QUANTA Lite CCP 3.1 IgG/IgA ELISA Do diagnostyki in vitro Złożoność CLIA: Wysoka

Transkrypt

1 QUANTA Lite CCP 3.1 IgG/IgA ELISA Do diagnostyki in vitro Złożoność CLIA: Wysoka Przeznaczenie QUANTA Lite TM CCP 3.1 IgG/IgA ELISA jest półilościowym testem immunoabsorpcji enzymozależnej (immunoenzymatycznym) do wykrywania przeciwciał IgG i IgA anty-ccp3 (cykliczny cytrulinowany peptyd 3) w surowicach pacjentów lub osoczach z dodatkiem cytrynianu lub wersenianu (EDTA). Obecność tych przeciwciał, gdy rozpatrywać w połączeniu z innymi badaniami laboratoryjnymi i wynikami badań klinicznych jest pomocna w diagnostyce reumatoidalnego zapalenia stawów (RZS), w tym RZS rozpoznawanego ciągu 2 lat od wystąpienia objawów. Podsumowanie i wyjaśnienie testu Reumatoidalne zapalenie stawów (RZS) jest jedną z najczęstszych autoimmunologicznych chorób układowych występujących u koło 0,5% ludności świata. 1 Rozpoznanie zależy przede wszystkim od objawów klinicznych. Do niedawna jedynym testem serologicznym stosowanym rutynowo było określenie obecności czynnika reumatoidalnego (RF), znajdującego się u około 50% -90% pacjentów. 1,2 Jednakże czynnik reumatoidalny RF występuje także u osób z zakażeniami, innymi chorobami autoimmunologicznymi i u niektórych osób zdrowych. 1,2 Ważne w leczeniu tego schorzenia jest to, aby leczenie chorych z RZS podjąć tak szybko, jak to tylko możliwe. 3 Wiadomo już od wielu lat, że u osób z RZS stwierdza się obecność autoprzeciwciał przeciwjądrowych zwanych także autoprzeciwciałami anty-keratynowymi. Niedawno odkryto, że przeciwciała te rozpoznają determinantę antygenową, która zawiera cytrulinę - deimidowaną postać argininy. 4,5 Peptyd o budowie cyklicznej zawierający cytrulinę, zwany CCP (Cyclic Citrullinated Peptide) okazał się być lepszy od innych metod diagnostycznych takich jak przeciwciała przeciwjądrowe czy czynnik reumatoidalny RF przy odróżnianiu chorych z RZS od innych chorych. 6,7 W przeglądzie piśmiennictwa 8, 68% chorych na RZS posiada przeciwciała anty-ccp, podczas gdy średnio 5% bez rozpoznanego RZS posiada dodatnie przeciwciała anty CPP. Test wykonywany metodą ELISA z pierwotnie opisaną sekwencją CCP 5 nie był szeroko dopuszczony do obrotu ze względu na niską czułość. Jednakże test anty-ccp drugiej generacji (nazwany przez niektóre firmy tzw. CCP2) jest powszechnie dostępny i pokazuje doskonałą wydajność w stosunku do metody z zastosowaniem pierwotnego peptydu. 9 INOVA Diagnostics nazywa ten test drugiej generacji CCP IgG ELISA. Co ważne, anty-ccp stwierdzono u pacjentów z wczesnym RZS 8, co czasem pozwala na przewidywanie przyszłości rozwoju RZS lepiej niż RF. 4,7 Przeciwciała u niektórych pacjentów z RZS, które są negatywne dla anty-ccp2 reagują z innymi białkami cytrulinowanymi, 6,7 sugerując tym samym, że istnieją dodatkowe determinanty antygenowe, które nie występują w drugiej generacji sekwencji antygenów CCP. W roku 2005, zostały udostępnione zestawy wykorzystujące 3 generację antygenu (CCP3). Te 3 generacji zestawy peptydu okazały się być około 5% bardziej czułe porównaniu z zestawami wykorzystującymi antygen CCP2 antygenu i równie specyficzne. 10 Antygen zastosowany w zestawie QUANTA Lite CCP 3.1 zawiera nowszy 3 generacji peptyd CCP3. Zestaw ten wykorzystuje także koniugat, który oprócz zwykłych przeciwciał wykrywa także przeciwciała IgA. Czułość jest większa, niż zestawu CCP 3 ze względu na to, że niektórzy pacjenci z RZS w przypadku braku IgG posiadają przeciwciała IgA z CCP Dodatkowa przewaga CCP 3.1 ELISA są oznaczone kolorami dołki separatystyczne i możliwość korzystania z surowicy lub osocza pacjenta. Zasada badania Antygen stosowany w QUANTA Lite CCP 3.1 IgG/IgA ELISA jest syntetycznym, cyklicznym cytrulinowanym peptydem, który jak stwierdzono posiada czułość i specyficzność w wykrywaniu przeciwciał u chorych na RZS. Ten antygen jest związany z powierzchnią płytki z mikrodołkami. Uprzednio wstępnie rozcieńczone kontrole i rozcieńczone próbki pacjenta są dodawane do oddzielnych dołków, dzięki czemu wszelkie CCP IgG i / lub obecne przeciwciała IgA wiążą się z unieruchomionym antygenem. Niezwiązana próbka jest wypłukana, a enzymatycznie znakowany koniugat anty-igg / IgA jest dodawany do każdego dołka. Druga inkubacja pozwala na to, żeby enzymatycznie znakowana ludzka anty-igg i / lub IgA związała się z przeciwciałami pacjenta, które przyczepiają się do mikrodołków. Po wypłukaniu wszelkich niezwiązanych przeciwciał przeciw-ludzkich IgG/IgA znakowanych enzymem, aktywność pozostałego enzymu bada się dodając substrat chromogeniczny i mierząc intensywność powstałej barwy. Badanie może zostać ocenione spektrofotometrycznie, poprzez zmierzenie i porównanie intensywności barwy, która powstaje w dołkach z próbkami od pacjenta z barwą dołków kontrolnych. Odczynniki 1. Polistyrenowa płytka ELISA z mikrodołkami pokryta oczyszczonym syntetycznie antygenem CCP 3 (12-1 x 8 dołków), z uchwytem w opakowaniu foliowym zawierającym środek osuszający 2. Ujemna kontrola ELISA, 1 fiolka buforu zawierająca środek konserwujący i surowicę ludzką bez ludzkich przeciwciał na CCP, wstępnie rozcieńczone, 1,2 ml 3. Słabo dodatnie CCP 3.1 IgG / IgA ELISA, 1 fiolka bufor u zawierająca środek konserwujący i ludzkie przeciwciała w surowicy CCP, wstępnie rozcieńczone, 1,2 ml 4. Wysoko dodatnie/kalibrator CCP 3.1 IgG / IgA ELISA, 1 fiolka buforu zawierająca środek konserwujący i ludzkie przeciwciała w surowicy CCP, rozcieńczone, 1,2 ml 1

2 5. Kalibrator B CCP 3.1 IgG / IgA ELISA B, 1 fiolka buforu zawierająca środek konserwujący i ludzkie przeciwciała w surowicy CCP, wstępnie rozcieńczone, 1,2 ml 6. Kalibrator C, CCP 3.1 IgG / IgA ELISA, 1 fiolka buforu zawierająca środek konserwujący i ludzkie przeciwciała w surowicy CCP, wstępnie rozcieńczone, 1,2 ml 7. Kalibrator D, CCP 3.1 IgG / IgA ELISA, 1 fiolka buforu zawierająca środek konserwujący i ludzkie przeciwciała w surowicy CCP, wstępnie rozcieńczone, 1,2 ml 8. Kalibrator E, CCP 3.1 IgG / IgA ELISA, 1 fiolka buforu zawierająca środek konserwujący i ludzkie przeciwciała w surowicy CCP, wstępnie rozcieńczone, 1,2 ml 9. Rozcieńczalnik do próbek HRP, 1 fiolka zabarwienie różowe, zawiera sól fizjologiczną buforowaną TRIS, Tween 20, stabilizatory białka i konserwant, 50 ml 10. Koncentrat do płukania o wysokiej specyficzności, 1 fiolka z 10x koncentratem - oznakowanym kolorem czerwonym zawierającym roztwór soli fizjologicznej buforowanej Tris-i Tween 20, 100 ml. Instrukcje dotyczące rozcieńczania można znaleźć w sekcji Metody. 11. HRP CCP 3.1 IgG / IgA koniugatu (kozi), anty-igg / IgA, 1 fiolka - oznakowana kolorem żółtym zawierająca bufor, stabilizatory białka i środek konserwujący, 10 ml 12. Chromogen TMB, 1 fiolka zawierająca stabilizatory, 10 ml 13. Roztwór zatrzymujący HRP, kwas siarkowy 0,344M, 1 fiolka bezbarwny, 10 ml Ostrzeżenia 1. OSTRZEŻENIE: Ten produkt zawiera substancję chemiczną (chloramfenikol 0,02%) w rozcieńczalniku do próbek, kontrolach i koniugacie, która według stanu Kalifornii wywołuje raka. 2. Wszystkie materiały pochodzenia ludzkiego używane w przygotowywaniu kontroli dla tego produktu zostały przetestowane i na podstawie metod zatwierdzonych przez FDA stwierdzono że nie zawierają przeciwciał przeciwko HIV, HBsAg i HCV. Jednak żadna metoda testowania nie może całkowicie zagwarantować braku obecności HIV, HBV, HCV lub innych czynników zakaźnych. Dlatego, nisko dodatnie CCP 3.1 IgG / IgA ELISA, wysoko dodatnie/kalibratory CCP 3.1 IgG / IgA ELISA i kontrole ujemne ELISA powinny być traktowane w taki sam sposób jak materiały potencjalnie zakaźne Jako konserwant stosowany jest azydek sodu. Azydek sodu jest trucizną i może być toksyczny w przypadku połknięcia lub wchłonięcia przez skórę lub oczy. Azydek sodu może wchodzić w reakcję z ołowianą lub miedzianą instalacją wodociągową, tworząc potencjalnie wybuchowe azydki metali. Jeśli do usuwania odczynników używane są zlewy, należy przepłukiwać je dużą ilością wody, aby nie dopuścić do gromadzenia się azydku. 4. Koniugat HRP zawiera rozcieńczoną trującą/korozyjną substancję chemiczną, która może być toksyczna w przypadku spożycia w dużej ilości. Aby uniknąć potencjalnych oparzeń chemicznych, należy unikać kontaktu ze skórą i oczami. 5. Chromogen TMB zawiera środek drażniący, w który może być szkodliwy w przypadku wdychania, spożycia lub wchłonięcia przez skórę. Aby uniknąć urazów, należy unikać wdychania, spożycia lub kontaktu ze skórą i oczami. 6. Roztwór zatrzymujący HRP składa się z rozcieńczonego roztworu kwasu siarkowego. Unikać wystawienia na działanie zasad, metali lub innych związków, które mogą wchodzić w reakcje z kwasami. Kwas siarkowy jest trucizną i ma właściwości korozyjne. W razie połknięcia może być toksyczny. Aby uniknąć oparzeń chemicznych, należy unikać kontaktu ze skórą i oczami. 7. Podczas pracy z dostarczonymi odczynnikami należy stosować odpowiednie środki ochrony osobistej. 8. Rozlane odczynniki należy natychmiast usunąć. Należy przestrzegać wszystkich krajowych i lokalnych przepisów w zakresie utylizacji odpadów. Środki ostrożności 1. Ten produkt jest przeznaczony do zastosowań diagnostycznych in vitro. 2. Zastąpienie składników dostarczonych w tym systemie innymi składnikami może skutkować osiągnięciem niespójnych wyników. 3. Niepełne lub nieprawidłowe płukanie i niewystarczające usunięcie płynu z płytek z dołkami ELISA wpłynie negatywnie na precyzję badań i/lub spowoduje wysoki poziom tła. 4. Dostosowanie tego badania do stosowania ze zautomatyzowanymi analizatorami próbek oraz innymi urządzeniami do pracy z płynami, w całości lub w części, może skutkować rozbieżnością wyników w stosunku do badań przeprowadzanych ręcznie. Obowiązkiem każdego laboratorium jest potwierdzenie, że wyniki testów uzyskanych na podstawie zautomatyzowanych badań mieszczą się w akceptowalnych limitach. 5. Na wyniki analizy wpływa wiele różnych czynników. Obejmują one temperaturę początkową odczynników, temperaturę otoczenia, dokładność i powtarzalność techniki pipetowania, dokładność płukania i usuwania płynu z dołków płytek ELISA, fotometr użyty do analizy wyników oraz czasy trwania inkubacji podczas badania. Uzyskanie dokładnych i powtarzalnych wyników wymaga staranności i precyzji. 6. Zalecane jest ścisłe przestrzeganie procedury testowej. 7. Niepełne zamknięcie na zamek błyskawiczny etui z lock woreczek zawierającego mikrodołki płytki i środek osuszający spowoduje degradację antygenu i kiepską dokładność. 8. Dwukrotne lub wielokrotne użycie koniugatu HRP z jednej butelki w pewnym okresie czasu może spowodować niedopuszczalnie niski poziom absorbancji. Aby nie dopuścić do takiej sytuacji istotne jest przestrzeganie wszystkich zaleceń dotyczących procedur pracy z koniugatem HRP. 2

3 9. Zanieczyszczenie chemiczne koniugatu HRP może być spowodowane nieprawidłowym czyszczeniem lub płukaniem sprzętu lub narzędzi. Pozostałości typowych laboratoryjnych substancji chemicznych, takich jak formalina, substancja wybielająca, etanol lub detergent, z czasem spowoduje degradację koniugatu HRP. Po użyciu chemicznych substancji czyszczących/dezynfekujących dokładnie wypłukać cały sprzęt i wszystkie narzędzia. Warunki przechowywania 1. Przechowywać wszystkie odczynniki zestawu w temperaturze 2 8 C. Nie zamrażać. Odczynniki są trwałe do daty ważności, pod warunkiem, że są przechowywane i używane zgodnie z instrukcjami. 2. Nieużyte płytki z mikrodołkami pokrytymi antygenem powinny być starannie zamknięte w torebce foliowej z osuszaczami i przechowywane w temperaturze 2 8 C. 3. Rozcieńczony bufor do płukania zachowuje trwałość przez 1 tydzień w temperaturze 2 8 C. Pobieranie próbek Gdy próbki dały identyczne wyniki, procedura ta powinna być wykonana zarówno z próbką surowicy lub osocza krwi z cytrynianem lub próbką osocza z wersenianem (EDTA). Nie powinno być stosowane osocze z litem i heparyną, ponieważ mogą one przynieść wyniki inne niż surowica. Dodanie azydku lub innych konserwantów do próbek analitycznych może mieć negatywny wpływ na wyniki. Nie używać próbek zawierających widoczne zanieczyszczenia, skażonych bakteryjnie lub podgrzanych. Należy unikać całkowicie zhemolizowanej lub lipemicznej surowicy albo próbek. Po zebraniu, surowica powinna być oddzielona od skrzepu lub osocze powinno być przechowywane w sposób opisany poniżej. Dokument NCCLS H18-A3 zaleca następujące warunki przechowywania próbek: 1) Przechowywać próbki w temperaturze pokojowej nie dłużej niż 8 godzin. 2) Jeżeli test nie zostanie zakończony w ciągu 8 godzin, próbki należy przechowywać w lodówce w temperaturze 2 8 C. 3) Jeżeli test nie zostanie zakończony w ciągu 48 godzin, lub do wysłania próbki, należy zamrozić do temperatury -20 C lub niższej. Zamrożone próbki po rozmrożeniu i przed badaniem muszą zostać dobrze wymieszane. Badanie Dostarczone materiały 1 płytka z mikrodołkami CCP 3.1 IgG/IgA ELISA (12-1 x 8 dołków), wraz z uchwytem 1 1,2 ml wstępnie rozcieńczona kontrola negatywna ELISA 1 1,2 ml wstępnie rozcieńczone słabo dodatnie CCP 3.1 IgG/IgA ELISA 1 1,2 ml wstępnie rozcieńczone CCP 3.1 IgG/IgA wysoce dodatnie ELISA/Kalibrator A 1 1,2 ml wstępnie rozcieńczone CCP 3.1 IgG/IgA ELISA Kalibrator B 1 1,2 ml wstępnie rozcieńczone CCP 3.1 IgG/IgA ELISA Kalibrator C 1 1,2 ml wstępnie rozcieńczone CCP 3.1 IgG/IgA ELISA Kalibrator D 1 1,2 ml wstępnie rozcieńczone CCP 3.1 IgG/IgA ELISA Kalibrator E 1 50 ml rozcieńczalnika do próbek HRP ml koncentratu do przemywania o wysokiej specyficzności, koncentrat 10x 1 10 ml HRP CCP 3.1 IgG / IgA koniugatu (kozi), ludzki anty-igg / IgA 1 10 ml chromogenu TMB 1 10 ml roztworu zatrzymującego HRP, kwas siarkowy 0,344M Wymagane materiały nie dołączone do zestawu Mikropipety na 5, 100, i 500 µl Jednorazowe końcówki mikropipet Probówki do roztworów próbek pochodzących od pacjenta, 4 ml objętości Woda destylowana lub dejonizowana 1L pojemnik na rozcieńczony koncentrat do płukania o wysokiej specyficzności Czytnik płytek z mikrodołkami umożliwiający pomiar gęstości optycznej przy 450 nm (i przy 620 nm dla odczytów przy dwóch długościach fali) Sposób przygotowania Przed rozpoczęciem 1. Doprowadzić wszystkie odczynniki i próbki do temperatury pokojowej (20 26 o C) i dobrze wymieszać. 2. Rozcieńczyć wysokiej specyficzności koncentrat do płukania 01:10 poprzez dodanie zawartości butelki wysokiej specyficzności koncentratu do płukania do 900 ml butelki z wodą destylowaną lub dejonizowaną Jeśli cała płytka nie zostanie uruchomiona w tym okresie, można przygotować mniejsze ilości przez dodanie 10,0 ml koncentratu do 90 ml wody destylowanej lub dejonizowanej do każdego z 16 dołków, które będą wykorzystane. Rozcieńczony bufor zachowuje trwałość przez 1 tydzień w temperaturze 2 8 o C. 3. Przygotować roztwór 1:101 każdej próbki pobranej od pacjenta, dodając 5 µl próbki do 500 µl rozcieńczalnika do próbek HRP. Rozcieńczone próbki muszą być użyte w ciągu 8 godzin od przygotowania. NIE ROZCIEŃCZAĆ słabo dodatniego CCP 3.1 IgG/IgA ELISA, wysoko dodatniego CCP 3.1 IgG/IgA oraz ujemnej kontroli ELISA. 4. Oznaczanie obecności lub braku przeciwciał anty-ccp 3.1 przeciwciał stosując jednostki umowne wymaga dwóch dołków dla każdego z trzech kontroli i jednego lub dwóch dołków dla każdej próbki pacjenta. Zalecane jest wykonanie duplikatów próbek. 3

4 5. W razie potrzeby, wyniki mogą być oceniane ilościowo za pomocą 5-punktowej krzywej wzorcowej. Dla punktów A do E 5-punktowej krzywej wzorcowej, należy użyć WSTĘPNIE ROZCIEŃCZONYCH CCP 3.1 kalibratorów od A do E bezpośrednio z fiolki. Pięciopunktowa krzywa wzorcowa ma następujące wartości: Punkt Jednostki A Wstępnie rozcieńczony Kalibrator A CCP 3.1 IgG/IgA 250,0 B Wstępnie rozcieńczony Kalibrator B CCP 3.1 IgG/IgA 125,0 C Wstępnie rozcieńczony Kalibrator C CCP 3.1 IgG/IgA 62,5 D Wstępnie rozcieńczony Kalibrator D CCP 3.1 IgG/IgA 31,25 E Wstępnie rozcieńczony Kalibrator E CCP 3.1 IgG/IgA 15,62 Procedura badania 1. WSZYSTKIE ODCZYNNIKI PRZED ROZPOCZĘCIEM BADANIA MUSZĄ BYĆ DOPROWADZONE DO TEMPERATURY POKOJOWEJ (20 26 C). Umieścić wymaganą liczbę mikrodołków/pasków w uchwycie. Natychmiast umieścić nieużywane płytki w torebce foliowej zawierającej osuszacz i dobrze ją zamknąć, aby ograniczyć kontakt z parą wodną. 2. Dodać 100 μl zrozcieńczonej wstępnie CCP 3.1 IgG / IgA ELISA słabo dodatniej, CCP 3.1 IgG / IgA ELISA wysoko dodatniej, w razie potrzeby kalibratory od B do E,ujemna kontrola ELISA i rozcieńczone próbki pacjentów do dołków. Przykryć dołki i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej na równej powierzchni. Czas inkubacji rozpoczyna się po dodaniu ostatniej próbki. 3. Etap płukania: Odessać całkowicie zawartość każdego dołka. Wlać µl rozcieńczonego buforu HRP do płukania do wszystkich dołków, a następnie odessać. Powtórzyć tę sekwencję jeszcze dwukrotnie, aby łącznie przeprowadzić trzy płukania. Odwrócić płytkę i postukać w nią na materiale pochłaniającym w celu usunięcia pozostałości płynu po ostatnim płukaniu. Ważne jest, aby całkowicie opróżnić każdy dołek po każdym etapie płukania. Zachować tę samą sekwencję odsysania, jak w przypadku dodawania próbki. 4. Dodać 100μl koniugatu HRP CCP 3.1 IgG / IgA do każdego dołka. Koniugat powinien być usunięty z butelek z zastosowaniem standardowych warunków aseptycznych oraz zalecanych technik laboratoryjnych. Pobrać z butelki jedynie wymaganą do analizy ilość koniugatu. ABY UNIKNĄĆ POTENCJALNEGO ZANIECZYSZCZENIA BAKTERYJNEGO I/LUB CHEMICZNEGO, NIE WOLNO Z POWROTEM WLEWAĆ NIEUŻYTEGO KONIUGATU DO BUTELKI. Inkubować dołki przez 30 minut jak w etapie Etap płukania: Powtórzyć etap Dodać 100 µl chromogenu TMB do każdego dołka i inkubować w ciemności przez 30 minut w temperaturze pokojowej. 7. do każdego dołka dodać 100 µl roztworu zatrzymującego HRP. Zachować tę samą sekwencję i czas dodawania roztworu zatrzymującego HRP, jak w przypadku chromogenu TMB. Delikatnie postukać płytkę palcem, aby dokładnie wymieszać zawartość dołków. 8. Odczytać absorbancję (gęstość optyczną) każdego dołka przy długości fali 450 nm w ciągu jednej godziny od zatrzymania reakcji. Jeśli wymagane są pomiary bichromatyczne, referencyjną długością fali może być długość 620 nm. Kontrola jakości 1. CCP 3.1 IgG / IgA ELISA słabo dodatnie, CCP 3.1 IgG / IgA ELISA wysoko dodatnie i ujemna kontrola ELISA powinna być prowadzona z każdą partią próbek w celu zapewnienia, aby wszystkie odczynniki i procedury działały poprawnie. 2. Warto zauważyć, słabo dodatnie CCP 3.1 IgG / IgA ELISA, wysoko dodatnie CCP 3.1 IgG / IgA ELISA i ujemne kontrolne ELISA są wstępnie rozcieńczone, nie kontrolują one metod proceduralnych związanych z rozcieńczeniem próbek. 3. Dodatkowe kontrole mogą być przebadane zgodnie z wytycznymi lub wymaganiami lokalnych i/lub krajowych przepisów lub organów normalizacyjnych. Dodatkowe odpowiednie surowice kontrolne można przygotować, dzieląc połączone próbki surowicy ludzkiej i przechowując je w temperaturze < -20 C. 4. Aby wyniki badania mogły być uznane jako ważne, muszą zostać spełnione wszystkie poniższe kryteria. Jeśli jakiekolwiek kryterium nie będzie spełnione, badanie powinno być traktowane jako nieważne i powinno zostać powtórzone. a. Absorbancja wstępnie rozcieńczonej wysoko dodatniej CCP 3.1 IgG / IgA ELISA musi być większa od absorbancji wstępnie rozcieńczonej słabo dodatniej CCP 3.1 IgG / IgA ELISA, która musi być większa niż absorbancja rozcieńczonej kontroli ujemnej ELISA. b. Wstępnie rozcieńczona wysoko dodatnia CCP 3.1 IgG / IgA ELISA musi posiadać gęstość optyczną (OD) większą niż 1,0, podczas gdy absorbancja wstępnie rozcieńczonej ujemnej kontroli ELISA nie może przekraczać wartości 0,2. c. Absorbancja słabo dodatniej CCP 3.1 IgG / IgA ELISA musi być większa niż dwukrotna wartość ujemnej kontroli ELISA lub powinna przekraczać 0,25. d. Ujemna kontrola ELISA i wysoko dodatnia CCP 3.1 IgG / IgA ELISA są przeznaczone do monitorowania znacznego braku działania odczynnika. Wysoko dodatni CCP 3.1 IgG / IgA ELISA nie zapewnia dokładności przy wartości odcięcia testu. e. W celu zapoznania się z dodatkowymi wytycznymi użytkownik powinien zapoznać się z dokumentem CLSI (NCCLS) C24-A3 dotyczącymi stosowania odpowiednich procedur kontroli jakości. 4

5 Półilościowa analiza wyników metoda wskaźnikowa W pierwszej kolejności jest określana średnia gęstość optyczna każdego zestawu duplikatów. Reaktywność dla każdej próbki może być obliczona przez podzielenie średniej gęstości optycznej przez średnią słabo dodatniej gęstości optycznej CCP 3.1 IgG / IgA ELISA. Wynik jest pomnożony przez liczbę jednostek przypisanych do słabo dodatniego CCP 3.1 IgG / IgA ELISA znalezioną na etykiecie. Gęstość optyczna próbki Wartość próbki = x słabo dodatnia CCP 3.1 IgG/IgA ELISA (jednostki) CCP 3.1 IgG / IgA ELISA słabo (jednostki) dodatnia gęstość optyczna OD Reaktywność w sposób nieliniowy zależy od ilości obecnych przeciwciał. Wzrosty i spadki stężeń przeciwciał u pacjenta będą odzwierciedlone w analogicznym wzroście lub spadku reaktywności, jednak zmiana ta nie jest proporcjonalna (tzn. podwojenie stężenia przeciwciał nie oznacza podwojenia reaktywności). Opcjonalna metoda obliczeń: Półilościowe wyniki za pomocą krzywej wzorcowej Obliczanie wyników z opcjonalną krzywą wzorcową 1. Należy określić wartość średnią dla odczytów wszystkich duplikatów. 2. Nanieść średnią absorbancję (gęstość optyczną) próbek na krzywej wzorcowej w odniesieniu do ich wartości w jednostkach. Do narysowania krzywej użyć liniowo/liniowej funkcji sklejanej (splajnu) stopnia 3 lub łamanej łączącej punkty. 3. Należy określić nieznane stężenie anty-ccp 3.1 stężenie w jednostkach z osi Y" poprzez odczyt odpowiednich absorbancji na osi x". Obliczyć nieznane jednostki. 4. Uwaga: Wartości obliczone za pomocą metody wskaźnikowej będą różnić się od wartości obliczonych według krzywej wzorcowej. Wyższe wartości będą różnić się w większym stopniu niż wartości niższe. Stosując metodę wskaźnikową wysoko dodatni CCP 3.1 IgG / IgA nie przyniesie wartości 250. Interpretacja wyników Badanie ELISA jest bardzo wrażliwe na technikę i jest w stanie wychwycić nawet najdrobniejsze różnice w populacjach pacjentów. Poniższe wartości są jedynie wartościami sugerowanymi. Każde laboratorium powinno ustalić własny normalny zakres na podstawie własnych technik, kontroli, sprzętu i populacji pacjentów, zgodnie z własnymi ustalonymi procedurami. Próbka następnie może być sklasyfikowana jako negatywna, słabo pozytywna, średnio pozytywna lub silnie pozytywna, zgodnie z poniższą tabelą. Jednostki Negatywna <20 Słabo pozytywna Średnio pozytywna Silnie pozytywna Dodatni wynik wskazuje na obecność przeciwciał klasy IgG i / lub IgA anty-ccp 3 i sugeruje możliwość RZS. 2. Negatywny wynik wskazuje na brak przeciwciał lub poziomy CCP 3 poniżej ujemnych wartości odcięcia testu. 3. Zalecane jest, aby wyniki raportowane przez laboratorium zawierały oświadczenie: Uzyskano następujące wyniki uzyskane z INOVA QUANTA Lite CCP 3.1 IgG/IgA ELISA. Nie można stosować zamiennie wartości przeciwciał przeciwko CCP uzyskanych przy zastosowaniu metod testowych innych producentów. Wielkość poziomów zgłoszonych IgG lub IgA nie mogą być skorelowane z mianem końcowym. " Ograniczenia badania 1. Obecność kompleksów immunologicznych lub innych agregatów immunoglobuliny w próbce pacjenta może spowodować wzrost poziomu niespecyficznego wiązania i wywoływania wyników fałszywie dodatnich w tym teście. 2. Nie wszyscy chorzy na RZS mają dodatnie przeciwciała anty-ccp. 3. Wyniki tego badania powinny być użyte w powiązaniu z wynikami klinicznymi i innymi badaniami serologicznymi. 4. Charakterystyka wydajności testu nie została ustalona dla matryc innych niż surowica, osocze EDTA i osocze z cytrynianem. 5. Wartość diagnostyczna przeciwciał anty-ccp 3 u pacjentów z młodzieńczym reumatoidalnym zapaleniem stawów nie została ustalona. 6. Substancje mające wpływ na wynik testu: Wysoki poziom hemoglobiny, bilirubiny, cholesterolu i trójglicerydów nie powoduje fałszywie ujemnych lub fałszywie dodatnich wyników. 5

6 Oczekiwane wartości z próbek klinicznych Zdolność QUANTA Lite CCP3.1 IgG / IgA ELISA do wykrywania / IgG IgA CCP3 oceniano poprzez porównanie do 942 próbek z testem ELISA, którym dokonano pomiaru-igg anty-ccp2. Włączono 495 pacjentów z klinicznym rozpoznaniem RZS w wyniku badań zarówno wewnętrznych (186) jak i zewnętrznych (309). Badano również surowice 275 losowo dobranych dawców krwi. Spośród 272, gdzie wiek i płeć były dostępne, 97 stanowiły kobiety, średni wiek wynosił 42,4 lat. Kontrola choroby obejmowała 74 osoby z innymi chorobami reumatycznymi (ORD), takimi jak toczeń rumieniowaty układowy (34), choroba Mikulicza-Radeckiego (16), twardzina uogólniona (24), jak również dodatkowe 98 próbek z przeciwciałami przeciwko chorobom zakaźnym (ID), takimi jak zapalenie wątroby C (58), wirus opryszczki zwykłej (herpes simplex) (15), wirus cytomegalii (14), toksoplazmoza (6) i różyczka (5) w jednym dużym badaniu wewnętrznym. Swoistość i wrażliwość kliniczna Poniższa tabela podsumowuje wyniki wszystkich badań klinicznych. Próbki N=942 CCP3.1 ELISA CCP ELISA RZS (Całkowita N=495) RZS w ciągu 2 lat (N=86) Całkowite kontrole (N=447) Dawcy krwi (N=275) Inne choroby reumatyczne (N=74) Choroby zakaźne (N=98) Czułość kliniczna [95% przedział ufności (CI)] = CCP3.1 = 70,3% (66 74%) CCP = 64,6% (60-69%) W RZS w ciągu 2 lat = CCP3.1 = 64,0% (52 74%) CCP = 54,7% (43-65%) Specyficzność kliniczna (95% CI) = CCP3.1 = 97,8% (96-99%) CCP = 98,2% (97-99%) Porównanie metody N = 942 CCP3.1 IgG / IgA ELISA CCP IgG ELISA Łącznie % Zgody (95% CI) Pozytywna Negatywny Pozytywna * 358 Pozyt. % Zgody = 97,6% (95,3-98,9%) Negatywny 8** Negat. %Zgod= 93,8% (91,6-95,6%) Łącznie Całk. % zgody= 95,1% * 33 spośród tych próbek są zdiagnozowanymi RZS. ** 5 spośród tych próbek są zdiagnozowanymi RZS. Reaktywność krzyżowa Aby ocenić potencjalne reakcje krzyżowe z CCP3.1 antygenu z innych autoprzeciwciał, QUANTA Lite CCP3.1 ELISA oceniano z 16 próbek, wszystkie mają wysoki poziom wielu innych autoprzeciwciał. Zawarte w tej grupie były 2 próbki, każdą z nich poddaje się reakcji z SS-A, SS-B, Sm, RNP, ScL-70, Jo-1, Ribo-P i dsdna. Wszystkie próbki były ujemne dla anty-ccp3.1. Powyższe badanie nie wykazuje znaczącego reaktywności krzyżowej antygenu CCP3.1 z wieloma innymi autoprzeciwciałami. Precyzja i powtarzalność Mierzono zmienność pomiędzy-przebiegami testu uruchamiając duplikaty badania próbek ujemnych, słabo dodatnich, silnie dodatnich w 6 oddzielnych testach w okresie 5 różnych dni. Zmiany w obrębie przebiegu testu mierzono poprzez uruchomienie 9 próbek 9 lub 10 razy na tej samej płytce ELISA. Reprezentatywne wyniki zostały przedstawione poniżej. Zmienność pomiędzy seriami Negatywny 1 Niskie 1 Niskie 2 Wysokie 1 1 pkt * 5 pkt ** 1 pkt 5 pkt 1 pkt 5 pkt 1 pkt 5 pkt Średnia 6 U 4 U 22 U 23 U 28 U 30 U 69 U 85 U SD 0,4 0,5 0,7 0,6 0,8 1,2 1,7 1,2 CV% 8% 11% 3% 3% 3% 4% 2% 1% Zmienność w obrębie serii Negatywny 1 Niskie 1 Niskie 2 Wysokie 1 1 pkt 5 pkt 1 pkt 5 pkt 1 pkt 5 pkt 1 pkt 5 pkt Średnia 4 U 2 U 22 U 24 U 26 U 30 U 68 U 81 U SD 0,2 0,2 0,9 1,1 0,9 1,0 1,9 3,2 CV% 4% 13% 4% 5% 3% 3% 3% 4% * Wyniki badań metodą wskaźnikową ** Wyniki badań metodą krzywej wzorcowej 6

7 Piśmiennictwo 1. Wener MH: Rheumatoid Factors. Manual of Clinical Laboratory Immunology, NR Rose et al., eds, American Society for Microbiology Press, (2002). 2. Borretzen M et al.: Rheumatoid Factors. Autoantibodies, Peter JB and Shoenfeld Y, eds, Elsevier Science B.V., (1996). 3. Kim JK and Weisman MH: When does rheumatoid arthritis begin and why do we need to know? Arthritis Rheum 43: (2000). 4. Vossenaar ER and Van Venrooj WJ: Anti-CCP antibodies, a highly specific marker for (early) rheumatoid arthritis. Clin Applied Immunol Rev 4: (2004). 5. Schellekens GA et al.: Citrulline is an essential constituent of antigenic determinants recognized by rheumatoid arthritis-specific autoantibodies. J Clin Invest. 101: (1998). 6. Vittecoq O et al.: Autoantibodies recognizing citrullinated rat filaggrin in an ELISA using citrullinated and non-citrullinated recombinant proteins as antigens are highly diagnostic for rheumatoid arthritis. Clin Exp Immunol 135: (2004). 7. Saraux A et al.: Value of antibodies to citrulline-containing peptides for diagnosing early rheumatoid arthritis. J Rheumatol 30: (2003). 8. Avovac J et al: Diagnostic and predictive value of anti-cycllic citrullinated protien antibodies in rheumatiod arthritis: a systematic literature review. Ann Rheum Dis 65: (2006). 9. van Gaalen FA et al.: A comparison of the diagnostic accuracy and prognostic value of the firstand second anti-cyclic citrullinated peptide autoantibody (CCP1 and CCP2) tests for rheumatoid arthritis. Ann Rheum Dis 64: (2005) 10. Mittermayer S et al.: A comparison of the frequency of autoantibodies to cyclic citrullinated peptides using a third generation CCP assay (CCP3) in systemic sclerosis, primary biliary cirrhosis and rheumatoid arthritis. Clin Rheumatol June 15, e-pub ahead of print (2007). 11. Vieira LEA et al: Rheumatoid arthritis diagnosis: a comparative study of second and third generation anti-cyclic citrullinated peptide (CCP) ELISAs. Arthritis Rheum 56: S724 (2007). 12. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. Centers for Disease Control/National Institutes of Health, Fifth Edition,

8 QUANTA Lite jest zastrzeżonym znakiem handlowym firmy INOVA Diagnostics, Inc. Copyright Wszelkie prawa zastrzeżone Wyprodukowano przez: INOVA Diagnostics, Inc Old Grove Road San Diego, CA Stany Zjednoczone Ameryki Pomoc techniczna (tylko na terenie Stanów Zjednoczonych i Kanady): Pomoc techniczna (poza terenem Stanów Zjednoczonych): support@inovadx.com Autoryzowani przedstawiciele na terenie Unii Europejskiej: Medical Technology Promedt Consulting GmbH Altenhofstrasse 80 D St. Ingbert, Niemcy Tel.: Faks.: POL Marzec 2011 Wersja 0 8