodatnią) 10 razy na tej samej płytce. Średnią wartość ISR, odchylenie standardowe (SD) oraz procentowy współczynnik zmienności (%CV) dla każdej z próbek przedstawia tabela poniżej: Surowica n X S.D. CV% Ujemna Nisko dodatnia Dodatnia X S.D. C.V. = średnia wartość ISR = odchylenie standardowe = współczynnik zmienności 3. Odtwarzalność (zgodność pomiędzy-testowa) Odtwarzalność pomiędzy-testową dla testu Platelia EBV-VCA IgG określono oznaczając 3 próbki (ujemną, nisko-dodatnią i dodatnią) 10 razy każdą, przez 3 dni. Średnią wartość ISR, odchylenie standardowe (SD) oraz procentowy współczynnik zmienności (%CV) dla każdej z próbek przedstawia tabela: Surowica n X S.D. CV% Ujemna Nisko dodatnia Dodatnia C.V. dla próbek dodatnich był niższy niż 10%. 4. Reakcje krzyżowe W teście Platelia EBV-VCA IgG przebadano 8 próbek surowicy i uzyskano wynik ujemny. Próbka EBV ANA CMV VZV HSV 1 HSV 2 Platelia EBV-VCA IgG Ujemna Ujemna Ujemna Ujemna Ujemna Ujemna Ujemna Ujemna 12 LITERATURA 1. Epstein, M.A., B.B. Achong, and Y.M. Barr Virus Particles in Cultured Lymphoblasts from Burkitt's Lymphoma. Lancet. 1: Epstein, M.A., Y.M. Barr, and B.G. Achong Studies with Burkitt's Lymphoma. Wistar Inst. Sympos. Monogr. 4: Schooley, R.T. and R. Dolin Epstein-Barr Virus (Infectious Mononucleosis). In: Principles and Practice of Infectious Diseases, 2nd Edition. Mandell, G. L., R. G. Douglas, and J. E. Bennett. (eds). John Wiley and Sons, New York. pp Sumaya, C.V Serological Testing for Epstein-Barr Virus-Developments in Interpretations. J. Inf. Dis. 151 (6): Tobi, M., and S.E. Straus Chronic Epstein-Barr Virus Disease: A Workshop Held by the National Institute of Allergy and Infectious Diseases. Ann. Intern. Med. 103 (6(pt.1)): Sumaya, C.V Infectious Mononucleosis and Other EBV Infections: Diagnostic Factors. Lab Mgmt. Oct., Birx, D.L., R.R. Redfield, and G. Tosarto Defective Regulation of Epstein-Barr Virus Infection in Patients with Acquired Immunodeficiency Syndrome (AIDS) or AIDSRelated Disorders. New Eng. J. Med. 314 (14): Ablashi, D.V., et. al Firsh International Symposium on Epstein-Barr Virus and Associated Malignant Diseases. Cancer Res. 45 (8): Chang, R.S., H. Thompson, and S. Pomerantz Epstein-Barr Virus Infections in Homosexual Men with Chronic, Persistent Generalized Lymphadenopathy. J. Inf. Dis. 151 (3): Bakerman, S Enzyme Immunoassays. Lab. Mgmt. August, pp Engvall, E. and P. Perlmann Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA. III. Quantitation of Specific Antibodies by Enzyme-labeled Anti-Immunoglobulins in Antigen Coated Tubes. J. Immunol. 109: Engvall, E., and P. Perlman Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, (ELISA) Quantitative Assay of Immunoglobulin G. Immunochemistry. 8:

8 13. Engvall, E., and P. Perlman Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA. Peeters. H., ed. Proteins of the Biological Fluids. Proceedings of the Nineteenth Colloquium, Brugge, Oxford. Pergamon Press. pp Engvall, E., K. Jonsson, and P. Perlman Enzyme-Linked Immunosorbent Assay. II. Quantitative Assay of Protein Antigen, Immunoglobulin-G, By Means of Enzyme- Labelled Antigen and Antibody-Coated tubes. Biochem. Biophys. Acta., 251: Van Weeman, B.K. and A.H.W.M. Schuurs Immunoassay Using Antigen- Enzyme Conjugates. FEBS Letter. 15: CDC/NIH Manual Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories, 3rd edition. Pp Lennette, E.T Epstein-Barr Virus. In: Manual of Clinical Microbiology, Fourth Edition. E.H. Lennette, A. Balows, W.J. Hausler, Jr. and H.J. Shadomy, eds. ASM. 67: Tishchendorf, P., et. Al Development and Persistence of Immunity to Epstein- Barr Virus in Man. J. Infect Dis. 1222: Evans, A.S The Spectrum of Infections with EB Virus: A Hypothesis. J. Infect. Dis. 124: Niederman, J.C., R.W. McCollum, G. Henle, and W. Henle Infectious Mononucleosis, Clinical Manifestations in Relation to EB Virus Antibodies. Jama 203: Henle, W. and G. Henle Epstein-Barr Virus: The Cause of Infectious Mononucleosis. In: Oncogenesis and Herpesviruses. I.M. Biggs and L.H. Payne, eds. Int Agency Res. Cancer Sci. #2, Lyon, pp

9 9

10 TRINITY BIOTECH USA, 2823 Grits Road, Jamestown, NY, TRINITY BIOTECH, Bray, Co. Wicklow Ireland Bio-Rad 3, boulevard Raymond Poincaré Marnes-la-Coquette France Tel. : +33 (0) Fax. : +33 (0) /04 10