MONOLISA HBc IgM PLUS

Transkrypt

1 MONOLISA HBc IgM PLUS 96 testów IMMUNOENZYMATYCZNY TEST PRZESIEWOWY DO WYKRYWANIA PRZECIWCIAŁ KLASY IgM PRZECIWKO ANTYGENOWI RDZENIOWEMU WIRUSA HEPATITIS B Wyrób do diagnostyki in vitro Kontrola jakości producenta Wszystkie produkty są wytwarzane i wprowadzane do obrotu przez Bio-Rad podlegają naszemu systemowi jakości poczynając od momentu otrzymania surowców aŝ do chwili wprowadzenia do obrotu ostatecznego produktu komercyjnego. KaŜda seria odczynników jest poddana kontroli jakości i jest dopuszczona do sprzedaŝy po spełnieniu określonych kryteriów jakości. Dane dotyczące procesu produkcji oraz kontroli jakości kaŝdej serii produkcyjnej są archiwizowane u producenta.

2 SPIS TREŚCI 1 - ZASTOSOWANIE TESTU 2 - ZNACZENIE KLINICZNE 3 - ZASADA TESTU 4 - SKŁAD ZESTAWU 5 - INNE NIEZBĘDNE MATERIAŁY 6 - ŚRODKI OSTROśNOŚCI 7 - HIGIENA I BEZPIECZEŃSTWO PRACY 8 - PRZYGOTOWANIE ODCZYNNIKÓW 9 - PRZECHOWYWANIE I TRWAŁOŚĆ ODCZYNNIKÓW 10 - POBIERANIE I PRZECHOWYWANIE PRÓBEK 11 - PROCEDURA 12 - SPEKTROFOTOMETRYCZNA WERYFIKACJA PIPETOWANIA SUBSTRATU 13 - OBLICZENIA I INTERPRETACJA WYNIKÓW 14 - CHARAKTERYSTYKA TESTU 15 - OGRANICZENIA TESTU 16 - LITERATURA 2

3 1- ZASTOSOWANIE TESTU MONOLISA HBc IgM PLUS jest testem immunoenzymatycznym typu kanapkowego, przeznaczonym do jakościowego wykrywania przeciwciał klasy IgM przeciwko antygenowi rdzeniowemu wirusa zapalenia wątroby typu B. 2 - ZNACZENIE KLINICZNE W przebiegu zakaŝenia wirusem zapalenia wątroby typu B, jako pierwsze w odpowiedzi pojawiają się przeciwciała anty-hbc. Są one najczęściej wykrywane w początkowej fazie zakaŝenia związanego z występowaniem antygenu HBs. Podczas zakaŝenia pierwotnego, początkowo syntetyzowane są przeciwciała klasy IgM, a następnie przeciwciała klasy IgG. Przeciwciała IgM zwykle utrzymują się przez kilka tygodni do kilku miesięcy od zakaŝenia, i stopniowo zanikają w okresie rekonwalescencji. Przeciwciała IgG są wytwarzane mogą pozostać przez szereg lat po wyzdrowieniu. Wykrycie swoistych przeciwciał IgM anty-hbc wskazuje na niedawne zakaŝenie wirusem hepatitis B i jest szczególnie przydatne w okresie spadku antygenemii HBs, zanim pojawią się przeciwciała anty-hbs. W niektórych przypadkach moŝna wykryć niski poziom przeciwciał IgM anty-hbc podczas przewlekłego zakaŝenia wirusem hepatitis B. 3 - ZASADA TESTU MONOLISA HBc IgM PLUS jest dwustopniowym testem immunoenzymatycznym typu kanapkowego, w którym faza stała wychwytuje zawarte w surowicy przeciwciała klasy IgM, poczym dodawany jest koniugat (rekombinowany antygen białkowy HBc, uzyskany w komórkach droŝdŝy, znakowany peroksydazą). Faza stała zawiera 12 pasków po 8 studzienek, opłaszczonych kozimi przeciwciałami przeciwko ludzkim IgM. Antygen HBc jest bezpośrednio związany z peroksydazą. Wykonanie testu składa się z następujących etapów: 1. Inkubacja próbek i surowic kontrolnych w obecności przeciwciał przeciwko ludzkim IgM utrwalonych na fazie stałej. 2. Płukanie, a następnie inkubacja kompleksów związanych na fazie stałej z antygenem HBc znakowanym peroksydazą. 3. Po odpłukaniu nie związanego koniugatu następuje wykrycie aktywności enzymatycznej związanej z fazą stałą, przez dodanie substratu. 4. Zahamowanie reakcji, odczyt gęstości optycznej przy długości fali 450/ nm i interpretacja wyników. 3

4 4 - SKŁAD ZESTAWU Odczynniki są przeznaczone wyłącznie do diagnostyki in vitro. Objętość odczynników wystarcza do wykonania 96 oznaczeń w 1 do 12 niezaleŝnych testach. OZNACZENIE CHARAKTERYSTYKA ODCZYNNIKA OPAKOWANIE R1 R2 R3 Mikropłytka: 12 pasków po 8 studzienek opłaszczonych przeciwciałami przeciwko ludzkim IgM BUFOR PŁUCZĄCY (20x) Bufor Tris NaCl, ph 7.4 Konserwant: Proclin 300 (0.04%) Surowica kontrolna ujemna (ludzka): Dostarczona w odpowiednim rozcieńczeniu. Gotowa do uŝycia. Ludzka surowica, ujemna pod względem HBs Ag i przeciwciał anty-hiv1, anty-hiv-2 i anty-hcv Konserwant: azydek sodu < 0.1% R4 Surowica kontrolna dodatnia (ludzka): Dostarczona w odpowiednim rozcieńczeniu. Gotowa do uŝycia. Ludzka surowica, dodatnia pod względem HBs Ag, HBe Ag i przeciwciał IgM anty-hbc, ujemna pod względem przeciwciał anty-hiv1, anty-hiv-2 i anty- HCV. Inaktywowana fotochemicznie. Konserwant: azydek sodu < 0.1% R5 Rozcieńczalnik próbek: Bufor Tris NaCl ph=7.4 z dodatkiem 0.1% Tween 20 i 1% albuminy bydlęcej Konserwant: azydek sodu < 0.1%. Barwnik: Czerwień fenolowa R6 Liofilizowany Koniugat: Znakowany peroksydazą rekombinowany antygen HBc R7 Rozcieńczalnik koniugatu: Bufor Tris NaCl ph=7.4 z dodatkiem 0.1% Tween 20 Konserwant: 0.01% mertiolan sodu. Barwnik: Czerwień fenolowa R8 R9 Bufor do substratu peroksydazy: Kwas cytrynowy / octanu sodu Nadtenek wodoru. Dwumetylosulfotlenek (DMSO) Substrat-chromogen: Roztwór TMB Czterometylobenzydyna (TMB) 1 płytka 1 fiolka 70 ml 1 fiolka 2.5 ml 1 fiolka 2.5 ml 1 fiolka 100 ml 2 fiolki sqf 2 x 6 ml 1 fiolka 12 ml 1 fiolka 60 ml 1 fiolka 5 ml R10 Roztwór zatrzymujący: 1 N H 2SO 4 1 fiolka 28 ml 5 - INNE NIEZBĘDNE MATERIAŁY NIE ZAWARTE W ZESTAWIE Woda destylowana lub dejonizowana Podchloryn sodu (wybielacz) i dwuwęglan sodu. Bibuła. Rękawiczki jednorazowe. Próbówki jednorazowe polistyrenowe (12 x 75 mm). Pojemnik na materiał zakaźny i zanieczyszczone odpady. Pipety manualne lub półautomatyczne, regulowane lub o stałej pojemności, pobierające 10 µl, 100 µl i 1 ml. Cylindry miarowe na 10 ml, 200 ml i 1000 ml. Wytrząsarka- worteks Płuczka mikropłytek: manualna, półautomatyczna lub automatyczna * Łaźnia wodna z termostatem lub inkubator mikropłytek* nastawiony na 37 ± 1 C Czytnik mikropłytek* z filtrami 450 i nm * Informacji w sprawie wyposaŝenia w sprzęt udzieli serwis techniczny Bio-Rad 4

5 6 - ŚRODKI OSTROśNOŚCI Uzyskanie prawidłowego wyniku zaleŝy od przestrzegania zasad Dobrej Praktyki Laboratoryjnej: Nazwa testu, oraz specjalny numer identyfikacyjny danego testu są podane na obramowaniu kaŝdej mikropłytki. Ten sam numer identyfikacyjny znajduje się teŝ na kaŝdym pasku. Monolisa HBc IgM PLUS: Specific ID number = 57. Sprawdź specjalny numer identyfikacyjny przed kaŝdym uŝyciem testu, jeŝeli numeru identyfikacyjnego brak lub róŝni się od podanego powyŝej, paska nie naleŝy uŝywać Nie uŝywać odczynników po upływie terminu przydatności. Podczas jednego oznaczenia uŝywać wyłącznie odczynników o tym samym numerze serii. UWAGA: Podczas danego oznaczenia moŝna uŝywać odczynników z innej ale identycznej serii w przypadku: roztworu płuczącego (R2, oznaczonego: 20x na zielono), buforu do peroksydazy (R8, oznaczonego: TMB buf na niebiesko), chromogenu (R9, oznaczonego: TMB 11x na purpurowo) oraz roztworu zatrzymującego reakcję (R10, oznaczonego: 1N na czerwono) Odczynników tych moŝna uŝywać w niektórych innych testach Bio-Rad. Ponadto, prawidłowo rekonstytuowany roztwór płuczący (R2, oznaczony: 20x na zielono) moŝe być uŝywany wymiennie z dwoma innymi roztworami płuczącymi obecnymi w zestawach testowych firmy Bio-Rad (R2, oznaczony: 10x na niebiesko lub 10x na pomarańczowo);pod warunkiem stosowania jednego rodzaju buforu w serii oznaczeń. Szczegółowych informacji udzieli serwis techniczny. Przed uŝyciem przenieść odczynniki na 30 minut do temp. pokojowej (18-30 C). Unikać zanieczyszczenia podczas rekonstytucji odczynników. Nie wykonywać testu w obecności reaktywnych par związków (zasadowych, kwasów i aldehydów) oraz kurzu, mogących wpływać na aktywność enzymatyczną koniugatu. UŜywać dokładnie umytego szkła wypłukanego w wodzie destylowanej lub najlepiej sprzętu jednorazowego. Płukanie: Dokładnie przestrzegać procedury płukania w celu uzyskania optymalnych właściwości testu. Reakcja enzymatyczna jest bardzo wraŝliwa na działanie jonów metali. Unikać kontaktu elementów metalowych z roztworami enzymu i koniugatu. Roztwór wykrywający reakcję (bufor do substratu + substrat-chromogen) powinien mieć zabarwienie róŝowe. Zmiana tej barwy wkrótce po rekonstytucji świadczy o nie przydatności roztworu do uŝycia. Roztwór naleŝy przygotowywać w jednorazowym plastikowym pojemniku przy pomocy jednorazowych pipet lub tipsów, lub uŝywając szkła płukanego 1N kwasem solnym, a następnie wodą destylowaną i wysuszonego. Roztwór naleŝy przechowywać w ciemności. Do kaŝdej badanej próbki uŝywać nowej końcówki. Nigdy nie uŝywać tego samego pojemnika do nanoszenia koniugatu i roztworu substratu. Sprawdzać prawidłowe nastawienie pipet i kontrolować pracę aparatury. Nie wprowadzać zmian do procedury. Podczas kaŝdego testu oznaczać surowice kontrolne. Jeśli w roztworze substratu występują zawieszone cząstki, naleŝy pozwolić im opaść na dno przed pipetowaniem. (Nie interferują one z oznaczeniem). 7 - HIGIENA I BEZPIECZEŃSTWO PRACY Wszystkie odczynniki zestawu słuŝą do diagnostyki in vitro. Podczas pracy z odczynnikami uŝywać rękawiczek jednorazowych. Nie pipetować ustami. Dodatnia kontrola R4 została inaktywowana fotochemicznie. Ludzkie surowice uŝywane do przygotowania kontroli ujemnej R3 były ujemne pod względem antygenu powierzchniowego wirusa hepatitis B (HBs Ag), przeciwciał przeciwko wirusowi hepatitis C (HCV Ab) oraz przeciwciał przeciwko ludzkim wirusom upośledzenia odporności (HIV 1 Ab i HIV 2 Ab). Ludzkie surowice uŝywane do przygotowania kontroli dodatniej R4 były ujemne pod względem przeciwciał przeciwko wirusowi hepatitis C (HCV Ab), oraz przeciwciał przeciwko ludzkim wirusom upośledzenia odporności (HIV 1 Ab i HIV 2 Ab). PoniewaŜ nie ma metod absolutnie wykluczających obecność HIV, wirusów hepatitis B lub C i innych czynników zakaźnych, odczynniki pochodzące z materiału ludzkiego oraz badane próbki powinny być uwaŝane za materiał potencjalnie zakaźny i traktowane z naleŝytą ostroŝnością. Sprzęt mający kontakt z badanymi próbkami i odczynnikami pochodzenia ludzkiego oraz zuŝyty bufor płuczący, naleŝy traktować jako materiał potencjalnie zakaźny. 5

6 Unikać rozlania próbek i odczynników je zawierających. Zanieczyszczone powierzchnie czyścić 10% roztworem podchlorynu sodu. Jeśli nastąpiło zanieczyszczenie kwasem, naleŝy go najpierw zneutralizować dwuwęglanem sodu, następnie przemyć wybielaczem i osuszyć bibułą. Materiał uŝywany do czyszczenia wyrzucić do pojemnika na skaŝone odpady. Próbki, odczynniki pochodzenia ludzkiego i materiały zanieczyszczone biologicznie dekontaminować przed wyrzuceniem: - przez moczenie w 5% podchlorynie sodu (1 objętość podchlorynu na 10 objętości zanieczyszczonego płynu lub wody) przez 30 minut, - lub przez autoklawowanie w temp. 121 C przez minimum 2 godziny. UWAGA: Nie autoklawować roztworów zawierających podchloryn sodu. Nie zapominać o neutralizacji i/lub autoklawowaniu roztworów, zuŝytego buforu płuczącego i innych płynów zawierających materiał biologiczny przed wylaniem ich do zlewu. Karta Charakterystyki Substancji jest dostępna na Ŝyczenie. Unikać kontaktu substratu, chromogenu i kwasu ze skórą i śluzówkami (niebezpieczeństwo zatrucia, podraŝnienia lub oparzenia). Podczas pracy z odczynnikami chemicznymi naleŝy przestrzegać zasad Dobrej Praktyki Laboratoryjnej. Niektóre odczynniki są konserwowane azydkiem sodu. Związek ten moŝe reagować z miedzią i ołowiem, tworząc azydki metali o właściwościach wybuchowych. Aby zapobiec akumulacji azydku w zlewie i rurach, po wylaniu inaktywowanych odczynników zawierających azydek spłukać zlew duŝą ilością wody. Niektóre odczynniki zawierają: ProClin 300 (0.04%, 0.1% i/lub 0.5%) Xi - PRODUKT DRAśNIĄCY R43: MoŜe wywołać uczulenie w kontakcie ze skórą. S28-37: W razie kontaktu ze skórą, szybko przemyć duŝą ilością wody z mydłem. Nakładać odpowiednie rękawice Karta charakterystyki substancji (MSDS) jest dostępna na Ŝyczenie 8 - PRZYGOTOWANIE ODCZYNNIKÓW Przed uŝyciem odczynniki powinny osiągnąć temperaturę pokojową (18-30 C). 1) Odczynniki gotowe do uŝycia: Odczynnik 1 (R1): Mikropłytka KaŜda ramka zawierająca 12 pasków zapakowana jest w torebkę z zamknięciem strunowym. Torebkę naleŝy przeciąć noŝyczkami lub skalpelem cm powyŝej zamknięcia. Otworzyć opakowanie, wyjąć potrzebną liczbę pasków. Pozostałe paski umieścić w torebce. Torebkę naleŝy szczelnie zamknąć i przechowywać w temperaturze +2-8 C. Odczynnik 3 (R3): Surowica kontrolna ujemna Odczynnik 4 (R4): Surowica kontrolna dodatnia Odczynnik 5 (R5): Rozcieńczalnik próbek Odczynnik 7 (R7): Rozcieńczalnik koniugatu Odczynnik 10 (R10): Roztwór zatrzymujący reakcję 2) Odczynniki do rekonstytucji Skoncentrowany bufor płuczący R2 (20x) Rozcieńczyć wodą destylowaną w stosunku 1:20. Wymieszać. Przygotować 800 ml na jedną płytkę zawierającą 12 pasków.. Roboczy roztwór koniugatu (R6 + R7) Rekonstytuować zawartość 1 fiolki liofilizowanego koniugatu (R6) dodając 6 ml rozcieńczalnika (R7). Odczekać 2 minuty, wymieszać. Podczas uŝywania 1 do 6 pasków, wystarczy rekonstytuować 1 fiolkę koniugatu (R6). Kiedy uŝywa się ponad 6 pasków, naleŝy rekonstytuować 2 fiolki koniugatu i ich zawartość zmieszać w tym samym pojemniku. Roboczy roztwór substratu (R8 + R9) Rozcieńczyć chromogen (R9) w stosunku 1:11 w buforze do substratu (R8) (np. 1 ml odczynnika R ml odczynnika R8). 6

7 9 - PRZECHOWYWANIE I TRWAŁOŚĆ ODCZYNNIKÓW Zestaw przechowywać w temperaturze +2-8 C. KaŜdy z odczynników, przechowywany w tej temperaturze, moŝe być wykorzystywany do daty waŝności podanej na opakowaniu (z wyjątkiem specjalnych zaleceń). R1: Po otwarciu torby, paski mikropłytki przechowywane w szczelnie zamkniętej torbie, w temperaturze +2-8 C, mogą być wykorzystywane przez 4 tygodnie. R2: Rozcieńczony bufor płuczący moŝe być przechowywany w temperaturze C przez dwa tygodnie. StęŜony bufor płuczący (R2) moŝe być przechowywany w temperaturze C. R6+R7: Po rekonstytucji odczynnik moŝe być uŝywany przez 3 tygodnie jeŝeli jest przechowywany w temperaturze +2-8 C. R8+R9: Po rekonstytucji, odczynnik przechowywany w ciemności, w temperaturze pokojowej ( C) moŝe być uŝywany przez 6 godzin. 10 POBIERANIE I PRZECHOWYWANIE PRÓBEK Próbki krwi naleŝy pobierać zgodnie z rutynową procedurą. Oznaczenie powinno być wykonywane z nie rozcieńczonej surowicy lub osocza, pobranego na antykoagulant (EDTA, heparynę, cytrynian). Jak najszybciej oddzielić surowicę lub osocze od czerwonych krwinek lub skrzepu, aby zapobiec hemolizie. Silna hemoliza wpływa na jakość uzyskanego wyniku. Próbki z widocznymi cząstkami organicznymi naleŝy odwirować przed oznaczeniem. Cząstki lub agregaty fibryny w próbce mogą być przyczyną fałszywie dodatnich wyników. Jeśli test będzie wykonany w ciągu 7 dni, próbki moŝna przechować w temperaturze +2-8 C. Jeśli test będzie wykonany później, naleŝy je zamrozić w temp. -20 C lub niŝszej. Osocze naleŝy szybko rozmraŝać, umieszczając na kilka minut w łaźni wodnej o temp. 40 C, aby uniknąć precypitacji fibryny. Nie uŝywać próbek, które były więcej niŝ 3 razy zamraŝane i rozmraŝane. Do transportu próbki naleŝy zapakować zgodnie z przepisami określającymi zasady przewoŝenia materiałów zakaźnych. NIE UśYWAĆ PRÓBEK ZANIECZYSZCZONYCH, HIPERLIPEMICZNYCH ANI SILNIE ZHEMOLIZOWANYCH UWAGA: Na oznaczenie nie wywiera wpływu obecność w surowicy do 90 g/l albuminy, 100 mg/l bilirubiny, poziom lipemii odpowiadający 36 g/l trioleiny, ani hemoliza wynosząca do 10 g/l hemoglobiny PROCEDURA 1. Przygotować rozcieńczony bufor płuczący R2. 2. Rozcieńczyć badane próbki 1/101 rozcieńczalnikiem próbek (R5) (10 µl surowicy µl odczynnika R5). Kontrola ujemna(r3) i dodatnia (R4) są gotowe do uŝycia. Nie wymagają one rozcieńczenia jak próbki. 3. Wyjąć z torebki ramkę i potrzebną liczbę pasków, pozostałe paski zamknąć ponownie w oryginalnym opakowaniu. 4. Wszystkie studzienki napełnić ml roztworu płuczącego. Zaaspirować całą zawartość studzienek. Powtórzyć płukanie, a następnie osuszyć odwróconą mikropłytkę na bibule. UŜywając automatycznej płuczki, naleŝy stosować ten sam cykl płukania. 5. Nanieść nie rozcieńczane surowice kontrolne oraz badane próbki rozcieńczone 1/101 w następującej kolejności: Studzienki A1, B1, C1: 100 µl kontroli ujemnej (R3) Studzienki D1, E1, F1: 100 µl kontroli dodatniej (R4) Studzienki G1, H1, itd.: 100 µl badanych próbek ZaleŜnie od wykorzystywanego systemu, moŝliwe jest modyfikowanie pozycji kontroli i rozkładu nanoszonych odczynników Kontrola dodatnia i ujemna są gotowe do uŝycia i nie muszą być rozcieńczane jak próbki. 6. Zakryć szczelnie mikropłytkę folią adhezyjną. Inkubować przez 30 ± 5 minut w temperaturze 37 C ± 1 C. 7. Przygotować roztwór koniugatu (R6 + R7). 8. Zdjąć folię adhezyjną. Zaaspirować całą zawartość studzienek do pojemnika na odpady. Wykonać 3 cykle płukania jak opisano na etapie Do wszystkich studzienek nanieść po 100 µl roztworu koniugatu. Zakryć filmem adhezyjnym i inkubować przez 60 ± 5 minut w temperaturze 37 C ± 1 C. NB: MoŜna zweryfikować obecność koniugatu, który ma barwę czerwoną. Jest wyraźna róŝnica w zabarwieniu pustej studzienki i studzienki z czerwonym roztworem koniugatu. 7

8 10. Zdjąć folię adhezyjną. Zaaspirować zawartość studzienek do pojemnika na odpady. Wykonać 6 cykli płukania jak opisano na etapie Przygotować roztwór substratu (R8 + R9). 12. Szybko nanieść do wszystkich studzienek po 80 µl roztworu substratu (R8+R9), przygotowanego bezpośrednio przed uŝyciem. Pozostawić reakcję w ciemności na 30 ± 5 minut w temperaturze pokojowej (18-30 C). Nie zakrywać folią adhezyjną. NB: Dodanie substratu, który ma barwę róŝową, moŝe być kontrolowane wizualnie: jest wyraźna róŝnica w zabarwieniu pustej studzienką i studzienki z róŝowym roztworem substratu (w sprawie weryfikacji automatycznej patrz rozdział 12: WERYFIKACJA SPEKTROFOTOMETRYCZNA PIPETOWANIA SUBSTRATU). 13. Dodać do kaŝdej studzienki 100 µl roztworu zatrzymującego (R10) w tej samej kolejności jak podczas nanoszenia roztworu substratu. Wymieszać. NB: Dodanie roztworu zatrzymującego, który jest bezbarwny, moŝe być kontrolowane wizualnie. Po dodaniu tego roztworu znika róŝowa barwa substratu w studzienkach próbek ujemnych, natomiast studzienki z próbkami dodatnimi zmieniają barwę z niebieskiej na Ŝółtą. 14. Wytrzeć spód mikropłytki. Odczekać co najmniej 4 minuty od zatrzymania reakcji i w ciągu 30 minut zmierzyć gęstość optyczną kaŝdej studzienki w czytniku mikropłytek, przy długości fali 450/ nm. 15. Przed opisem wyników sprawdzić zgodność kolejności odczytu z ustalonym na początku rozkładem studzienek WERYFIKACJA SPEKTROMETRYCZNA PIPETOWANIA SUBSTRATU MoŜna zweryfikować obecność w studzienkach róŝowego roztworu substratu przez odczyt automatyczny przy długości fali 490 nm: studzienki z substratem powinny mieć gęstość optyczną większą niŝ (niŝsza wartość OD wskazuje na niedostateczne pipetowanie roztworu substratu) OBLICZENIE I INTERPRETACJA WYNIKÓW 1. Obliczenie średniej gęstości optycznej dla kontroli ujemnej: (ODR3) Przykład: Kontrola ujemna R3 OD Całkowite OD R3/3 = / 3 = = ODR 3 2. Obliczenie średniej gęstości optycznej dla kontroli dodatniej: (ODR4) Przykład: Kontrola dodatnia R4 OD Całkowite OD R4/3 = 2.727/3 = = ODR4 MoŜna wykluczyć jedną z kontroli dodatniej, której OD odbiega od średniej o ponad 25%. 3. Obliczenie wartości granicznej cut-off Wartość cut-off wynosi: ODR3 + (ODR4 / 7) Przykład: ODR3 = ODR4 = Cut-off = (0.909 / 7) =

9 4. Walidacja testu Średnia gęstość optyczna dla kontroli dodatniej (ODR4) musi być wieksza lub równa 0.4: ODR Średnia gęstość optyczna dla kontroli ujemnej (ODR3) musi być mniejsza lub równa 0.1: ODR Obliczenie współczynnika próbki Dla kaŝdej próbki naleŝy obliczyć współczynnik: OD próbki Współczynnik = OD cut-off 6. Interpretacja wyników Próbki o współczynniku niŝszym od 1 są ujemne. Próbki o współczynniku wyŝszym od 1 są dodatnie. 14. WŁAŚCIWOŚCI TESTU Właściwości testu MONOLISA HBc IgM PLUS oceniono podczas oznaczania próbek od losowo wybranych dawców krwi, od pacjentów z ostrym i przewlekłym zakaŝeniem wirusem zapalenia wątroby typu B i od pacjentów z innymi chorobami nie związanymi z zakaŝeniem HBV oraz przy pomocy próbek komercyjnych i paneli serokonwersyjnych. Swoistość Swoistość dla 1312 próbek od losowo wybranych dawców krwi wynosiła 99.9% (1311/1312). Swoistość oceniana dla 202 próbek od pacjentów wyniosła 99.5% (201/202). Podczas analizy próbek od 99 pacjentów z innymi patologiami lub stanami nie związanymi z zakaŝeniem HBV (kobiety cięŝarne, czynnik reumatoidalny, inne zakaŝenia wirusowe) uzyskano 100% swoistość (99/99). Czułość analityczna Czułość graniczna testu została oceniona na 50 U/ml przy zastosowaniu standardu PEI (ref IgM HBc 84). Czułość Czułość testu dla 199 próbek dodatnich, pochodzących od pacjentów z przewlekłym lub ostrym zakaŝeniem HBV, została oceniona na 98.5%. Oznaczono takŝe, porównując z innym, komercyjnym testem EIA, 129 próbek pobranych od 27 chorych z ostrym zakaŝeniem HBV oraz 3 komercyjne panele serokonwersyjne. Powtarzalność Powtarzalność testu MONOLISA HBc IgM PLUS została oceniona na podstawie analizy 4 próbek: 1 ujemnej, 2 dodatnich pod względem przeciwciał IgM anty-hbc (próbki 2 i 3) i 1 silnie dodatniej pod względem przeciwciał IgM anty-hbc. Powtarzalność wewnątrz-testową określono, badając te 4 próbki 30 razy w tym samym oznaczeniu, natomiast powtarzalność między-testową badano, oznaczając te 4 próbki w duplikacie przez 20 dni w 2 niezaleŝnych oznaczeniach dziennie. Wyniki przedstawiają tabele: Tabela 1: Powtarzalność wewnątrz-testowa n = 30 Próbka 1 Próbka 2 Próbka 3 Próbka 4 Średnia OD/Cut-off Odchylenie standardowe (SD) Współczynnik zmienności (CV)(%) Tabela 2: Powtarzalność między-testowa n = 40 Próbka 1 Próbka 2 Próbka 3 Próbka 4 Średnia OD/Cut-off Odchylenie standardowe (SD) Współczynnik zmienności (CV)(%)

10 15 - OGRANICZENIA TESTU Ujemny wynik oznacza, Ŝe badana próbka nie zawiera przeciwciał anty-hbc klasy IgM, wykrywalnych w teście MONOLISA HBc IgM PLUS. Nie wyklucza to jednak moŝliwości ekspozycji na zakaŝenie wirusem zapalenia wątroby typu B. Metodą kolorymetryczną nie moŝna oznaczyć objętości dodanej próbki, koniugatu i substratu, lecz jedynie potwierdzić ich obecność w studzience. Poziom błędu tej metody jest ściśle związany z dokładnością uŝywanego systemu (kumulatywny współczynnik zmienności nanoszenia i odczytu wynoszący ponad 10% znacznie obniŝa jakość weryfikacji). W przypadku niedostatecznego odpłukania po inkubacji z koniugatem, automatyczna weryfikacja jakości pipetowania roztworu substratu (przez odczyt OD przy 490 nm) moŝe wykazać fałszywie wysokie OD powyŝej mimo braku w studzienkach roztworu substratu. Nie zaobserwowano tego zjawiska podczas oznaczenia 939 próbek. 10

11 16 - LITERATURA 1. GERLICH W.H.; LUER W and THOMSSEN R. (1980) - Diagnosis of acute and inapparent Hepatitis B virus infections by measurement of IgM antibody to Hepatitis B core antigen - J. Infect. Dis 142 (1): LEMON S.M.; GATES NL.; SIMMS T.E. and BANCROFT W.H. (1981) IgM antibody to Hepatitis B core antigen as a diagnostic parameter of acute infection with Hepatitis B virus.-j. Infect. Dis. 143 (6): WIDELL A.; HANSSON B.G.; LOFGREN B.; MOESTRUP T.; NORKRANS G.; JOHNSSON and NORDENFELT E. (1982) - IgM antibody to the Hepatits B core antigen in acute Hepatitis determined by SPRIA Diagnostic value.- Acta Path. Microbiol. Immunol. Scand. 90: GERLICH W.H.; UY A.; LAMBRETCH F. and THOMSSEN R. (1986) Cut-off levels of Immunoglobulin M antibody against viral core antigen for differentiation of acute, chronic and past Hepatitis B virus infections - J. of Clin. Microbiol. 24; NAKAJIMA E.; TSUJI T.; KACHI K.; KAGAWA K.; OKANOUE T. and TAKINO T. (1987) - Immunoglobulin M. antibody to Hepatitis B core antigen (IgM anti-hbc) as a marker of interferon therapy in patients with persistant Hepatitis B virus infection - Biken Journal 30; KIYOSAWA K.; SODEYAMA T.; FRANCA S.T.M.; YODA H.; OHIKE Y.; IMAI H.; IMAY Y. and FURUTA S. (1988) - Serial assay for IgM anti-hbc in patients with anti-hbe positive chronic Hepatitis and its significance for long-term prognosis - J. of Med. Virol. 24; LEMON S.M. (1988) - What is the role of testing for IgM antibody to core antigen of Hepatitis B virus - Mayo Clin. Proc. 63;

12 IVD (GB) - CE marking (European directive 98/79/CE on in vitro diagnostic medical devices) (FR) - Marquage CE (Directive européenne 98/79/CE relative aux dispositifs médicaux de diagnostic in vitro) (ES) - Marcado CE (Directiva europea 98/79/CE sobre productos sanitarios para diagnóstico in vitro) (IT) - Marchiatura CE (Direttiva europea 98/79/CE relativa ai dispositivi medico-diagnostici in vitro) (DE) - CE Konformitätskennzeichnung (Europäische Richtlinie 98/79/EG über In-vitro-Diagnostika) (PT) - Marcação CE (Directiva europeia 98/79/CE relativa aos dispositivos médicos de diagnóstico in vitro) (SE) - CE-märkning (Europeiskt direktiv 98/79/EG om medicintekniska produkter för in vitro-diagnostik) (DK) - CE-mærkningen (Europa direktiv 98/79/EF om medicinsk udstyr til in vitro-diagnostik) (GR) - CE ( 98/79/CE in vitro ) (PL) - CE oznaczenie (Dyrektywa unijna 98/79/CE dotycząca produktów medycznych do badań in vitro) (LT) - CE ženklas (Europos sąjungos direktyva 98/79/CE dėl in vitro diagnostikos medicinos prietaisų) (HU) - CE jelzés (98/79/CE Európai Irányelv az in vitro orvosi diagnosztikai eszközökről) (EE) - CE märgistus (Euroopa direktiiv 98/79/CE in vitro diagnostikameditsiiniseadmete kohta) (SK) - CE označenie o zhode (Európska direktíva 98/79/CE pre in vitro diagnostické zdravotnícke postupy) (CZ) - CE značka (Evropská direktiva 98/79/CE o diagnostických zdravotnických prostředcích in vitro) (NO) - CE-merking (EU-direktiv 98/79/CE om medisinsk utstyr til in vitro-diagnostikk) (RO) - Marca CE (Directiva europeana 98/79/CE pentru dispozitive medicale de diagnostic in vitro) (BG) - СЕ маркировка (Европейска директива 98/79/CE за ин витро диагностичните медицински изделия) (GB) - For in vitro diagnostic use (GB) - Catalogue number (FR) - Pour diagnostic in vitro (FR) - Référence catalogue (ES) - Para diagnóstico in vitro (ES) - Número de catálogo (IT) - Per uso diagnostico in vitro (IT) - Numero di catalogo (DE) - In-vitro-Diagnostikum (DE) - Bestellnummer (PT) - Para uso em diagnóstico in vitro (PT) - Número de catálogo (SE) - In vitro-diagnostik (SE) - Katalognummer (DK) - In vitro diagnose (DK) - Katalognummer (GR) - in vitro (GR) - (PL) - Do stosowania in vitro (PL) - Numer katalogu (LT) - in vitro diagnostikai (LT) - Katalogo numeris (HU) - Csak in vitro diagnosztikai alkalmazásra (HU) - Cikkszám (EE) - In vitro diagnostiliseks kasutamiseks (EE) - Katalooginumber (SK) - Na diagnostiku in vitro (SK) - Katalógové číslo (CZ) - Pro diagnostiku in vitro (CZ) - Katalogové číslo (NO) - Til in vitro-diagnostikk (NO) - Katalognummer (RO) - Pentru diagnostic in vitro (RO) - Număr de catalog (BG) - За ин витро диагностика (BG) - Каталожен номер (GB) - Manufacturer (GB) - Authorised Representative (FR) - Fabricant (FR) - Représentant agréé (ES) - Fabricante (ES) - Representante autorizado (IT) - Produttore (IT) - Distributore autorizzato (DE) - Hersteller (DE) - Bevollmächtigter (PT) - Fabricante (PT) - Representante Autorizado (SE) - Tillverkad av (SE) - Auktoriserad representant (DK) - Fremstillet af (DK) - Autoriseret repræsentant (GR) - (GR) - (PL) - Producent (PL) - Upoważniony Przedstawiciel (LT) - Gamintojas (LT) - Įgaliotasis atstovas (HU) - Gyártó (HU) - Meghatalmazott Képviselő (EE) - Tootja (EE) - Volitatud esindaja (SK) - Výrobca (SK) - Autorizovaný zástupca (CZ) - Výrobce (CZ) - Zplnomocněný zástupce (NO) - Produsent (NO) - Autorisert representant (RO) - Producător (RO) - Reprezentant autorizat (BG) - Производител (BG) - Упълномощен представител (GB) - Batch code (GB) - Expiry date YYYY/MM/DD (FR) - Code du lot (FR) - Date de peremption AAAA/MM/JJ (ES) - Código de lote (ES) - Estable hasta AAAA/MM/DD (IT) - Codice del lotto (IT) - Da utilizzare prima del AAAA/MM/GG (DE) - Chargen-Bezeichnung (DE) - Verwendbar bis JJJJ/MM/TT (PT) - Código do lote (PT) - Data de expiração AAAA/MM/DD (SE) - Batchnr (SE) - Utgångsdatum ÅÅÅÅ/MM/DD (DK) - Batchkoden (DK) - Anvendes før ÅÅÅÅ/MM/DD (GR) - (GR) - YYYY/MM/DD (PL) - Numer serii (PL) - Data ważności YYYY/MM/DD (LT) - Serijos numeris (LT) - Galioja iki YYYY/MM/DD (HU) - Gyártási szám (HU) - Szavatossági idő ÉÉÉÉ/HH/NN (EE) - Partii kood (EE) - Aegumistähtaeg AAAA/KK/PP (SK) - Číslo šarže (SK) - Použiteľné do RRRR/MM/DD (CZ) - Číslo šarže (CZ) - Datum exspirace RRRR/MM/DD (NO) - Partikode (NO) - Utløpsdato ÅÅÅÅ/MM/DD (RO) - Număr de lot (RO) - Data expirarii AAAA/LL/ZZ (BG) - Партиден номер (BG) - Срок на годност година/месец/ден

13 (GB) - Storage temperature limitation (FR) - Limites de températures de stockage (ES) - Temperatura límite (IT) - Limiti di temperatura di conservazione (DE) - Lagertemperatur (PT) - Limites de temperatura de armazenamento (SE) - Temperaturbegränsning (DK) - Temperaturbegrænsning (GR) - (PL) - Temperatura przechowywania (LT) - Saugojimo temperatūriniai apribojimai (HU) - Tárolási hőmérsékleti határok (EE) - Piirangud säilitustemperatuurile (SK) - Skladovacia teplota od do (CZ) - Teplotní rozmezí od do (NO) - Oppbevaringstemperatur (RO) - Limitele de temperatură la stocare (BG) - Температурни граници на съхранение (GB) - Consult Instruction for use (FR) - Consulter le mode d'emploi (ES) - Consulte las instrucciones de uso (IT) - Consultare le istruzioni per uso (DE) - Siehe Gebrauchsanweisung (PT) - Consulte o folheto informativo (SE) - Se bruksanvisningen (DK) - Se instruktion før brug (GR) - (PL) - Sprawdź instrukcję (LT) - Ieškokite informacijos vartojimo instrukcijoje (HU) - Olvassa el a használati utasítást (EE) - Kasutamisel vaata instruktsiooni (SK) - Katalógové číslo (CZ) - Viz návod k použití (NO) - Se bruksanvisninger (RO) - Consultati prospectul de utilizare (BG) - Виж инструкцията за употреба

14 Bio-Rad 3, bd Raymond Poincaré Marnes-la-Coquette - France Tél.: /2009 Fax.: Code: