PRACE ORYGINALNE Dorota LINK-LENCZOWSKA Tomasz SACHA Magdalena ZAWADA Sylwia CZEKALSKA Izabela FLOREK Aleksander B. SKOTNICKI Nietypowe odmiany transkryptu BCR-ABL u chorych na przewlekłą białaczkę szpikowąschemat postępowania diagnostycznego w monitorowaniu minimalnej choroby resztkowej Atypical BCR-ABL transcripts in patients with chronic myeloid leukemia-the scheme for the diagnosis and monitoring of minimal residual disease Katedra i Klinika Hematologii Collegium Medicum UJ w Krakowie Kierownik: Prof. dr hab. med. Aleksander B. Skotnicki Dodatkowe słowa kluczowe: przewlekła białaczka szpikowa rzadkie geny fuzyjne BCR-ABL minimalna choroba resztkowa metody molekularne Additional key words: chronic myeloid leukemia rare fusion gene BCR-ABL minima residual disease molecular methods Adres do korespondencji: Dorota Link-Lenczowska Katedra i Klinika Hematologii Collegium Medicum UJ w Krakowie ul. Kopernika 17, 31-501 Kraków, Polska Tel.: +48 12 424 76 00; Fax +48 12 424 74 26; e-mail: d.link.lenczowska@gmail.com Ponad 95% pacjentów, u których stwierdzono obecność translokacji t(9;22) charakteryzuje fuzja egzonów e13 lub e14 genu BCR, znajdujących się w rejonie z egzonem a2 genu ABL. Tak powstałe połączenia genów są opisywane odpowiednio jako b2a2 (e13a2) oraz b3a2 (e14a2). Pozostałe fuzje egzonów e1, e6, e8, e12, e19, e20 genu BCR z egzonami a2 lub a3 genu ABL, występują bardzo rzadko i prowadzą do powstania tzw. nietypowych genów fuzyjnych BCR-ABL. Celem niniejszej pracy jest przedstawienie wieloletnich obserwacji dotyczących występowania nietypowych wariantów genu fuzyjnego BCR-ABL w populacji chorych na przewlekłą białaczkę szpikową oraz rutynowego postępowania w ich diagnostyce. Przeważającą większość wśród chorych z wykrytym genem BCR-ABL stanowiły transkrypty b3a2 oraz b2a2. Pozostałe wykryte warianty, które opisano jako tak zwane rzadkie to: e1a2, b2a3, b3a3, c3a2, e6a2, e6a3. Na etapie diagnozy jak i podczas monitorowania efektów leczenia chorych na CML wykorzystano metody molekularne opierające się o łańcuchową reakcję polimerazy (RT- PCR typu multipleks, RT-PCR typu nested, RQ-PCR). Reakcja RT-PCR typu multipleks dała możliwość wykrycia wariantów genu fuzyjnego BCR-ABL w jednej reakcji oraz była kluczowa w doborze odpowiedniego testu służącego do dalszego monitorowania przebiegu choroby i skuteczności leczenia. W artykule zaproponowano schemat postępowania diagnostycznego i monitorowania MRD u chorych z CML leczonych TKI w przypadku obecności rzadkich fuzji genów BCR i ABL. Wstęp U niemal wszystkich chorych na przewlekłą białaczkę szpikową (CML, Chronic Myeloid Leukemia) wykrywany jest chromosom Philadelphia (Ph) z genem fuzyjnym BCR-ABL [1]. Gen ten powstaje w wyniku przeniesienia fragmentu długiego ramienia chromosomu 9 zawierającego gen ABL na More than 95% of patients with detected translocation t(9;22), is characterized by the fusion between exons e13 or e14 of BCR gene, which are located in major breakpoint cluster region () and exon a2 of ABL gene. These fusions are described as b2a2 (e13a2) and b3a2 (e14a2). Other fusions of exons e1, e6, e8, e12, e19, e20 of BCR gene with exons a2 or a3 of ABL gene occur very rarely and lead to formation of so called unusual fusion BCR-ABL genes. The aim of this study is to describe long-term observations of the occurrence and routine procedure in the diagnosis of atypical variants of the fusion gene BCR-ABL in a population of patients with chronic myeloid leukemia (CML). It was found that the vast majority of patients with detected BCR-ABL transcripts were b3a2 and b2a2. Other detected variants, which are described as rare were: e1a2, b2a3, b3a3, c3a2, e6a2, e6a3. At the stage of diagnosis as well as during monitoring of the effects of treatment, molecular methods which are based on polymerase chain reaction were used (multiplex RT-PCR, nested RT-PCR, RQ-PCR). Multiplex RT-PCR reaction gave possibility to detect variants of the fusion BCR-ABL gene in one reaction and was crucial in the selection of appropriate test used for further monitoring of the disease and the effectiveness of treatment. This paper proposes a scheme for dealing with the diagnosis and monitoring of minimal residual disease (MRD) in patients with CML treated with tyrosine kinase inhibitors (TKIs) in the presence of rare fusion of the BCR and ABL genes. długie ramię chromosomu 22, który pęka w rejonie genu BCR [2]. Struktura tak powstałego genu fuzyjnego nie jest jednorodna i można wyróżnić kilka jego typów. Jednak niezależnie od tej zmienności, gen fuzyjny BCR-ABL uważany jest za główny czynnik prowadzący do transformacji nowotworowej w CML [3-5]. W wyniku powstałej transloka- 258 D. Link-Lenczowska i wsp.
cji syntetyzowane jest nieprawidłowe białko fuzyjne, wykazujące zwiększoną aktywność kinazy tyrozynowej, które aktywuje wiele dróg przekazywania sygnałów [6]. Stwierdzono, że powstałe białko bcr-abl zaburza funkcję integryn, zmniejszając przyleganie komórek prekursorowych do podścieliska, ma zdolność zwiększania ekspresji niektórych czynników transkrypcyjnych oraz hamuje proces apoptozy komórek krwiotwórczych [7]. Opisano cztery miejsca złamań w obrębie genu BCR: (major breakpoint cluster region), m-bcr (minor breakpoint cluster region), μ-bcr (micro breakpoint cluster region) oraz ν-bcr (nano breakpoint cluster region) (Tab. I) [8-10]. Ponad 95% pacjentów, u których stwierdzono obecność translokacji t(9;22) charakteryzuje fuzja egzonów e13 lub e14 genu BCR, znajdujących się w rejonie z egzonem a2 genu ABL [11]. Tak powstałe połączenia genów są opisywane odpowiednio jako b2a2 (e13a2) oraz b3a2 (e14a2). Pozostałe fuzje egzonów e1, e6, e8, e12, e19, e20 genu BCR z egzonami a2 lub a3 genu ABL, występują bardzo rzadko i prowadzą do powstania tzw. nietypowych genów fuzyjnych BCR-ABL (Ryc. 1) [5,12-16]. Dodatkowo, w szczególnych przypadkach opisano obecność transkryptów BCR-ABL z insercją sekwencji intronowej [11,17-19]. Liczne badania potwierdzają dużą różnorodność wynikającą ze zmiennej rearanżacji genu fuzyjnego BCR-ABL [20]. Zagadnienie wpływu typu genu fuzyjnego BCR-ABL na obraz kliniczny choroby [1] oraz skuteczność terapii z wykorzystaniem inhibitorów kinazy tyrozynowej (TKI, tyrosine kinase inhibitor) jest przedmiotem zainteresowania badaczy [21], dlatego istotne jest aby zapewnić pacjentom możliwość wykrycia poszczególnych typów genu BCR-ABL na etapie rozpoznania choroby jak i w trakcie leczenia [5,20]. Metody molekularne opierające się o łańcuchową reakcję polimerazy (PCR, polymerase chain reaction) znalazły powszechne zastosowanie zarówno na etapie diagnozy (technika RT-PCR typu multipleks, w której wykorzystuje się zestaw kilku par starterów w jednej reakcji [22]) jak i podczas monitorowania efektów leczenia chorych na CML (technika RQ-PCR oraz gniazdowa reakcja RT-PCR) [11]. RQ-PCR umożliwia ilościowy pomiar liczby kopii analizowanego genu w czasie rzeczywistym [23], natomiast gniazdowa reakcja RT-PCR, wykorzystywana w sytuacji negatywnego wyniku w RQ-PCR, umożliwia dalsze monitorowanie minimalnej choroby resztkowej (MRD, minimal residual disease) z dużą czułością [24,25]. Celem niniejszej pracy jest przedstawienie wieloletnich obserwacji dotyczących występowania nietypowych wariantów genu fuzyjnego BCR-ABL w populacji chorych na przewlekła białaczkę szpikową, zdiagnozowanych w Klinice Hematologii SU w Krakowie w latach 2001-2013 i sposobu rutynowego postępowania diagnostycznego u tych pacjentów. Materiały i metody Grupę badanych stanowiło 609 chorych na przewlekłą białaczkę szpikową (288 kobiet i 321 mężczyzn) zdiagnozowanych w Klinice Hematologii SU w Krakowie od 2001 do 2013 roku. Średni wiek pacjentów w chwili diagnozy wynosił 51,6 lat (1-86). Do oceny obecności genu BCR-ABL pobierano krew obwodową na EDTA w proporcji 9:1. Następnie izolowano komórki jądrzaste przeprowadzając lizę erytrocytów za pomocą chlorku amonu (NH 4 Cl). Izolację całkowitego RNA z komórek zawieszonych w odczynniku TRIzol wykonywano według metody Chomczyńskiego/Sacchi [26]. Ocenę stężenia uzyskanego RNA dokonywano na podstawie pomiaru spektrofotometrycznego przy długości fali 260nm, jednocześnie oceniając czystość preparatu na podstawie stosunku A 260nm /A 280nm. Reakcję odwrotnej Tabela I Klasyfikacja najczęściej występujących typów genów fuzyjnych BCR-ABL. Classification of the most common BCR-ABL fusion genes. transkrypt fuzyjny BCR-ABL miejsce złamań w genie BCR transkrypcji (RT, reverse transcription) przeprowadzano z 2 μg RNA. Następnie przeprowadzano jakościową reakcję łańcuchową polimerazy typu multipleks [27]. Do reakcji wykorzystywano 4 startery specyficzne dla różnych wariantów genu fuzyjnego: BCR b1 A (5 -GAA GTG TTT CAG AAG CTT CTC C-3 ), BCR e1 A (5 -GAC TGC AGC TCC AAT GAG AAC-3 ), BCR e6 S2 (5 -GAC TTA CCT GAG CCA CCT GGA G-3 ), BCR c3 A (5 -ACG GCG AGA GCA CGG ACA-3 ), łączące się z określonym fragmentem genu BCR i 1 wspólny ABLa3 B (5 -GTT TGG GCT TCA CAC CAT TCC-3 ), komplementarny do genu ABL. Amplifikację prowadzono w objętości 25 μl, następnie białko fuzyjne e13a2 (b2a2) p210 e14a2 (b3a2) p210 e1a2 m-bcr p190 e19a2 (c3a2) μ-bcr p230 e13a3 (b2a3) e14a3 (b3a3) e6a2 e6a3 e1a3 e12a3 (b1a3) e19a3 (c3a3) e20a2 (c4a2) v-bcr v-bcr m-bcr μ-bcr μ-bcr e8a2 - Rycina 1 Rejony złamań w obrębie genu BCR (ν-bcr,, μ-bcr, ) i ABL oraz schematy przykładowych transkryptów fuzyjnych BCR-ABL: b3a2 (e14a2), b2a2 (e13a2), e1a2, c3a2 (e19a2), b2a3 (e13a3), e6a2, e1a3. Breakpoint cluster region in BCR (ν-bcr,, μ-bcr) and ABL genes and scematic representation of selected BCR- ABL transcripts: b3a2 (e14a2), b2a2 (e13a2), e1a2, c3a2 (e19a2), b2a3 (e13a3), e6a2, e1a3. Przegląd Lekarski 2014 / 71 / 5 259
produkty reakcji PCR rozdzielano w 2% żelu agarozowym względem standardu masowego. Odpowiednie warianty BCR- ABL identyfikowano na podstawie wielkości produktu reakcji PCR (Tab. II). W przypadku podejrzenia nietypowego transkryptu całą procedurę powtarzano z odrębnego RNA w celu potwierdzenia wyniku. Jeżeli otrzymany produkt był niejednoznaczny odpowiedni prążek wycinano z żelu, oczyszczano i poddawano sekwencjonowaniu. Dalsze monitorowanie obecności genu BCR-ABL prowadzono z wykorzystaniem metody RQ-PCR pozwalającej na ilościową analizę ekspresji genu BCR-ABL. Badanie ilościowe wykonywano zgodnie z technologią TaqMan [27]. Liczbę kopii genu BCR- ABL normalizowano względem liczby kopii genu ABL. Obliczano stosunek BCR-ABL/ ABL, który wyrażano w procentach. Precyzyjną analizę ilościową wykonywano w oparciu o krzywą standardową sporządzaną z wykorzystaniem seryjnych rozcieńczeń standardów dla genu BCR/ABL oraz ABL o znanej liczbie kopii. W sytuacji otrzymania wyniku negatywnego rozpoczynano kontrolę obecności transkryptu z zastosowaniem metody nested RT-PCR. Reakcja ta polegała na dwuetapowej amplifikacji, w której produkt powstający w PCR zewnętrznym służył jako matryca powielana w PCR wewnętrznym [27]. Rozdziału elektroforetycznego dokonywano w 2% żelu agarozowymi i na tej podstawie, oceniano obecność lub brak produktu reakcji. Tabela II Wielkości produktów reakcji RT-PCR typu multipleks, charakterystycznych dla poszczególnych wariantów genu fuzyjnego BCR-ABL. The size of the products of multiplex RT-PCR reaction, specific to particular variants of the fusion gene. transkrypt fuzyjny BCR-ABL b3a2 59,2% (365) Wyniki Przeważającą większość wśród 609 chorych z wykrytym genem BCR-ABL, stanowią transkrypty b3a2 (365 przypadków, 59,2% pacjentów) oraz b2a2 (237, 38,4%). Pozostałe warianty określono jako tak zwane rzadkie, wykrywając geny fuzyjne: e1a2 (5, 0,8%), b2a3 (3, 0,5%), b3a3 (2, 0,3%), c3a2 (2, 0,3%), e6a2 (2, 0,3%), e6a3 (1, 0,2%). Pośród wszystkich przebadanych, 1,3% przypadków charakteryzowała jednoczesna obecność dwóch translokacji w kombinacjach: b2a2 i b3a2 (6 osób), b2a2 i e1a2 (1 osoba) oraz b2a3 i e1a2 (1osoba). Ilościowy rozkład typów transkryptów charakteryzujący populację chorych na CML, diagnozowanych w Klinice Hematologii SU w Krakowie przedstawia Rycina 2. Wdrożenie metody RT-PCR typu multipleks umożliwiło wykrycie genu fuzyjnego BCR-ABL i różnych typów jego rearanżacji u wszystkich diagnozowanych chorych z podejrzeniem CML. Kluczowym okazało się zastosowanie odpowiedniego zestawu starterów w jednej reakcji. Wybór startera ABLa3B specyficznego dla egzonu 3 genu ABL umożliwia detekcję fuzji zarówno z egzonem 2 genu ABL (a2) jak i egzonem 3 (a3). Starter BCRe1A dla egzonu 1 (e1) w genie BCR pozwala na detekcję transkryptów z grupy m-bcr, a starter BCRb1A dla egzonu 12 (b1) na detekcję transkryptów należących do rodziny. Z kolei wykrycie transkryptów μ-bcr i ν-bcr umożliwiają startery BCR3cA i BCRe6S2 odpowiednio dla egzonu 19 (c3) i 6 (e6). Pozytywny wynik reakcji RT-PCR typu multipleks wykrywający obecność atypowych transkryptów w badanym materiale genetycznym, przeanalizowanym w okresie 2001-2013 przedstawiono w postaci elektroforegramu (Ryc. 3). W przypadku 3 typów rzadkich wariantów BCR-ABL: b2a3, b3a3 oraz c3a2, obecność transkryptów w kolejnych punktach czasowych od rozpoczęcia leczenia z zastosowaniem TKI kontrolowano z wykorzystaniem metody RT-PCR typu gniazdowego (nested RT-PCR) z odpowiednim zestawem starterów dedykowanych do analizy transkryptów b2a2 i b3a2. W tych przypadkach wykonanie badania ilościowego RQ-PCR nie było możliwe z racji braku dostępności plazmidów niezbędnych do sporządzenia krzywej standardowej. Do monitorowania liczby transkryptu e1a2 wykorzystano zarówno test RQ-PCR jak i RT-PCR typu nested. Serie rozcieńczeń plazmidu m-bcr niezbędnego do wyznaczenia punktów krzywej standardowej pozwoliły na obliczenie liczby kopii e1a2, a tym samym na określenie poziomu ekspresji genu w danym punkcie czasowym. W momencie uzyskania wyniku negatywnego w reakcji RQ-PCR, rozpoczynano monitorowanie wielkość produktu PCR (pz) b2a2 342 b3a2 417 e1a2 521 c3a2 586 b2a3 168 b3a3 243 e6a2 621 e6a3 447 e1a3 347 c3a3 412 e1a2 0,8% (5) b2a3 0,5% (3) b3a3 0,3% (2) e6a3 0,2% (1) c3a3 0,3%(2) e6a2 0,3 % (2) b2a2 38,4% (237) Rycina 2 Odsetek ekspresji wariantów genu BCR-ABL u chorych na CML diagnozowanych w Klinice Hematologii SU w Krakowie w latach 2001-2013, n=609. The percentage of expression of the gene variants of BCR-ABL in CML patients diagnosed in the Department of Hematology SU in Krakow in the years 2001-2013, n = 609. MRD za pomocą testu RT-PCR typu nested z zestawem starterów do analizy e1a2. W przypadku translokacji e6a2 i e6a3 dalsze monitorowanie choroby było możliwe jedynie z wykorzystaniem jakościowej metody RT-PCR typu multipleks. Startery stosowane w RT-PCR typu nested do wykrywania fuzji b2a2, b3a3 oraz e1a2 okazały się w tym przypadku nieprzydatne. Dyskusja Wykorzystanie reakcji RT-PCR typu multipleks daje możliwość wykrycia wariantów genu fuzyjnego BCR-ABL w jednej reakcji [22]. Zastosowanie tej metody na etapie rozpoznania okazuje się kluczowe dla wyboru odpowiedniego testu (RQ-PCR, RT-PCR typu nested) służącego do dalszego monitorowania przebiegu choroby i skuteczności leczenia z równoczesnym wykluczeniem wyników fałszywie negatywnych. Dodatkowym postępowaniem diagnostycznym w przypadku wykrycia nietypowych transkryptów powinno być potwierdzenie wyniku przez sekwencjonowanie produktu PCR 260 D. Link-Lenczowska i wsp.
2642 700 600 500 350 250 100 50 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Rycina 3 Przykładowy rozdział elektroforetyczny produktów amplifikacji genu fuzyjnego BCR-ABL po reakcji RT-PCR typu multipleks. Ścieżka 1, 12 przedstawia standard masowy DNA (50-750pz). Ścieżka 6 przedstawia cdna uzyskane od osoby zdrowej, jest to kontrola czystości izolacji RNA oraz reakcji RT. Ścieżki 2-5 i 7-10 przedstawiają poszczególne typy transkryptów genu fuzyjnego BCR-ABL. Ścieżka 11 odpowiada kontroli odczynnikowej. An example of electrophoretic separation of the amplification products of the BCR-ABL gene after multiplex RT-PCR reaction. Lane 1, 12 is a molecular weight marker (50-750pz). Lane 6 shows the cdna obtained from a healthy person, which is the purity control of RNA isolation and RT reaction. Lanes 2-5 and 7-10 show the different types of BCR-ABL fusion gene. Path 11 corresponds to reagent control. Rycina 4 Schemat postępowania diagnostycznego i monitorowania MRD u chorych z CML leczonych TKI w przypadku obecności rzadkich fuzji genów BCR i ABL. The scheme for dealing with the diagnosis and monitoring of MRD in CML patients treated with TKI in the presence of a rare BCR ABL gene fusion. otrzymanego po uprzednim powtórzeniu reakcji RT-PCR typu multipleks z użyciem startera dla odpowiedniego rejonu pęknięć [11,28]. W związku z brakiem wytycznych i ujednoliconego protokołu należy podkreślić zasadność stosowania reakcji multipleks na etapie rozpoznania CML. Reakcja RT-PCR typu multipleks stała się złotym standardem w molekularnej diagnostyce CML zważywszy na fakt, iż klasyczna cytogenetyka oraz metoda FISH (fluorescence in situ hybridization) nie dają informacji co do typów translokacji, potwierdzając jedynie obecność chromosomu Philadelphia [29]. Metoda multipleks PCR nie pozwala jednak na monitorowanie MRD z dostateczną czułością wynoszącą 10-2 -10-3 [2,11]. W tym celu wykorzystuje się reakcję RQ-PCR z zastosowaniem zewnętrznych standardów ilościowych w postaci plazmidów lub oligonukleotydów zawierających odpowiedni insert genu fuzyjnego BCR-ABL [25]. Daje to możliwość śledzenia kinetyki odpowiedzi na leczenie z czułością 10-4 -10-6 [15,30], w oparciu o wyliczenie liczby kopii genu BCR- ABL w analizowanym materiale. Dostępność standardów ilościowych ograniczona jest obecnie jedynie do klasycznych odmian genów fuzyjnych. Z uwagi na fakt, iż u 2-3% pacjentów chorych na CML wykrywa się nietypowe warianty BCR-ABL istnieje potrzeba standaryzacji metody umożliwiającej ilościowe monitorowanie poziomu transkryptu w tych przypadkach. Do kontroli obecności nietypowego wariantu genu BCR-ABL może posłużyć metoda jakościowa RT-PCR typu nested osiągająca czułość 10-6. W teście tym można jednak obserwować jedynie obecność produktu reakcji PCR opierając się o rozdział w żelu elektroforetycznym. Badanie cytogenetyczne klasyczną metodą, hybrydyzacja fluorescencyjna in situ (FISH) nie są brane pod uwagę jako metody adekwatne do oceny MRD [31]. Klasyczna cytogenetyka charakteryzuje się niską czułością 10-1 - 5 x 10-2 [15], dodatkowo konieczność obserwacji komórek na etapie metafazy powiązana z trudnością w uzyskaniu właściwych preparatów mikroskopowych (co najmniej 30 płytek metafazowych) może uniemożliwić miarodajną analizę. Interfazową fluorescencyjną hybrydyzację in situ (FISH) charakteryzuje wprawdzie nieco większa czułość niż klasyczną cytogenetykę (5x10-2 - 10-3 ) [32] (analizę przeprowadza się na 200 lub większej liczbie komórek krwi), to jednak metoda ta charakteryzuje się relatywnie wysokim prawdopodobieństwem uzyskania wyników fałszywie pozytywnych na skutek przestrzennego nakładania się identyfikowanych sekwencji a nie faktycznej fuzji genów. W przypadku nietypowych transkryptów genu BCR-ABL alternatywną metodą oceny ilościowej mogłoby być zastosowanie metody D-FISH (dual color dual fusion fluorescence in situ hybridization). Zastosowanie tego wariantu analizy FISH zmniejsza prawdopodobieństwo wystąpienia wyników fałszywie dodatnich oraz pozwala na badanie jąder komórek krwi obwodowej w interfazie. Dodatkowo umożliwia kolokalizację genów BCR i ABL w przypadku CML Ph(-), powstałą w wyniku pęknięcia poza miejscem, bez równoczesnego Przegląd Lekarski 2014 / 71 / 5 261
sygnału charakterystycznego dla t(9;22) [5,15], jednak czułość tej metody wydaje się być nadal niewystarczająca. Dopiero przy analizie 6000 jąder możliwe jest osiągnięcie czułości około 8x10-4 [33,34]. U większości pacjentów z nowo rozpoznaną przewlekłą białaczką szpikową, całkowita odpowiedź cytogenetyczna (CCR, complete cytogenetic response) może być osiągnięta w trakcie terapii z zastosowaniem inhibitorów kinaz tyrozynowych, jednak lepsze rokowania charakteryzują pacjentów, którzy osiągnęli głębszą remisję choroby: MMR (MR 3 ), MR 4, MR 4,5. Ze względu na przetrwałą populację komórek nowotworowych, poniżej granicy wykrywalności techniki FISH, w ocenie przebiegu leczenia należy zastosować test molekularny cechujący się większą czułością [30]. Dlatego uznano, że zastosowanie FISH nie pozwala na wiarygodne rozróżnienie pacjentów w CCR, którzy osiągnęli lub nie przynajmniej MR 3 oraz pacjentów, u których remisja molekularna osiąga jeszcze głębszy poziom. FISH nie pozwala ponadto zidentyfikować pacjentów z niskim lecz rosnącym poziomem transkryptu, dlatego też nie wydaje się być właściwą metodą do monitorowania pacjentów z osiągniętą CCR [35]. Na podstawie wieloletnich doświadczeń Pracowni Diagnostyki Molekularnej Kliniki Hematologii SU w Krakowie, opracowano schemat postępowania diagnostycznego i służącego monitorowaniu MRD u chorych na przewlekłą białaczkę szpikową leczonych TKI w przypadku obecności rzadkich fuzji genów BCR i ABL. Schemat ten przedstawiono na rycinie 4. Podsumowując, techniki wykorzystywane do wykrywania MRD powinny charakteryzować się poziomem czułości w zakresie od 10-5 do 10-6 i być dostępne dla wszystkich chorych na CML z możliwością ilościowej oceny badanego genu zgodnie z ogólno przyjętymi wytycznymi zapewniającymi możliwość otrzymania powtarzalnych wyników z zastosowaniem wystandaryzowanej metody diagnostycznej [36]. W ramach programu EUTOS for CML (European Outcome and Treatment Study) prowadzonego pod kierunkiem panelu ekspertów ELN (European LeukemiaNet) realizowany jest projekt badawczy, którego celem jest opracowanie skutecznej metody RQ-PCR dla siedmiu rzadkich typów fuzji BCR-ABL: e1a2, e1a3, b2a3, b3a3, e6a2, e8a2, e19a2 (www.eutos. org). Metoda ilościowa RQ-PCR uważana jest obecnie za najbardziej użyteczny test do oceny MRD w CML, tym niemniej analizy FISH czy RT-PCR mogą być z powodzeniem stosowane jako elementy uzupełniające proces diagnostyczny [24,26]. Należy podkreślić, że prawidłowe rozpoznanie, a następnie ocena poziomu transkryptu w przypadku nietypowych odmian genu BCR-ABL pozwala nie tylko na monitorowanie MRD, śledzenie postępów w leczeniu choroby oraz podejmowanie trafnych decyzji klinicznych, ale również umożliwi poznanie specyfiki danej translokacji i określenie charakteru korelacji pomiędzy genotypem BCR-ABL a fenotypem CML, co może przyczynić się do dalszej optymalizacji leczenia tej choroby. Piśmiennictwo 1. Byrne JL, Carter GI, Davies JM, Haynes AP, Russell NH, Cross NC: A novel BCR-ABL fusion gene (e2/1a) in a patient with Philadelphia-positive chronic myelogenous leukaemia and an aggressive clinical course. Br J Haematol. 1998; 103: 791-794. 2. Sastre DA, Argaraña CE, Heller VB, Gallo M, Fernández EN, Rodríguez CM: An analysis of multiplex-pcr in the detection of BCR-ABL transcripts in hematological disorders. Genet Mol Biol. 2007; 30: 520-523. 3. Daley GQ, Van Etten RA, Baltimore D: Induction of chronic myelogenous leukemia in mice by the P210 bcr/abl gene of the Philadelphia chromosome. Science 1990; 247: 824-830. 4. Grzybowska-Izydorczyk O, Góra-Tybor J, Robak T: Inhibitory kinazy tyrozynowej w terapi przewlekłej białaczki szpikowej. Postępy Hig Med Dosw. 2006; 60: 494-497. 5. Hochhaus A, Reiter A, Skladny H, Melo JV, Sick C. et al: A novel BCR-ABL fusion gene (e6a2) in a patient with Philadelphia chromosome-negative chronic myelogenous leukemia. Blood. 1996; 88: 2236-2240. 6. Davis RL, Konopka JB, Witte ON: Activation of the c-abl oncogene by viral transduction or chromosomal translocation generates altered c-abl proteins with similar in vitro kinase properties. Mol Cell Biol. 1985; 5: 204-213. 7. Clarkson BD, Strife A, Wisniewski D, Lambek C, Carpino N: New understanding of the pathogenesis of CML: a prototype of early neoplasia. Leukemia. 1997; 11: 1404-1428. 8. Hasserjian RP: Chronic Myelogenous Leukaemia- Neoplastic Hematopathology Experimental and Clinical Approaches. Humana Press, Houston, 2010, 193-211. 9. Melo JV: BCR-ABL gene variants. Baillieres Clin Haematol. 1997; 10: 203-222. 10. Pane F, Intrieri M, Quintarelli C, Izzo B, Muccioli GC, Salvatore F: BCR/ABL genes and leukemic phenotype: from molecular mechanisms to clinical correlations. Oncogene. 2002; 21: 8652-8667. 11. Burmeister T, Reinhardt R: A multiplex PCR for improved detection of typical and atypical BCR-ABL fusion transcripts. Leuk Res. 2008; 32: 579-585. 12. Pane F, Frigeri F, Sindona M, Luciano L, Ferrara F. et al: Neutrophilic-chronic myeloid leukemia: a distinct disease with a specific molecular marker (BCR/ABL with C3/A2 junction). Blood 1996; 88: 2410-2414. 13. Polák J, Zemanová Z, Michalová K, Klamová H, Cermák J, Haskovec C: A new case of chronic myeloid leukemia (CML) in myeloid blast crisis with an atypical (b3/a3) junction of the BCR/ABL gene. Leukemia. 1998; 12: 250. 14. Roman J, Jimenez A, Barrios M, Castillejo JA, Maldonado J, Torres A: E1A3 as a unique, naturally occurring BCR-ABL transcript in an indolent case of chronic myeloid leukaemia. Br J Haematol. 2001; 114: 635-637. 15. Kantarjian H, Schiffer C, Jones D, Cortes J: Monitoring the response and course of chronic myeloid leukemia in the modern era of BCR-ABL tyrosine kinase inhibitors: practical advice on the use and interpretation of monitoring methods. Blood. 2008; 111: 1774-1780. 16. Snyder DS, McMahon R, Cohen SR, Slovak ML: Chronic myeloid leukemia with an e13a3 BCR-ABL fusion: benign course responsive to imatinib with an RT-PCR advisory. Am J Hematol. 2004; 75: 92-95. 17. Branford S, Rudzki Z, Hughes TP: A novel BCR-ABL transcript (e8a2) with the insertion of an inverted sequence of ABL intron 1b in a patient with Philadelphia-positive chronic myeloid leukaemia. Br J Haematol. 2000; 109: 635-637. 18. Okamoto K, Karasawa M, Sakai H, Ogura H, Morita K, Naruse T: A novel acute lymphoid leukaemia type BCR-ABL transcript in chronic myelogenous leukaemia. Br J Haematol. 1997; 96: 611-613. 19. Sugimoto T, Ijima K, Hisatomi H, Murayama T, Mizuno I. et al: Second case of CML with aberrant BCR-ABL fusion transcript (e8/a2) with insertion of an inverted ABL intron 1b sequence. Am J Hematol. 2004; 77: 164-166. 20. Schultheis B, Wang L, Clark RE, Melo JV: BCR-ABL with an e6a2 fusion in a CML patient diagnosed in blast crisis. Leukemia. 2003; 17: 2054-2055. 21. Sadia H, Siddiqui RT, Nasim A: A unique BCR-ABL1 transcript with the insertion of intronic sequence from BCR and ABL1 genes in a patient with Philadelphiapositive chronic myeloid leukemia: a case study. Cancer Genet Cytogenet. 2010; 201: 57-61. 22. Cross NC: Detection of BCR-ABL in Hematological Malignancies by RT-PCR. Methods Mol Med. 1996; 6: 25-36. 23. Branford S, Hughes TP, Rudzki Z: Monitoring chronic myeloid leukaemia therapy by real-time quantitative PCR in blood is a reliable alternative to bone marrow cytogenetics. Br J Haematol. 1999; 107: 587-599. 24. Kim YJ, Kim DW, Lee S, Kim HJ, Kim YL. et al: Comprehensive comparison of FISH, RT-PCR, and RQ-PCR for monitoring the BCR-ABL gene after hematopoietic stem cell transplantation in CML. Eur J Haematol. 2002; 68: 272-280. 25. van der Velden VH, Hochhaus A, Cazzaniga G, Szczepanski T, Gabert J, van Dongen JJ: Detection of minimal residual disease in hematologic malignancies by real-time quantitative PCR: principles, approaches, and laboratory aspects. Leukemia. 2003; 17: 1013-1034. 26. Chomczynski P, Sacchi N: Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanatephenol-chloroform extraction. Anal Biochem. 1987; 162: 156-159. 27. Czekalska S, Zawada M, Florek I: Oznaczanie obecności i poziomu ekspresji genu fuzyjnego BCR-ABL oraz mutacji w genie ABL związanych z opornością na leczenie. Hematologia molekularna. Patogeneza, patomechanizmy i metody badawcze. Ośrodek Wydawnictw Naukowych, Poznań 2009; 275-295. 28. Cross NC, Melo JV, Feng L, Goldman JM: An optimized multiplex polymerase chain reaction (PCR) for detection of BCR-ABL fusion mrnas in haematological disorders. Leukemia. 1994; 8: 186-189. 29. Dessars B, El Housni H, Lambert F, Kentos A, Heimann P. et al: Rational use of the EAC real-time quantitative PCR protocol in chronic myelogenous leukemia: report of three false-negative cases at diagnosis. Leukemia. 2006; 20: 886-888. 30. Vrsalović MM, Kušec R, Pejša V, Romić Ž: Comparison of sensitivity of nested PCR and quantitative PCR in Bcr-Abl p210 transcript detection in chronic myelogenous leukemia. Biochemia Medica. 2007; 17: 109-114. 31. Guo JQ, Lin H, Kantarjian H, Talpaz M, Champlin R. et al: Comparison of competitive-nested PCR and real-time PCR in detecting BCR-ABL fusion transcripts in chronic myeloid leukemia patients. Leukaemia. 2002, 16: 2447-2453. 32. Radich JP: How I monitor residual disease in chronic myeloid leukemia. Blood 2009; 114: 3376-3381. 33. Dewald GW, Juneau AL, Schad CR, Tefferi A: Cytogenetic and molecular genetic methods for diagnosis and treatment response in chronic granulocytic leukemia. Cancer Genet Cytogenet. 1997; 94: 59-66. 34. Dewald GW, Wyatt WA, Silver RT: Atypical BCR and ABL D-FISH patterns in Chronic Myeloid Leukemia and their possible role in therapy. Leuk Lymphoma. 1999; 34: 481-491. 35. Hughes T, Deininger M, Hochhaus A, Branford S, Radich J. et al: Monitoring CML patients responding to treatment with tyrosine kinase inhibitors: review and recommendations for harmonizing current methodology for detecting BCR-ABL transcripts and kinase domain mutations and for expressing results. Blood. 2006; 108: 28-37. 36. Braziel RM, Shipp MA, Feldman AL, Espina V, Winters M. et al: Molecular diagnostics. Hematology Am Soc Hematol Educ Program. 2003: 279-293. 262 D. Link-Lenczowska i wsp.