QUANTA Lite RF IgG ELISA Do diagnostyki in vitro Złożoność CLIA: Wysoka

Transkrypt

1 QUANTA Lite RF IgG ELISA Do diagnostyki in vitro Złożoność CLIA: Wysoka Przeznaczenie QUANTA Lite TM RF IgG jest to test immunoenzymatyczny (ELISA) do półilościowego wykrywania przeciwciał IgG czynnika reumatoidalnego (RF) w surowicy pacjenta. W połączeniu z innymi wynikami klinicznymi i laboratoryjnymi, do diagnozowania reumatoidalnego zapalenia stawów (RA) wykorzystać można badanie na obecność wspomnianych przeciwciał. Podsumowanie i wyjaśnienie testu Czynniki reumatoidalne (RF) są to immunoglobuliny wszelkiego izotypu o aktywności przeciwciał skierowanych przeciwko miejscom antygenowym w rejonie Fc ludzkiego lub zwierzęcego IgG. 1,2 IgM-RF jest głównym izotypem jaki zidentyfikowano przy użyciu dostępnych klinicznie testów diagnostycznych przeznaczonych do wykrywania RF. W przypadku pacjentów z reumatoidalnym zapaleniem stawów (RA), najczęściej powtarzającą się wspólną cechą wyników badań serologicznych jest obserwowany wzrost stężenia RF IgM we krwi i mazi stawowej. 1,2 U około 70-80% pacjentów z potwierdzonym RA stwierdzono występowanie RF IgM. 3,4,5 Stężenie RF jest najwyższe, gdy choroba się nasila i spada podczas długotrwałej remisji. RF IgM występuje w 1 do 4% populacji ogólnej. RF występuje u 75% dorosłych pacjentów z RA, przy czym RF częstość występowania jest największa u osób powyżej 65 roku życia. Zwiększone miano tych przeciwciał towarzyszyć może wielu ostrym odpowiedziom ze strony układu immunologicznego; tyczy się to zwłaszcza infekcji wirusowych i wielu innych chorób (mononukleoza zakaźna, gruźlica, trąd, różne choroby pasożytnicze, choroba wątroby, sarkoidoza oraz toczeń rumieniowaty układowy). 6 Ponadto, oprócz RF IgM, u pacjentów z RA wykrywano podwyższone poziomy RF IgG i RF IgA. Wiele grup badawczych doniosło, że wysoki poziom IgA RF prognozuje cięższy przebieg choroby. 7,8,9 Gdy porównuje się poziom izotypów RF z uzyskanymi w badaniach radiologicznych dowodami na nieprawidłowości w obrębie stawów, to najsilniejszą korelację można zaobserwować z podniesionym poziomem RF IgA. Pojawienie się wysokiego poziomu RF IgA w ciągu trzech lat od wystąpienia pierwszych objawów powiązano z cięższym przebiegiem choroby po sześciu latach od jej wystąpienia. 9 Już badania z 1984 roku sugerują, że wykrycie RF IgA w początkowym stadium choroby jest czynnikiem rokowniczo niekorzystnym i uzasadnia zastosowanie bardziej agresywnej metody leczenia. 10,11 Dwie różne grupy badawcze wykazały, że w praktyce podwyższony poziom RF IgG obserwuje się wyłącznie w surowicy pacjentów cierpiących na reumatoidalne zapalenie stawów a nie tych, u których występują inne choroby zapalne stawów. 12,13 Najsilniejszy związek zachodzi między RF IgG a zapaleniem naczyń występującym przy reumatoidalnym zapaleniu stawów. 11,12 Konwencjonalne metody pomiaru ilości RF IgM bazowały na aglutynacji cząstek (np. lateksu, węgla drzewnego, bentonitu lub erytrocytów) opłaszczonych ludzkim lub zwierzęcym IgG. Lateksowy test aglutynacji jest testem czułym, lecz dać może raczej dużą liczbę wyników fałszywie pozytywnych. 14 Nieswoista aglutynacja cząstek lateksowych zachodząca w surowicy pobranej od osób zdrowych nie jest niczym rzadkim. 14,15,16 Ilościowe testy serologiczne, takie jak EIA, RIA oraz analiza nefelometryczna, mają tę zaletę, że przeprowadza się obiektywny pomiar automatyczny z użyciem próbki występującej w jednym stężeniu. Metody EIA mają tę dodatkową zaletę, że w tym samym czasie można przy ich użyciu wykrywać nie tylko RF IgM, ale też RF IgG i RF IgA i nie są one podatne na efekt prozone. Stało się jasne, że dzięki wykrywaniu wszystkich trzech izotypów RF swoistość i przewidywalna wartość testu RF znacznie wzrasta. 7 Zasada badania QUANTA Lite RF IgG ELISA jest testem ELISA przeprowadzanym w mikrodołkach na fazie stałej, opracowanym w celu wykrycia RF. Mikrodołki powleka się króliczym IgG, gdyż wykazano że materiał pochodzący od królika jest bardziej swoisty, jeśli chodzi o diagnozowanie RA, niż ludzkie IgG nałożone na fazę stałą. 17 Wstępnie rozcieńczone kontrole i rozcieńczone surowice pacjentów dodaje się do oddzielnych dołków, co umożliwia związanie się wszelkich występujących w surowicy przeciwciał RF IgG z unieruchomionym antygenem. Niezwiązana próbka jest wypłukiwana i do każdego dołka dodawany jest koniugat znakowanego enzymem przeciwciała przeciw-ludzkiego IgG. Druga inkubacja umożliwia przeciwciałom przeciw-ludzkim IgG znakowanym enzymem związać się z dowolnymi przeciwciałami pacjenta, które zostały przytwierdzone do mikrodołków. Po wypłukaniu wszelkich niezwiązanych przeciwciał przeciw-ludzkich IgG znakowanych enzymem, aktywność pozostałego enzymu bada się dodając substrat chromogeniczny i mierząc intensywność powstałej barwy. Test ten można ocenić spektrofotometrycznie, poprzez zmierzenie i porównanie intensywności barwy, która powstaje w dołkach z próbkami od pacjenta z barwą dołków dla wielopunktowej krzywej wzorcowej. Odczynniki 1. Polistyrenowa płytka z mikrodołkami ELISA pokryta oczyszczonym antygenem króliczego IgG (12-1 x 8 dołków), z uchwytem w torebce foliowej zawierającej osuszacze 2. Kontrola negatywna ELISA, 1 fiolka buforu zawierająca środek konserwujący i surowicę ludzką bez ludzkich przeciwciał przeciwko RF IgG, wstępnie rozcieńczona, 1.2 ml 3. Kalibrator A RF IgG ELISA, 1 fiolka buforu zawierającego konserwant i przeciwciała surowicy ludzkiej 4. Kalibrator B RF IgG ELISA, 1 fiolka buforu zawierającego konserwant i przeciwciała surowicy ludzkiej 1

2 5. Kalibrator C RF IgG ELISA, 1 fiolka buforu zawierającego konserwant i przeciwciała surowicy ludzkiej 6. Kalibrator D RF IgG ELISA, 1 fiolka buforu zawierającego konserwant i przeciwciała surowicy ludzkiej 7. Kalibrator E RF IgG ELISA, 1 fiolka buforu zawierającego konserwant i przeciwciała surowicy ludzkiej 8. Kontrola RF IgG ELISA, 1 fiolka buforu zawierającego konserwant i przeciwciała surowicy ludzkiej przeciwko RF IgG, wstępnie rozcieńczona, 1,2 ml 9. Rozcieńczalnik do próbek HRP, 1 fiolka zabarwienie różowe, zawiera sól fizjologiczną buforowaną TRIS, Tween 20, stabilizatory białka i konserwant, 50 ml 10. Koncentrat do płukania HRP, 1 fiolka koncentratu 40x zabarwienie czerwone, zawiera sól fizjologiczną buforowaną TRIS i Tween 20, 25 ml. Instrukcje dotyczące rozcieńczania można znaleźć w sekcji Metody. 11. Koniugat HRP IgG, (królicze), przeciwciało przeciw-ludzkie IgG, 1 fiolka zabarwienie żółte, zawiera bufor, stabilizatory białka i konserwant, 10 ml 12. Chromogen TMB, 1 fiolka zawierająca stabilizatory, 10 ml 13. Roztwór zatrzymujący HRP, kwas siarkowy 0,344 M, 1 fiolka bezbarwny, 10 ml Ostrzeżenia 1. OSTRZEŻENIE: Ten produkt zawiera substancję chemiczną (0,02% chloramfenikol) w rozcieńczalniku do próbek, kontrolach i koniugacie, która według stanu Kalifornii wywołuje raka. 2. Wszystkie materiały pochodzenia ludzkiego używane w przygotowywaniu kontroli dla tego produktu zostały przetestowane i na podstawie metod zatwierdzonych przez FDA stwierdzono, że nie zawierają przeciwciał przeciwko HIV, HBsAg i HCV. Jednak żadna metoda testowania nie może całkowicie zagwarantować braku obecności HIV, HBV, HCV lub innych czynników zakaźnych. W związku z tym, kontrola RF IgG ELISA, kalibrator RF IgG ELISA oraz kontrola negatywna ELISA powinny być obsługiwane w taki sam sposób, jak materiał potencjalnie zakaźny Jako konserwant stosowany jest azydek sodu. Azydek sodu jest trucizną i może być toksyczny w przypadku połknięcia lub wchłonięcia przez skórę lub oczy. Azydek sodu może wchodzić w reakcję z ołowianą lub miedzianą instalacją wodociągową, tworząc potencjalnie wybuchowe azydki metali. Jeśli do usuwania odczynników używane są zlewy, należy przepłukiwać je dużą ilością wody, aby nie dopuścić do gromadzenia się azydku. 4. Koniugat HRP zawiera rozcieńczoną trującą/korozyjną substancję chemiczną, która może być toksyczna w przypadku spożycia w dużej ilości. Aby uniknąć potencjalnych oparzeń chemicznych, należy unikać kontaktu ze skórą i oczami. 5. Chromogen TMB zawiera środek drażniący, w który może być szkodliwy w przypadku wdychania, spożycia lub wchłonięcia przez skórę. Aby uniknąć urazów, należy unikać wdychania, spożycia lub kontaktu ze skórą i oczami. 6. Roztwór zatrzymujący HRP składa się z rozcieńczonego roztworu kwasu siarkowego. Unikać wystawienia na działanie zasad, metali lub innych związków, które mogą wchodzić w reakcje z kwasami. Kwas siarkowy jest trucizną i ma właściwości korozyjne. W razie połknięcia może być toksyczny. Aby uniknąć oparzeń chemicznych, należy unikać kontaktu ze skórą i oczami. 7. Podczas pracy z dostarczonymi odczynnikami należy stosować odpowiednie środki ochrony osobistej. 8. Rozlane odczynniki należy natychmiast usunąć. Należy przestrzegać wszystkich krajowych i lokalnych przepisów w zakresie utylizacji odpadów. Środki ostrożności 1. Ten produkt jest przeznaczony do zastosowań diagnostycznych in vitro. 2. Zastąpienie składników dostarczonych w tym systemie innymi składnikami może skutkować osiągnięciem niespójnych wyników. 3. Niepełne lub nieprawidłowe płukanie i niewystarczające usunięcie płynu z płytek z dołkami ELISA wpłynie negatywnie na precyzję badań i/lub spowoduje wysoki poziom tła. 4. Dostosowanie tego badania do stosowania ze zautomatyzowanymi analizatorami próbek oraz innymi urządzeniami do pracy z płynami, w całości lub w części, może skutkować rozbieżnością wyników w stosunku do badań przeprowadzanych ręcznie. Obowiązkiem każdego laboratorium jest potwierdzenie, że wyniki testów uzyskanych na podstawie zautomatyzowanych badań mieszczą się w akceptowalnych limitach. 5. Na wyniki analizy wpływa wiele różnych czynników. Obejmują one temperaturę początkową odczynników, temperaturę otoczenia, dokładność i powtarzalność techniki pipetowania, dokładność płukania i usuwania płynu z dołków płytek ELISA, fotometr użyty do analizy wyników oraz czasy trwania inkubacji podczas badania. Uzyskanie dokładnych i powtarzalnych wyników wymaga staranności i precyzji. 6. Zalecane jest ścisłe przestrzeganie procedury testowej. 7. Niedokładne zamknięcie torebki z zamknięciem strunowym, zawierającej płytki z mikrodołkami i osuszaczami, spowoduje degradację antygenu i brak precyzji badania. 8. Dwukrotne lub wielokrotne użycie koniugatu HRP z jednej butelki w pewnym okresie czasu może spowodować niedopuszczalnie niski poziom absorbancji. Aby nie dopuścić do takiej sytuacji istotne jest przestrzeganie wszystkich zaleceń dotyczących procedur pracy z koniugatem HRP. 2

3 9. Zanieczyszczenie chemiczne koniugatu HRP może być spowodowane nieprawidłowym czyszczeniem lub płukaniem sprzętu lub narzędzi. Pozostałości typowych laboratoryjnych substancji chemicznych, takich jak formalina, substancja wybielająca, etanol lub detergent, z czasem spowoduje degradację koniugatu HRP. Po użyciu chemicznych substancji czyszczących/dezynfekujących dokładnie wypłukać cały sprzęt i wszystkie narzędzia. Warunki przechowywania 1. Wszystkie odczynniki z zestawu przechowywać w temperaturze 2 8 C. Nie zamrażać. Odczynniki są trwałe do daty ważności, pod warunkiem, że są przechowywane i używane zgodnie z instrukcjami. 2. Nieużyte płytki z mikrodołkami pokrytymi antygenem powinny być starannie zamknięte w torebce foliowej z osuszaczami i przechowywane w temperaturze 2 8 C. 3. Rozcieńczony bufor do płukania zachowuje trwałość przez 1 tydzień w temperaturze 2 8 C. Pobieranie próbek Ta procedura powinna być wykonana z próbką surowicy. Dodanie azydku lub innych konserwantów do próbek analitycznych może mieć negatywny wpływ na wyniki. Nie używać próbek zawierających widoczne zanieczyszczenia, skażonych bakteryjnie lub podgrzanych. Należy unikać całkowicie zhemolizowanej lub lipemicznej surowicy albo próbek. Po pobraniu surowica powinna być oddzielona od skrzepu. Dokument CLSI (NCCLS) H18-A2 zaleca następujące warunki przechowywania próbek: 1) Przechowywać próbki w temperaturze pokojowej nie dłużej niż 8 godzin. 2) Jeśli badanie nie zostanie zakończone w ciągu 8 godzin, schłodzić próbkę do temperatury 2 8 C. 3) Jeśli badanie nie zostanie ukończone w ciągu 48 godzin lub w przypadku transportu próbki, należy zamrozić ją w temperaturze -20 C lub niższej. Zamrożone próbki po rozmrożeniu i przed badaniem muszą zostać dobrze wymieszane. Badanie Dostarczone materiały 1 Płytka z mikrodołkami RF IgG ELISA (12-1 x 8 dołków), z uchwytem 1 1,2 ml wstępnie rozcieńczonej kontroli negatywnej testu ELISA 1 1,2 ml wstępnie rozcieńczonego kalibratora A RF IgG testu ELISA 1 1,2 ml wstępnie rozcieńczonego kalibratora B RF IgG testu ELISA 1 1,2 ml wstępnie rozcieńczonego kalibratora C RF IgG testu ELISA 1 1,2 ml wstępnie rozcieńczonego kalibratora D RF IgG testu ELISA 1 1,2 ml wstępnie rozcieńczonego kalibratora E RF IgG testu ELISA 1 1,2 ml wstępnie rozcieńczonej kontroli RF IgG testu ELISA 1 50 ml rozcieńczalnika do próbek HRP 1 25 ml koncentratu do płukania HRP, koncentrat 40x 1 10 ml koniugatu przeciwciała IgG HRP, (królicze), przeciw-ludzkie IgG 1 10 ml chromogenu TMB 1 10 ml roztworu zatrzymującego HRP, kwas siarkowy 0,344M Wymagane materiały nie dołączone do zestawu Mikropipety na 5, 100, i 500 µl Jednorazowe końcówki mikropipet Probówki do roztworów próbek pochodzących od pacjenta, 4 ml objętości Woda destylowana lub dejonizowana Naczynie o objętości 1 l do rozcieńczonego koncentratu HRP do płukania Czytnik płytek z mikrodołkami umożliwiający pomiar gęstości optycznej przy 450 nm (i przy 620 nm dla odczytów przy dwóch długościach fali) Sposób przygotowania Przed rozpoczęciem 1. Doprowadzić wszystkie odczynniki i próbki do temperatury pokojowej (20-26 o C) i dobrze wymieszać. 2. Rozcieńczyć koncentrat do płukania HRP w stosunku 1:40, dodając zawartość butelki koncentratu do płukania HRP do 975 ml wody destylowanej lub dejonizowanej. Jeśli cała płytka nie zostanie przetworzona w tym czasie, można przygotować mniejszą ilość. W tym celu należy dodać 2,0 ml koncentratu do 78 ml wody destylowanej lub dejonizowanej na każde 16 dołków, które będą użyte. Rozcieńczony bufor zachowuje trwałość przez 1 tydzień w temperaturze 2 8 o C. 3. Przygotowanie krzywej wzorcowej: W celu wykreślenia 5-punktowej krzywej wzorcowej należy zastosować WSTĘPNIE ROZCIEŃCZONE kalibratory A-E RF IgG ELISA pobrane bezpośrednio z fiolki. Pięciopunktowa krzywa wzorcowa ma następujące wartości: Punkt A Wstępnie rozcieńczony kalibrator A RF IgG ELISA 100,0 B Wstępnie rozcieńczony kalibrator B RF IgG ELISA 50,0 C Wstępnie rozcieńczony kalibrator C RF IgG ELISA 25,0 D Wstępnie rozcieńczony kalibrator D RF IgG ELISA 12,5 E Wstępnie rozcieńczony kalibrator E RF IgG ELISA 5,0 Jednostki RF IgG 3

4 4. Przygotować roztwór 1:101 każdej próbki pobranej od pacjenta, dodając 5 µl próbki do 500 µl rozcieńczalnika do próbek HRP. Rozcieńczone próbki muszą być użyte w ciągu 8 godzin od przygotowania. NIE ROZCIEŃCZAĆ kontroli RF IgG ELISA, kalibratorów RF IgG ELISA i kontroli negatywnej ELISA 1: W celu stwierdzenia obecności lub braku RF IgG z zastosowaniem jednostek arbitralnych, potrzebne są po dwa dołki na każdy kalibrator i jeden do dwóch dołków na każdą próbkę pochodzącą od pacjenta. Zalecane jest wykonanie duplikatów próbek. Procedura badania 1. WSZYSTKIE ODCZYNNIKI PRZED ROZPOCZĘCIEM BADANIA MUSZĄ BYĆ DOPROWADZONE DO TEMPERATURY POKOJOWEJ (20 26 C). Umieścić wymaganą liczbę mikrodołków/pasków w uchwycie. Natychmiast umieścić nieużywane płytki w torebce foliowej zawierającej osuszacz i dobrze ją zamknąć, aby ograniczyć kontakt z parą wodną. 2. Do dołków dodać 100 µl wstępnie rozcieńczonych kalibratorów RF IgG ELISA, wstępnie rozcieńczonej kontroli RF IgG ELISA, kontroli negatywnej ELISA i rozcieńczonych próbek pochodzących od pacjentów. Przykryć dołki i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej na równej powierzchni. Czas inkubacji rozpoczyna się po dodaniu ostatniej próbki. 3. Etap płukania: Odessać całkowicie zawartość każdego dołka. Dodać µl rozcieńczonegobuforu do płukania HRP do wszystkich dołków, a następnie odessać. Powtórzyć tę sekwencję jeszcze dwukrotnie, aby łącznie przeprowadzić trzy płukania. Odwrócić płytkę i postukać w nią na materiale pochłaniającym w celu usunięcia pozostałości płynu po ostatnim płukaniu. Ważne jest, aby całkowicie opróżnić każdy dołek po każdym etapie płukania. Zachować tę samą sekwencję odsysania, jak w przypadku dodawania próbki. 4. Do każdego dołka dodać 100 μl koniugatu RF HRP IgG. Koniugat powinien być usunięty z butelek z zastosowaniem standardowych warunków aseptycznych oraz zalecanych technik laboratoryjnych. Pobrać z butelki jedynie wymaganą do analizy ilość koniugatu. ABY UNIKNĄĆ POTENCJALNEGO ZANIECZYSZCZENIA BAKTERYJNEGO I/LUB CHEMICZNEGO, NIE WOLNO WLEWAĆ NIEUŻYTEGO KONIUGATU Z POWROTEM DO BUTELKI. Inkubować dołki przez 30 minut jak w etapie Etap płukania: Powtórzyć etap Dodać 100 µl chromogenu TMB do każdego dołka i inkubować w ciemności przez 30 minut w temperaturze pokojowej. 7. Do każdego dołka dodać 100 µl roztworu zatrzymującego HRP. Zachować tę samą sekwencję i czas dodawania roztworu zatrzymującego HRP, jak w przypadku chromogenu TMB. Delikatnie postukać płytkę palcem, aby dokładnie wymieszać zawartość dołków. 8. W ciągu jednej godziny od zatrzymania reakcji odczytać absorbancję (gęstość optyczną) każdego dołka przy długości fali 450 nm. Jeśli wymagane są pomiary bichromatyczne, referencyjną długością fali może być długość 620 nm. Kontrola jakości 1. Aby upewnić się, że wszystkie odczynniki i procedury funkcjonują prawidłowo, każdą serię próbek należy testować wraz z kontrolą RF IgG ELISA, kalibratorami RF IgG ELISA i kontrolą negatywną ELISA. 2. Należy zauważyć, że ponieważ kontrola RF IgG ELISA, kalibratory RF IgG ELISA i kontrola negatywna ELISA są już wstępnie rozcieńczone, to nie będą one stanowić kontroli w przypadku procedur związanych z rozcieńczaniem próbek. 3. Dodatkowe kontrole mogą być przebadane zgodnie z wytycznymi lub wymaganiami lokalnych i/lub krajowych przepisów lub organów normalizacyjnych. Dodatkowe odpowiednie surowice kontrolne można przygotować, dzieląc połączone próbki surowicy ludzkiej i przechowując je w temperaturze -20 C. 4. Aby wyniki badania mogły być uznane jako ważne, muszą zostać spełnione wszystkie poniższe kryteria. Jeśli jakiekolwiek kryterium nie będzie spełnione, badanie powinno być traktowane jako nieważne i powinno zostać powtórzone. a. Absorbancja wstępnie rozcieńczonego kalibratora A RF IgG ELISA musi być większa niż absorbancja wstępnie rozcieńczonej kontroli RF IgG ELISA, która musi być większa niż absorbancja wstępnie rozcieńczonej kontroli negatywnej ELISA. b. Absorbancja wstępnie rozcieńczonego kalibratora A RF IgG ELISA musi być większa niż 0,8, a absorbancja wstępnie rozcieńczonej kontroli negatywnej ELISA nie może być większa niż 0,2. c. Absorbancja kontroli RF IgG ELISA musi ponad dwukrotnie przewyższać absorbancję kontroli negatywnej ELISA lub powinna przekraczać 0,25. d. Stężenie kontroli RF IgG musi mieścić się w zakresie podanym na etykiecie. e. Dodatkowe wytyczne dotyczące odpowiednich praktyk QC można znaleźć w dokumencie CLSI (NCCLS) C24-A. Obliczanie wyników 1. Ustalić wartość średnią wszystkich zdublowanych odczytów. 2. Nanieść średnią absorbancję (gęstość optyczną) próbek w krzywej wzorcowej w odniesieniu do ich wartości w jednostkach. Zastosować dopasowanie krzywej metodą regresji liniowej na skali logarytmicznej. Jednostki przypisane do kalibratorów można znaleźć na fiolce kalibratora. 3. Ustalić nieznane stężenie RF IgG z osi X, odczytując odpowiednią absorbancję na osi Y. 4

5 Interpretacja wyników Badanie ELISA jest bardzo wrażliwe na technikę i jest w stanie wychwycić nawet najdrobniejsze różnice w populacjach pacjentów. Poniższe wartości są jedynie wartościami sugerowanymi. Każde laboratorium powinno ustalić własny normalny zakres na podstawie własnych technik, kontroli, sprzętu i populacji pacjentów, zgodnie z własnymi ustalonymi procedurami. Próbka następnie może być sklasyfikowana jako negatywna lub pozytywna, zgodnie z poniższą tabelą. Jednostki Negatywny 6 Pozytywny >6 1. Wynik pozytywny wskazuje na obecność przeciwciał RF IgG i sugeruje możliwość wystąpienia reumatoidalnego zapalenia stawów. 2. Wynik negatywny świadczy o tym, że nie występują przeciwciała RF IgG, lub że ich poziom jest poniżej dolnej wartości granicznej badania. 3. Zalecane jest, aby wyniki raportowane przez laboratorium zawierały oświadczenie: Poniższe wyniki uzyskano stosując zestaw testowy INOVA QUANTA Lite RF IgG ELISA. Nie można stosować zamiennie wartości RF IgG uzyskanych przy zastosowaniu metod testowych innych producentów. Rząd wielkości poziomów raportowanego IgG nie może być skorelowany z mianem punktu końcowego. Ograniczenia badania 1. W teście tym obecność kompleksów immunologicznych lub innych agregatów immunoglobuliny w próbce pochodzącej od pacjenta może powodować podwyższony poziom nieswoistego wiązania i wytwarzać fałszywe pozytywne wyniki. 2. Nie można postawić diagnozy na podstawie samych wyników dla RF. Te wyniki muszą być interpretowane razem z wynikami fizycznymi. 3. Nie wolno rozpocząć leczenia jedynie na podstawie dodatniego miana RF. Muszą być również wykazane uzasadniające wskazania kliniczne. 4. RF może występować przejściowo podczas wielu infekcji. Pacjenci z pozytywnym wynikiem RF powinni być poddani ponownym badaniom po upływie odpowiedniego czasu. 5. Wyniki tego badania powinny być użyte w powiązaniu z wynikami klinicznymi i innymi badaniami serologicznymi. 6. Charakterystyka wyników badania nie została ustanowiona dla podłoża innego niż surowica. Spodziewane wartości Normalny zakres Na obecność RF IgG przebadano 180 losowych próbek pochodzących od zdrowych pacjentów, 86 mężczyzn i 94 kobiet, w wieku od 15 do 72 lat. Tylko 4 próbek (2,2%) dało wynik pozytywny (powyżej 6- jednostkowej wartości granicznej). Jedna z tych czterech pozytywnych próbek dała również pozytywny wynik dla RF IgA i RF IgM. Poza wspomnianymi czterema próbkami, które dały wynik pozytywny, najsilniej reagująca próbka z grupy osób zdrowych uzyskała 1,5 jednostki a wszystkie pozostałe próbki uzyskały wynik poniżej 1 jednostki. Wartości czterech pozytywnych próbek wynosiły 7,9, 9, 11,1 i 21 jednostek. Swoistość i wrażliwość względna Zestaw QUANTA Lite RF IgG ELISA poddano ocenie w 2 zewnętrznych i 1 wewnętrznym badaniu klinicznym. Wyniki tych badań podsumowano poniżej: Grupa pacjentów Nr Liczba osób z wykrytym RF IgG % Normalne ,2 Reumatoidalne zapalenie stawów ,0 Postać ciężka* ,0 Postać łagodna** ,0 Seroujemny 9 0 0,0 Młodzieńcze reumatoidalne zapalenie stawów ,0 Łuszczycowe zapalenie stawów ,4 SLE 5 0 0,0 *Średnia wartość uzyskana w grupie z ciężką postacią choroby wynosiła 38,3 jednostki. **Średnia wartość uzyskana w grupie z łagodną postacią choroby wynosiła 20,4 jednostki. 5

6 Test QUANTA Lite RF IgG ELISA porównano z innym, dostępnym w handlu zestawem RF IgG ELISA. Precyzję testu oceniono wykorzystując do tego celu 36 próbek przesłanych do rutynowych badań w kierunku RF. Poniżej zostały przedstawione wyniki. INOVA * Wrażliwość względna 64,5% Referencje Swoistość względna 100% Skuteczność względna 69,4% *5 spośród tych 11 próbek dało wynik słabo pozytywny w metodzie referencyjnej a 5 próbek pochodziło od pacjentów ze zdiagnozowanym SLE. Precyzja i powtarzalność Precyzję i powtarzalność testu określono przeprowadzając sześć powtórzeń każdej negatywnej, słabo pozytywnej i silnie pozytywnej próbki w sześciu oddzielnych testach. Średnia wyników silnie pozytywnych wyniosła 87, słabo pozytywnych wyniosła 27,7, a negatywnych 5,6. Poniżej znajduje się podsumowanie odchylenia standardowego oraz współczynnika zmienności dla każdej próbki. Negatywny Słabo pozytywna Silnie pozytywna SD CV SD CV SD CV Łącznie 0,32 5,6% 1,63 5,9% 3,56 4,1% W ramach serii 0,27 4,9% 1,42 5,2% 4,42 5,2% Pomiędzy seriami 0,31 5,5% 1,09 3,9% 2,98 3,4% 6

7 Piśmiennictwo 1. Waaler, E. On the occurrence of a factor in human serum activating the specific agglutination of sheep blood corpuscles. Acta Pathol Microbiol Scan. 17: , Rose HM, Ragan C, Pearce E, and Lipmann MO. Differential agglutination of normal and sensitized sheep erythrocytes by sera of patients with rheumatoid arthritis. Proc Soc Exp Biol Med. 68: 1-11, Cathcart ES. Rheumatoid Factors in Laboratory Diagnostic Procedures in the Rheumatic Diseases. 2nd ed. Cohen AS (ed.). Boston, MA: Little, Brown & Co. p. 104, Freyberg RH. Differential Diagnosis of Arthritis. Postgrad Med. 51(20): 22-27, Lawrence JS, Locke GR and Ball J. Rheumatoid Serum Factor in Populations in the U.K.I. Lung Disease and Rheumatoid Serum Factor. Clin Exp Immunol. 8: 723, Linker JB III and Williams RC Jr. Tests for detection of rheumatoid factors, In: Rose NR, Freidman H, and Fahey JL (eds.). In: Man Clin Lab Immunol, 3rd Ed. Wash, DC: ASM; , Jonsson T and Valdimarsson H. Is measurement of rheumatoid factor isotypes clinically useful? Annals of the Rheumatic Diseases. 52(2): , Jonsson T and Valdimarsson H. Clinical significance of rheumatoid factor isotypes in seropositive arthritis. Rheumatology Intl. 12(3): , van Zeben D, Hazes JMV, Zwinderman AH, Cats A, van der Voort EAM and Breedveld FC. Clinical significance of rheumatoid factors in early rheumatoid arthritis: results of a follow up study. Annals of the Rheumatic Diseases. 51(9): , Teitsson I, Withrington RH, Seifert MH and Valdimarsson H. Prospective study of early rheumatoid arthritis. Prognostic value of IgA rheumatoid factor. Annals of Rheumatic Diseases. 43: , Silvestris F, Goodwin JS and Williams RC Jr. IgM, IgA and IgG rheumatoid factors in patients with rheumatoid arthritis and normal donors. Clinical Rheumatology. 4: , Allen C, Elson CJ, Scott DGI, Bacon PA and Bucknall RC. IgG antiglobulins in rheumatoid arthritis and other arthritides: relationship with clinical features and other parameters. Annals of the Rheumatic Diseases. 40: , Pope RM and McDuffy SJ. IgG rheumatoid factor relationship to seropositive rheumatoid arthritis and absence in seronegative disorders. Arthritis Rheum. 22: , Singer JM and Plotz CM. The Latex Test, I. Application to the Serological Diagnosis of Rheumatoid Arthritis. Am J Med. 21: 888, Waller M, Toone EC and Vaughn C. Study of Rheumatoid Factor in the Normal Population. Arthritis Rheum. 7: , Shimmerling RH and Belbanco TL. The Rheumatic Factor: An Analysis of Clinical Utility. The American Journal of Medicine. 91: 530, Tuomi T. Which antigen to use in the detection of rheumatoid factors? Comparison of patients with rheumatoid arthritis and subjects with "false positive" rheumatoid factor reactions. Clin Exp Immunol. 77:349, Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. Center for Disease Control/National Institute of Health, 2007, Fifth Edition. 7

8 QUANTA Lite i INOVA Diagnostics, Inc. są zastrzeżonym znakiem handlowym firmy Copyright Wszelkie prawa zastrzeżone Wyprodukowano przez: INOVA Diagnostics, Inc Old Grove Road San Diego, CA Stany Zjednoczone Ameryki Pomoc techniczna (tylko na terenie Stanów Zjednoczonych i Kanady): Pomoc techniczna (poza terenem Stanów Zjednoczonych): support@inovadx.com Autoryzowani przedstawiciele na terenie Unii Europejskiej: Medical Technology Promedt Consulting GmbH Altenhofstrasse 80 D St. Ingbert, Niemcy Tel.: Faks.: Sierpień 2011 Wersja 0 8