Rekomendacje dotyczące stosowania analizy mutacji genu BCR-ABL u chorych na przewlekłą białaczkę szpikową

Transkrypt

1 STANDARDY Standards Acta Haematologica Polonica 2007, 38, Nr 3, str ANDRZEJ HELLMANN 1, MAREK SIEMIĄTKOWSKI 2, JERZY HOŁOWIECKI 3, WIESŁAW W. JĘDRZEJCZAK 4, TADEUSZ ROBAK 5, ALEKSANDER SKOTNICKI 6, KRZYSZTOF WARZOCHA 7, MIROSŁAW MAJEWSKI 7 Rekomendacje dotyczące stosowania analizy mutacji genu BCR-ABL u chorych na przewlekłą białaczkę szpikową Recommendations concerning use of analysis of mutations in the BCR-ABL gene in patients with chronic myeloid leukemia 1 Katedra i Klinika Hematologii i Transplantologii, Akademia Medyczna w Gdańsku 2 Bristol-Myers Squibb 3 Katedra i Klinika Hematologii i Transplantacji Szpiku, Śląska Akademia Medyczna 4 Klinika Hematologii, Onkologii i Chorób Wewnętrznych, Akademia Medyczna w Warszawie 5 Katedra i Klinika Hematologii Uniwersytetu Medycznego w Łodzi 6 Katedra i Klinika Hematologii, Collegium Medicum Uniwersytetu Jagiellońskiego, Kraków 7 Instytut Hematologii i Transfuzjologii, Warszawa STRESZCZENIE Mutacje genu BCR-ABL stanowią jedną z głównych przyczyn rozwoju oporności na imatynib i inne inhibitory kinazy BCR-ABL. Rosnąca ilość danych wskazuje na celowość wykonywania badania mutacji u chorych na przewlekłą białaczkę szpikową. Wynik analizy mutacji genu BCR- ABL naleŝy zawsze interpretować w odniesieniu do sytuacji klinicznej chorego. U chorego leczonego imatynibem zmiana terapii moŝe być rozwaŝona w przypadku wykrycia mutacji genu BCR-ABL, jedynie jeśli jednocześnie obserwuje się niepowodzenie leczenia imatynibem w dawce 400 mg/d lub wyŝszej, lub odpowiedź suboptymalną na imatynib. W takim przypadku, po wykryciu mutacji związanej z całkowitą opornością na imatynib: M244V, G250E, Y253F, Y253H, E255K, E255V, T315I, F359V, H396P, H396R zaleca się przerwanie leczenia imatynibem zamiast zwiększania dawki leku do mg/d. W przypadku wykrycia mutacji T315I nie zaleca się równieŝ zmiany leczenia na dazatynib lub nilotynib. Nie ma obecnie przekonujących danych, które uzasadniałyby zmianę leczenia w przypadku wykrycia mutacji genu BCR- ABL u chorych z dobrą odpowiedzią na imatynib ani rezygnacji z rozpoczęcia leczenia imatynibem jako leczenia I linii w przypadku wykrycia mutacji genu BCR-ABL w momencie rozpoznania przewlekłej białaczki szpikowej. Interpretując wyniki badania mutacji genu BCR-ABL naleŝy pamiętać, Ŝe powyŝsza problematyka stanowi obecnie obszar intensywnych badań i dyskusji klinicznych, a dotychczasowe obserwacje mają najczęściej charakter retrospektywny i dotyczą małych grup chorych, co sugeruje ostroŝność w ocenie wyników. Przedstawione rekomendacje mają zatem wstępny charakter, oparty na obecnym stanie wiedzy i wymagają stałego uaktualniania w miarę uzyskiwania nowych wyników badań. SŁOWA KLUCZOWE: Przewlekła białaczka szpikowa Mutacja BCR-ABL Rekomendacje

2 362 A. HELLMANN i wsp. SUMMARY Mutations in the BCR-ABL gene constitute one of the main causes of development of resistance to imatinib and other BCR-ABL kinase inhibitors. Accumulating data indicate that testing for mutations in this gene in patients with chronic myeloid leukemia is justified. Results of analysis of mutations in the BCR-ABL gene should always be interpreted in relation to the clinical situation of a specific patient. In case of detecting a mutation in the BCR-ABL gene in a patient treated with imatinib, a change of treatment may be considered only if treatment with imatinib at a dose of 400 mg/d or higher has failed or the observed response to imatinib is suboptimal. On detecting a mutation related to complete resistance to imatinib (M244V, G250E, Y253F, Y253H, E255K, E255V, T315I, F359V, H396P, H396R), cessation of treatment with imatinib is recommended rather than a dose increase to mg/d. If the T3151 mutation is detected, a change of treatment to dasatinib or nilotinib is also not advisable. At present no convincing data are available that would justify a change of treatment if a mutation in the BCR-ABL gene is detected in a patient well-responding to imatinib, or a resignation from introduction of imatinib as a firstline treatment if a mutation in the BCR-ABL gene is detected at the diagnosis of chronic myeloid leukemia. When interpreting the results of testing for mutations in the BCR-ABL gene, one should bear in mind that this particular subject is currently being intensively investigated and discussed, and the observations made so far are usually retrospective and based on small groups of patients, which calls for caution in evaluation of the results. The recommendations presented here should therefore be treated as presumptive, based on current knowledge and requiring continuous update with latest findings and developments in this field. KEY WORDS: Chronic myeloid leukemia Mutation BCR-ABL Recommendations WSTĘP W dniu w Warszawie odbyło się spotkanie panelu ekspertów z zakresu hematologii. W czasie spotkania przedyskutowano dostępne dane literaturowe oraz doświadczenia własne uczestników panelu dotyczące zastosowania analizy mutacji genu BCR-ABL u chorych na przewlekłą białaczkę szpikową (CML). Spotkanie zostało zorganizowane na wniosek Bristol-Myers Squibb. PoniŜszy dokument stanowi podsumowanie dyskusji panelu ekspertów oraz zawiera uzgodnienia dotyczące: Znaczenia mutacji genu BCR-ABL (na podstawie badań in vitro i in vivo) Wskazań do wykonania badania mutacji genu BCR-ABL Metodyki przeprowadzania badań mutacji genu BCR-ABL Interpretacji wyników i zaleceń terapeutycznych u chorych z wykrytymi mutacjami genu BCR-ABL. Uczestnicy spotkania W panelu ekspertów udział wzięli: prof. dr med. Andrzej Hellmann prof. dr med. Jerzy Hołowiecki prof. dr med. Wiesław W. Jędrzejczak prof. dr med. Tadeusz Robak prof. dr med. Aleksander Skotnicki prof. dr med. Krzysztof Warzocha

3 Rekomendacje dot. Stosowania analizy mutacji genu BCR-ABL 363 dr Mirosław Majewski oraz pracownicy Działu Medycznego Bristol-Myers Squibb. CZĘSTOŚĆ WYSTĘPOWANIA MUTACJI GENU BCR-ABL Częstość występowania mutacji domeny kinazowej genu BCR-ABL zaleŝy od fazy CML oraz stopnia odpowiedzi na leczenie. U chorych z wczesną fazą przewlekłą mutacje BCR-ABL występują sporadycznie. Branford i wsp. (2003) nie stwierdzili obecności mutacji u 40 chorych z wczesną fazą przewlekłą (<12 mies. od rozpoznania), podczas gdy mutacje zaobserwowano u 22% chorych w późnej fazie przewlekłej (14/64) i 33% chorych w fazie akceleracji (13/40) (analiza mutacji metodą sekwencjonowania, badanie obejmowało chorych zarówno z dobrą odpowiedzią jak i brakiem odpowiedzi na imatynib). W innym badaniu, przed rozpoczęciem leczenia imatynibem stwierdzono obecność mutacji u 37% chorych w fazie akceleracji (10/27), 24% w kryzie mieloidalnej (5/19) oraz u Ŝadnego z 20 chorych w fazie przewlekłej (Willis i wsp., 2005). Z przeglądu piśmiennictwa wynika natomiast, Ŝe w przypadku wtórnej oporności na imatynib mutacje genu BCR-ABL występują u 50-90% chorych (cf. Deininger i wsp., 2005), podczas gdy u chorych z całkowitą odpowiedzią cytogenetyczną na leczenie imatynibem mutacje obserwowano u 15% (32/211) chorych (Branford i wsp., 2004). Ryzyko wystąpienia mutacji zwiększa się w miarę upływu czasu od rozpoznania do rozpoczęcia leczenia imatynibem, w przypadku okresu krótszego niŝ 4 lata mutacje zaobserwowano u 9% chorych, natomiast przy okresie powyŝej 4 lat mutacje wykryto juŝ u 41% chorych (p<0,0001) (Branford i wsp., 2003). Częstość występowania poszczególnych mutacji jest róŝna, najczęściej występuje mutacja T315I (ok. 20% chorych z obecnością mutacji, 37/177), E255K (ok. 20%) i M351T (ok. 15%). Inne stosunkowo często występujące mutacje to Y253H (7%), Q252H (5%), F317L (4%), F359V (4%), Y253F (3%), H396R (3%), E355G (3%) (Deininger i wsp., 2005). U niektórych chorych moŝe występować więcej niŝ jedna mutacja. Do tej pory opisano występowanie mutacji punktowych domeny kinazowej genu BCR-ABL powodujących zamianę ponad 40 aminokwasów (Hughes i wsp., 2006). ZNACZENIE PREDYKCYJNE MUTACJI BCR-ABL. WPŁYW MUTACJI GENU BCR-ABL NA ROZWÓJ OPORNOŚCI NA IMATYNIB I INNE LEKI Z GRUPY INHIBITORÓW KINAZY BCR-ABL Mutacje genu BCR-ABL mogą prowadzić do rozwoju oporności na imatynib przynajmniej w trzech mechanizmach: poprzez wpływ na miejsca kontaktowe uniemoŝliwiając tworzenie mostków wodorowych pomiędzy imatynibem i kinazą (np. mutacja T315I), poprzez uniemoŝliwienie konformacyjnego dopasowania pętli P kinazy do imatynibu (wiąŝącego się z kinazą w oddzielnym miejscu) (mutacje pętli P ) oraz poprzez przesunięcie równowagi pomiędzy obecnością kinazy BCR-ABL w konformacji aktywnej i nieaktywnej w kierunku konformacji aktywnej, w której niemoŝliwe

4 364 A. HELLMANN i wsp. jest stereochemiczne dopasowanie cząsteczki kinazy do imatynibu (mutacje pętli A ) (Cowan-Jacob i wsp., 2004). Nie rozstrzygnięta pozostaje kwestia, w jakim stopniu mutacje są obecne w komórkach nowotworowych przed rozpoczęciem leczenia imatynibem, które mogłoby następnie prowadzić do wyselekcjonowania klonów opornych, a w jakim stopniu sama obecność onkogenu BCR-ABL prowadzi do zwiększenia ryzyka wystąpienia mutacji. Za pierwszym mechanizmem przemawia fakt, Ŝe leczenie imatynibem nie prowadzi do całkowitego usunięcia komórek macierzystych w fazie spoczynkowej zawierających gen BCR-ABL (Copland i wsp., 2006; Jørgensen i wsp., 2007; Roeder i wsp., 2006). PrzeŜycie tych komórek, nawet pomimo całkowitego zahamowania fosforylacji CRKL zaleŝnej od BCR-ABL, moŝe wskazywać na moŝliwość selekcji klonu opornego i wyjaśniać mechanizm wznowy CML w przypadku uzyskania całkowitej odpowiedzi cytogenetycznej w czasie leczenia imatynibem, a tym bardziej w przypadku przerwania terapii tym lekiem. Na znaczenie drugiego mechanizmu wskazują badania dokumentujące wzrost ilości wolnych rodników oraz upośledzenie mechanizmów naprawczych DNA w komórkach zawierających gen BCR-ABL (p. praca przeglądowa Penserga i wsp., 2007). Prawdopodobnie oba powyŝsze mechanizmy mają, choć trudno określić w jakim stopniu, wpływ na rozwój oporności na imatynib. Nie moŝna równieŝ obecnie wykluczyć wpływu imatynibu na powstawanie mutacji genu BCR-ABL. Na podstawie badań in vitro moŝna oszacować, w jakim stopniu zmniejsza się moŝliwość hamowania kinazy BCR-ABL przez imatynib lub inne inhibitory z tej grupy. W przypadku mutacji: M244V, L248V, G250E, Q252H, Y253F, Y253H, E255K, E255V, D276G, T315I, F317L, F359V, V379I, A380T, L387M, H396P, H396R, F486S wartość IC50 podczas oceny hamowania fosforylacji BCR-ABL lub hamowania proliferacji komórkowej przekracza uśrednione minimalne stęŝenie imatynibu w stanie stacjonarnym w surowicy (mean trough plasma level) (1460 nm przy dawkowaniu 400 mg/d) (Baccarani i wsp., 2005; O Hare i wsp., 2005, Martinelli i wsp., 2005), a zatem zastosowanie imatynibu w dawce 400 mg w warunkach klinicznych moŝe, w przypadku obecności tych mutacji, zmniejszać aktywność kinazy BCR-ABL jedynie o mniej niŝ połowę. NaleŜy podkreślić, iŝ spośród wymienionych powyŝej mutacji w przypadku M244V, G250E, Y253F, Y253H, E255K, E255V, T315I, F359V, H396P, H396R wartość IC50 ponad 2-krotnie przekracza uśrednione minimalne stęŝenie imatynibu w stanie stacjonarnym w surowicy uzyskiwane przy dawkowaniu imatynibu 400 mg na dobę (ibidem), naleŝy się zatem spodziewać, Ŝe zwiększenie dawki imatynibu do mg prawdopodobnie nie spowoduje w odpowiednim stopniu zahamowania aktywności kinazy BCR-ABL i przełamania oporności. Wydaje się zatem uzasadnione rozpoznanie całkowitej oporności na imatynib w stosowanym w klinice zakresie dawek ( mg) w przypadku wykrycia obecności mutacji M244V, G250E, Y253F, Y253H, E255K, E255V, T315I, F359V, H396P, H396R. Kryterium tak zdefiniowanej oporności na imatynib (2 x IC50) naleŝy uznać za niezbyt rygorystyczne w świetle ostatnich doniesień odnoszących się do wartości IC90 (O Hare i wsp., 2005). Przyjęcie tego ostatniego kryterium skutkowałoby podwyŝszeniem wymaganego minimalnego stęŝenia leku, powyŝej którego dochodzi do hamowania ak-

5 Rekomendacje dot. Stosowania analizy mutacji genu BCR-ABL 365 tywności kinazy BCR-ABL (o 90%) do stęŝenia przekraczającego tolerowane dawki leku, a tym samym uznania równieŝ innych mutacji BCR-ABL jako tych, które mogą warunkować oporność na imatynib w przedziale dawek mg/d. Przedstawione powyŝej dane muszą być przyjmowane z pewną rezerwą, gdyŝ pochodzą z badań in vitro, jednak zarówno w przypadku imatynibu (p. praca przeglądowa Deiningera i wsp., 2005) jak i ostatnio dazatynibu (Nicolini i wsp., 2007) wykazano ich zgodność z działaniem leków w warunkach klinicznych. Mutacja T315I wiąŝe się z opornością nie tylko na imatynib, ale równieŝ na dazatynib i nilotynib. Wartości IC50 dla kaŝdego z tych leków w przypadku obecności mutacji T315I wielokrotnie przekraczają uzyskiwane u chorych stęŝenia leku w surowicy (O Hare i wsp., 2005). Badanie Soverini i wsp. (2006) sugeruje moŝliwość rozwoju pierwotnej lub wtórnej oporności na dazatynib równieŝ w przypadku obecności mutacji F317L. Dane te naleŝy jednak interpretować z ostroŝnością, z uwagi na fakt, Ŝe raport dotyczy opisu jedynie 5 przypadków, a wartości IC50 dazatynibu w przypadku mutacji F317L (<10nM) (O Hare i wsp., 2005) są zbliŝone do minimalnego stęŝenia dazatynibu w surowicy i znacznie niŝsze od stęŝenia maksymalnego (Cmin=9 nm, Cmax= ok. 60nM dla dawki 2 x 70mg). Nie moŝna zatem wykluczyć, Ŝe oporność u tych chorych rozwinęła się w innym mechanizmie, co podkreślają równieŝ sami autorzy pracy. Podsumowując, w przypadku wykrycia mutacji M244V, G250E, Y253F, Y253H, E255K, E255V, F359V, H396P, H396R zwiększanie dawki imatynibu nie prowadzi do przełamania oporności i uzasadnione jest zastosowanie dazatynibu lub włączenie do badania klinicznego z nowymi inhibitorami kinazy tyrozynowej BCR-ABL, natomiast obecność mutacji T315I wiąŝe się z dodatkowo z opornością na dazatynib i nilotynib i naleŝy szukać alternatywnych rozwiązań (alloprzeszczep komórek krwiotwórczych, badania kliniczne itp). ZNACZENIE PROGNOSTYCZNE MUTACJI. WPŁYW MUTACJI GENU BCR-ABL NA ZMIANĘ POTENCJAŁU TRANSFORMUJĄCEGO KLONU NOWOTWOROWEGO ORAZ NA ROKOWANIE Mutacje punktowe genu BCR-ABL mogą powodować nie tylko rozwój oporności na inhibitory BCR-ABL (wartość predykcyjna), ale równieŝ w sposób niezaleŝny zmieniać rokowanie (wartość prognostyczna) wskutek zwiększenia (gain of function) lub zmniejszenia (loss of function) aktywności róŝnych procesów komórkowych. W pracy Griswolda i wsp. (2006) wykazano, Ŝe mutacje genu BCR-ABL mogą prowadzić zarówno do zwiększenia jak i zmniejszenia proliferacji zmutowanych komórek w porównaniu do komórek zawierających niezmutowany allel BCR-ABL. Do zwiększenia proliferacji w warunkach in vitro dochodzi w przypadku mutacji Y253F i E255K, w przypadku mutacji T315I proliferacja zmutowanego klonu zaleŝy od warunków badania, natomiast wystąpienie mutacji M351T prowadzi do zmniejszenia proliferacji komórek nowotworowych. Podobnie, w przypadku oceny potencjału transformacyjnego progenitorów linii B-limfoidalnej, mutacje Y253F i E255K nasilały transformację komór-

6 366 A. HELLMANN i wsp. kową, mutacje M351T i H396P zmniejszały, a mutacja T315I nie zmieniała transformacji komórkowej w porównaniu do niezmutowanych komórek BCR-ABL+ (ibidem). Interesujące, Ŝe nie zawsze zmiana aktywności kinazy BCR-ABL mierzona fosforylacją białek efektorowych korelowała ze zmianą stopnia proliferacji i potencjałem transformacyjnym. Przykładowo, wystąpienie mutacji E255K prowadziło do zmniejszenia aktywności kinazy, a jednocześnie do wzrostu potencjału transformacyjnego i nasilenia proliferacji, co sugeruje moŝliwość aktywacji innych szlaków sygnałowych w komórce. Wzrost onkogenności mutantów BCR-ABL ze zmianami w miejscach 253 i 255 pętli P moŝe tłumaczyć niekorzystne znaczenie rokownicze tych mutacji, i to w mechanizmie niezaleŝnym od warunkowania oporności na imatynib. Jak wiadomo, na podstawie wielu doniesień klinicznych, mutacje genu BCR-ABL w locus kodującym pętlę P oraz mutacja T315I wiąŝą się z niekorzystnym rokowaniem u chorych na przewlekłą białaczkę szpikową. W przypadku pierwotnej lub wtórnej oporności na imatynib wykrycie mutacji pętli P zwiększało ryzyko zgonu u chorych w fazie przewlekłej CML (HR=1,86; p=0,012), a wykrycie mutacji T315I zwiększało ryzyko progresji u chorych w fazie przewlekłej (HR=2,14; p=0,037) oraz ryzyko zgonu u chorych w zaawansowanej fazie CML (HR=3,37; p=0,013) w porównaniu z obecnością innych mutacji (Nicolini i wsp., 2006). Podobnie w pracy Branford i wsp. (2003), wykrycie mutacji pętli P zwiększało ryzyko zgonu u chorych z późną fazą przewlekłą lub fazą akceleracji w porównaniu do wystąpienia innego typu mutacji (p=0,0024). WyŜsze ryzyko progresji (p=0,032) oraz zgonu (p=0,045) u chorych z późną fazą przewlekłą i pierwotną opornością na imatynib w przypadku wykrycia mutacji pętli P w porównaniu do innych mutacji zaobserwowała równieŝ Soverini i wsp. (2005). METODY ANALIZY MUTACJI GENU BCR-ABL Do analizy mutacji genu BCR-ABL moŝe być wykorzystywanych wiele metod, w tym m.in. sekwencjonowanie, denaturujące HPLC (D-HPLC), PCR z wykorzystaniem allelospecyficznych oligonukleotydów (ASO-PCR). Metody analizy mutacji róŝnią się między sobą czułością i swoistością (Hughes i wsp., 2006). Wykrycie mutacji za pomocą sekwencjonowania jest moŝliwe dopiero w przypadku, gdy liczba zmutowanych komórek w klonie nowotworowym przekracza 15 25%. W przypadku D-HPLC górna granica czułości badania wynosi 10%, a czułość ASO-PCR jest na poziomie 0,01% (Hughes i wsp., 2006). NaleŜy pamiętać, Ŝe komórki ze zmutowanym genem BCR-ABL nie muszą wcale zdominować klonu białaczkowego, co moŝe wynikać np. ze zmniejszenia aktywności kinazy BCR-ABL i potencjału proliferacyjnego komórek (Griswold i wsp., 2006). Z danych klinicznych wynika równieŝ, Ŝe wykrycie mutacji metodą ASO-PCR u chorych przed rozpoczęciem terapii imatynibem nie koreluje z późniejszą odpowiedzią na leczenie w przewlekłej białaczce szpikowej (Willis i wsp., 2005). Dlatego teŝ metody analizy mutacji charakteryzujące się wysoką czułością mogą prowadzić do uzyskania wyników dodatnich, ale nieistotnych z klinicznego punktu widzenia. Przyjmuje się, Ŝe czułość w metodzie sekwencjonowania oraz w D-HPLC jest odpowiednia do wykrycia tych zmutowanych klonów komórek

7 Rekomendacje dot. Stosowania analizy mutacji genu BCR-ABL 367 BCR-ABL+, które mogą mieć znaczenie kliniczne (Hughes i wsp., 2006). Badanie D-HPLC pozwala na stwierdzenie obecności mutacji bez identyfikacji jej rodzaju, a zatem wymaga następowego sekwencjonowania w przypadku wykrycia obecności mutacji w chromatogramie. Do celów naukowych natomiast moŝna wykorzystywać inne metody (np. ASO-PCR) charakteryzujące się znacznie większą czułością. Obecnie prowadzone są badania nad moŝliwością oceny liczby komórek ze zmutowanym genem BCR-ABL w stosunku do liczby komórek z genem BCR-ABL nie zawierającym tych mutacji metodą real-time PCR. W przypadku sekwencjonowania zaleca się wykorzystanie RNA, do oznaczeń naleŝy pobrać 20 ml krwi obwodowej (antykoagulant EDTA lub cytrynian) lub, jeŝeli istnieje taka moŝliwość, 2-3 ml szpiku (większa czułość badania) pobranego na EDTA lub cytrynian. Materiał powinien być transportowany w pojemniku z wkładem chłodzącym i dostarczony do laboratorium w ciągu 24 godzin od pobrania od chorego. Skierowanie na badanie mutacji powinno zawierać dane kliniczne i laboratoryjne chorego, co pozwoli pracowni wydać wynik z jego wstępną interpretacją. Z uwagi na stosunkowo krótki fragment kodujący domenę kinazową genu BCR-ABL zazwyczaj jest moŝliwe sekwencjonowanie całego odcinka w jednej reakcji. Wynik analizy mutacji wydany przez pracownię powinien zawierać informacje o typie mutacji oraz informację czy mutacja jest związana z całkowitą opornością na imatynib (M244V, G250E, Y253F, Y253H, E255K, E255V, T315I, F359V, H396P, H396R), częściową opornością na imatynib (L248V, Q252H, D276G, F317L, V379I, A380T, L387M, F486S), opornością na dazatynib (T315I), opornością na nilotynib (T315I) lub teŝ, Ŝe w danym przypadku nie ma obecnie stosownych danych literaturowych. Przy opisie mutacji naleŝy równieŝ zaznaczyć, czy jest to mutacja w obszarze kodującym pętlę P (aminokwasy ). Sekwencjonowanie nie jest ukierunkowane na wykrycie jednej (lub kilku) określonej mutacji np. T315I, powyŝsza metoda pozwala na jednoczasowe wykrycie wszystkich mutacji obecnych w badanym fragmencie DNA. KLINICZNE WSKAZANIA DO ANALIZY MUTACJI Z klinicznego punktu widzenia wykonanie analizy mutacji uzasadnione jest u chorych w fazie przewlekłej CML z brakiem odpowiedzi lub odpowiedzią suboptymalną na leczenie imatynibem w dawce 400 mg/d lub wyŝszej, a takŝe w przypadku utraty uzyskanej uprzednio odpowiedzi na imatynib. Analiza mutacji jest takŝe wskazana u wszystkich chorych z noworozpoznanym CML w fazie akceleracji lub kryzy blastycznej. PowyŜsze zalecenia są zbieŝne z zaleceniami European LeukemiaNet (Baccarani i wsp., 2006), opublikowanymi w USA przez NCCN (NCCN, 2007) oraz innymi uzgodnieniami (Hughes i wsp., 2006; Hellmann i wsp., 2007). NaleŜy pokreślić zasadność wykonania badania mutacji juŝ w przypadku spełnienia pierwszego z moŝliwych kryteriów.

8 368 A. HELLMANN i wsp. Na podstawie badania IRIS moŝna próbować wstępnie szacować populację chorych, u których naleŝałoby rozwaŝyć wykonanie analizy mutacji. W powyŝszym badaniu, w ciągu 5 lat 31% chorych przerwało leczeniem imatynibem w dawce 400 mg/d, w tym u 7% chorych stwierdzono utratę odpowiedzi hematologicznej lub większej odpowiedzi cytogenetycznej, a u 7% chorych progresję choroby do fazy akceleracji lub kryzy blastycznej (ze szczytem występowania w 2. roku terapii). Ponadto, w okresie 5 lat leczenia imatynibem nie uzyskano całkowitej odpowiedzi cytogenetycznej u 13% chorych (Druker i wsp., 2006). Nie ma przekonujących danych, które uzasadniałyby wykonanie analizy mutacji genu BCR-ABL u chorych z dobrą odpowiedzią na leczenie imatynibem. Takie wskazanie byłoby uzasadnione dopiero w przypadku udowodnienia związku pomiędzy wykryciem mutacji u chorego z dobrą odpowiedzią na imatynib a rozwojem oporności. Tymczasem dostępne w tym zakresie dane są niejednoznaczne (Branford i wsp., 2003; Chu i wsp., 2005) lub wskazują na brak korelacji pomiędzy obecnością mutacji u chorego z całkowitą odpowiedzią cytogenetyczną a wznową choroby (Sherbenou i wsp., 2007). Z podobnych względów nie ma obecnie wskazań do przeprowadzania badania mutacji u chorych z fazą przewlekłą CML przed rozpoczęciem leczenia imatynibem. Nie udowodniono dotychczas związku pomiędzy wykryciem mutacji u tych chorych a uzyskaniem odpowiedzi na leczenie imatynibem. Willis i wsp. (2007) wykazali nawet, Ŝe ryzyko niepowodzenia leczenia lub zgonu w przebiegu terapii imatynibem nie róŝni się u chorych z wykluczoną lub wykrytą mutacją przed rozpoczęciem leczenia imatynibem. WPŁYW BADANIA MUTACJI NA DALSZE LECZENIE CHORYCH NA PRZEWLEKŁĄ BIAŁACZKĘ SZPIKOWĄ Wynik analizy mutacji genu BCR-ABL naleŝy zawsze interpretować w odniesieniu do sytuacji klinicznej chorego. U chorych leczonych imatynibem zmiana terapii moŝe być rozwaŝona w przypadku wykrycia mutacji genu BCR-ABL jedynie, jeśli jednocześnie obserwuje się niepowodzenie leczenia imatynibem w dawce 400 mg/d lub większej, lub odpowiedź suboptymalną na imatynib. W takich przypadkach, po wykryciu mutacji warunkujących całkowitą oporność na imatynib: M244V, G250E, Y253F, Y253H, E255K, E255V, F359V, H396P, H396R zaleca się przerwanie leczenia imatynibem zamiast zwiększania dawki leku do mg/d i zastosowanie dazatynibu lub włączenie do badania klinicznego z nowymi inhibitorami kinazy tyrozynowej BCR- ABL. W przypadku wykrycia mutacji T315I nie zaleca się równieŝ zwiększania dawki imatynibu ani zmiany leczenia na dazatynib lub nilotynib, naleŝy natomiast rozwaŝyć moŝliwość alloprzeszczepu komórek krwiotwórczych lub kwalifikacji do badania klinicznego. Nie ma obecnie przekonujących danych, które uzasadniałyby zmianę leczenia w przypadku wykrycia mutacji BCR-ABL u chorych z dobrą odpowiedzią na imatynib ani rezygnacji z rozpoczęcia leczenia imatynibem jako leczenia I linii w przy-

9 Rekomendacje dot. Stosowania analizy mutacji genu BCR-ABL 369 padku wykrycia mutacji BCR-ABL w momencie rozpoznania przewlekłej białaczki szpikowej. NaleŜy podkreślić, Ŝe analizę mutacji oraz moŝliwość zmiany aktualnego leczenia w zaleŝności od uzyskanego wyniku badania naleŝy rozwaŝyć juŝ w przypadku wystąpienia pierwszej moŝliwej sytuacji klinicznej wskazującej na brak odpowiedzi, utratę odpowiedzi lub odpowiedź suboptymalną na leczenie imatynibem. Oprócz danych z badań in vitro publikowanych jest coraz więcej danych wskazujących, Ŝe u chorych po niepowodzeniu leczenia imatynibem i z wykrytą mutacją genu BCR-ABL moŝna uzyskać dobrą odpowiedź na leczenie po zmianie terapii na inny inhibitor kinazy BCR-ABL (Cortes i wsp., 2007; Guilhot i wsp., 2007; Hochhaus i wsp., 2007; Kantarjian i wsp., 2006; 2007). Najwięcej danych klinicznych dotyczy dazatynibu. W badaniu START-R oceniano skuteczność i tolerancję leczenia dazatynibem w porównaniu do imatynibu w dawce 800 mg u chorych z fazą przewlekłą CML po niepowodzeniu leczenia imatynibem w dawce dobowej mg (Kantarjian i wsp., 2007). Mutacje warunkujące wzrost oporności na imatynib (5x wzrost IC50) wykryto przed rozpoczęciem leczenia w badaniu u 25 chorych (27%) w grupie z dazatynibem i 7 chorych (15%) w grupie z imatynibem 800 mg/d. W okresie obserwacji 15 miesięcy (mediana) większą odpowiedź cytogenetyczną (MCyR) uzyskano u 48% chorych leczonych dazatynibem i 14% otrzymujących imatynib w duŝych dawkach. Całkowitą odpowiedź hematologiczną (CHR) zaobserwowano u 84% chorych w grupie z dazatynibem i 29% chorych w grupie z imatynibem (ibidem). W innym badaniu wykazano obecność mutacji warunkujących głęboką oporność na imatynib (5x wzrost IC50) u 26% (46/180) chorych w fazie przewlekłej po niepowodzeniu leczenia imatynibem w dawce mg. Zastosowanie dazatynibu pozwoliło na uzyskanie CHR u 87% chorych, a MCyR u 46% chorych (Hochhaus i wsp., 2007). U chorych rozpoczynających leczenie dazatynibem w fazie akceleracji po niepowodzeniu terapii imatynibem w dawce mg/d mutacje genu BCR-ABL rozpoznano u 60% chorych (60/100), w tym mutacje pętli P u 30 chorych. Większą odpowiedź hematologiczną odnotowano u 73% chorych z obecnością mutacji i u 73% chorych z mutacją pętli P, natomiast większą odpowiedź cytogenetyczną uzyskało odpowiednio 30% i 23% chorych (Guilhot i wsp., 2007). Dostępne są juŝ równieŝ dane dotyczące leczenia dazatynibem u chorych z kryzą mielo- lub limfoidalną, która wystąpiła w trakcie terapii imatynibem. U takich chorych przed rozpoczęciem leczenia dazatynibem wykryto mutacje w 49% (54/110) przypadków, w tym mutacje pętli P u 28 chorych (25%). Większą odpowiedź hematologiczną uzyskano u 30% i 32% chorych, odpowiednio z obecnością dowolnej mutacji i u chorych z mutacją pętli P, natomiast większą odpowiedź cytogenetyczną na leczenie dazatynibem opisano odpowiednio u 33% i 32% chorych (Cortes i wsp., 2007). W przypadku nilotynibu wyniki badań in vitro wskazują głównie na mutację T315I jako mogącą warunkować oporność na lek (O Hare i wsp., 2005; Weisberg i wsp., 2006). Natomiast dostępne obecnie wyniki badań klinicznych ograniczają się do badania I fazy (z zakresem dawek mg/d), w którym nie wykazano korelacji pomiędzy obecnością mutacji pętli P lub mutacji poza pętlą P a uzyskaniem odpo-

10 370 A. HELLMANN i wsp. wiedzi hematologicznej lub cytogenetycznej u chorych z wcześniejszą opornością na imatynib (brak osobnej analizy wyników dla mutacji T315I, którą wykryto jedynie u 2% chorych) (Kantarjian i wsp., 2006). REKOMENDACJE Z klinicznego punktu widzenia wykonanie analizy mutacji uzasadnione jest w następujących przypadkach (słownik skrótów na końcu opracowania): Faza przewlekła CML u chorych leczonych imatynibem w dawce 400 mg/d lub wyŝszej 1. Brak odpowiedzi na leczenie 3. miesiąc brak odpowiedzi hematologicznej lub progresja 6. miesiąc brak CHR lub brak odpowiedzi cytogenetycznej (CyR) (> 95% Ph+) 12. miesiąc brak MCyR (> 35% Ph+) 18. miesiąc brak CCyR (> 0% Ph+) 2. Odpowiedź suboptymalna 3. miesiąc brak CHR 6. miesiąc brak MCyR (> 35% kom Ph+) 12. miesiąc brak CCyR (> 0% kom Ph+) 18. miesiąc brak MMolR (mniejsza niŝ o 3 log redukcja transkryptu BCR- ABL, lub jego ilość większa niŝ 0,1%) 3. Progresja choroby w trakcie leczenia imatynibem (do fazy akceleracji bądź kryzy blastycznej) 4. Utrata uzyskanej uprzednio odpowiedzi utrata odpowiedzi hematologicznej (utrata CHR) utrata odpowiedzi cytogenetycznej (utrata MCyR bądź CCyR) utrata odpowiedzi molekularnej (utrata MMolR) (10-krotny wzrost ilości transkryptu BCR-ABL, potwierdzony w kolejnym badaniu PCR w okresie 1 miesiąca; np. z 0,1% do 1%) Faza akceleracji lub kryzy blastycznej w momencie rozpoznania CML u wszystkich chorych z noworozpoznanym CML w fazie akceleracji lub kryzy blastycznej Nie ma klinicznych wskazań do wykonywania analizy mutacji u chorych z dobrą odpowiedzią na leczenie imatynibem. Nie ma klinicznych wskazań do badania mutacji u chorych z fazą przewlekłą CML przed rozpoczęciem leczenia imatynibem. Wynik analizy mutacji genu BCR-ABL naleŝy zawsze interpretować w odniesieniu do sytuacji klinicznej chorego. U chorego leczonego imatynibem zmiana terapii mo- Ŝe być rozwaŝona w przypadku wykrycia mutacji genu BCR-ABL jedynie jeśli jednocześnie obserwuje się niepowodzenie leczenia imatynibem lub odpowiedź suboptymalną na imatynib.

11 Rekomendacje dot. Stosowania analizy mutacji genu BCR-ABL 371 W przypadku wykrycia mutacji warunkujących całkowitą oporność na imatynib tj. M244V, G250E, Y253F, Y253H, E255K, E255V, F359V, H396P, H396R oraz jednoczesnego wykluczenia mutacji T315I zaleca się, u chorego z brakiem odpowiedzi lub odpowiedzią suboptymalną na imatynib, przerwanie leczenia tym lekiem zamiast zwiększania jego dawki do mg/d oraz zastosowanie dazatynibu lub włączenie do badania klinicznego z nowymi inhibitorami kinazy tyrozynowej BCR- ABL. Znaczące osłabienie działania imatynibu obserwuje się równieŝ w przypadku mutacji: L248V, Q252H, D276G, F317L, V379I, A380T, L387M, F486S. W przypadku wykrycia mutacji T315I u chorego z niepowodzeniem leczenia imatynibem zaleca się odstawienie leku, i nie zaleca się zmiany leczenia na dazatynib lub nilotynib. Taki chory powinien być moŝliwie szybko poddany allotransplatacji komórek krwiotwórczych, a w razie obecności przeciwwskazań do tego leczenia lub braku dawcy próbie leczenia interferonem alfa lub chemioterapii. Wprawdzie nie ma badań bezpośrednio potwierdzających słuszność takiego postępowania, ale w tej sytuacji znajdują zastosowanie standardy leczenia przewlekłej białaczki szpikowej wypracowane przed wprowadzeniem inhibitorów kinaz tyrozynowych. Nie ma obecnie przekonujących danych, które uzasadniałyby zmianę leczenia w przypadku wykrycia mutacji BCR-ABL u chorych z dobrą odpowiedzią na imatynib ani rezygnacji z rozpoczęcia leczenia imatynibem jako leczenia I linii w przypadku wykrycia mutacji BCR-ABL w momencie rozpoznania przewlekłej fazy, przewlekłej białaczki szpikowej. NaleŜy podkreślić, Ŝe analizę mutacji oraz moŝliwość zmiany aktualnego leczenia w zaleŝności od uzyskanego wyniku badania naleŝy rozwaŝyć juŝ w przypadku wystąpienia pierwszej moŝliwej sytuacji klinicznej wskazującej na brak odpowiedzi, utratę odpowiedzi lub odpowiedź suboptymalną na leczenie imatynibem. Za podstawową metodę w rutynowej diagnostyce klinicznej mutacji punktowych genu BCR-ABL u chorych z CML naleŝy uznać sekwencjonowanie. MoŜliwe jest równieŝ zastosowanie D-HPLC do wstępnego badania w celu wykrycia mutacji. Dzięki ograniczonej czułości powyŝszych badań nie są wykrywane małe liczebnie klony komórek zawierających zmutowany gen BCR-ABL, co ogranicza ryzyko wykrycia mutacji nieistotnych z klinicznego punktu widzenia. Badanie D-HPLC pozwala na stwierdzenie obecności mutacji bez identyfikacji jej rodzaju, a zatem wymaga następowego sekwencjonowania w przypadku wykrycia obecności mutacji w chromatogramie. Do celów naukowych moŝna wykorzystywać inne metody (np. ASO-PCR) charakteryzujące się znacznie większą czułością. W przypadku sekwencjonowania zaleca się wykorzystanie RNA, do oznaczeń nale- Ŝy pobrać 20 ml krwi obwodowej (antykoagulant EDTA, cytrynian) lub, jeŝeli istnieje taka moŝliwość, 2-3 ml szpiku (większa czułość badania) pobranego na EDTA lub cytrynian. Materiał powinien być transportowany w pojemniku z wkładem chłodzącym i dostarczony do laboratorium w ciągu 24 godzin od pobrania od chorego. Skierowanie na badanie mutacji powinno zawierać dane kliniczne i laboratoryjne chorego, co pozwoli pracowni wydać wynik z jego wstępną interpretacją.

12 372 A. HELLMANN i wsp. UWAGI KOŃCOWE Pojawiająca się w ostatnim okresie coraz większa ilość danych przedklinicznych i klinicznych wskazuje na celowość wykonywania badania mutacji genu BCR-ABL oraz wartość kliniczną wyniku takiego badania w modyfikacji leczenia chorych na przewlekłą białaczkę szpikową. W przypadku niektórych mutacji wiadomo, Ŝe ich wystąpienie moŝe warunkować wystąpienie całkowitej oporności na imatynib (M244V, G250E, Y253F, Y253H, E255K, E255V, T315I, F359V, H396P, H396R). Mutacja T315I moŝe równieŝ odpowiadać za rozwój całkowitej oporności na dazatynib i nilotynib. NaleŜy jednocześnie pamiętać, Ŝe wynik analizy mutacji genu BCR-ABL powinien być za kaŝdym razem interpretowany w odniesieniu do sytuacji klinicznej chorego. Niepowodzenie terapii danym lekiem przy obecności jednej z powyŝszych mutacji uzasadnia bowiem wniosek, Ŝe komórki ze zmutowanym allelem zdominowały klon białaczkowy, co stanowi podłoŝe obserwowanego braku skuteczności prowadzonej terapii. Interpretując wyniki badania mutacji genu BCR-ABL naleŝy pamiętać, Ŝe powyŝsza problematyka stanowi obecnie obszar intensywnych badań i dyskusji klinicznych, a dotychczasowe obserwacje mają najczęściej charakter retrospektywny i dotyczą małych grup chorych, co sugeruje ostroŝność w ocenie wyników. W przyszłości dane z kolejnych badań powinny pozwolić na weryfikację przedstawionych rekomendacji oraz na identyfikację nowych oraz poszerzenie wiedzy klinicznej na temat juŝ istniejących mutacji, a tym samym na lepszą ocenę rokowania i bardziej celowane leczenie w wybranych przypadkach klinicznych. Słownik skrótów ASO-PCR PCR z wykorzystaniem allelospecyficznych oligonukleotydów (ASO-PCR) CCyR całkowita odpowiedź cytogenetyczna CHR całkowita odpowiedź hematologiczna CML przewlekła białaczka szpikowa CyR odpowiedź cytogenetyczna D-HPLC denaturujące HPLC (wysokosprawna chromatografia cieczowa) HR odpowiedź hematologiczna HR współczynnik ryzyka (przy wynikach analizy statystycznej) MCyR większa odpowiedź cytogenetyczna MMolR większa odpowiedź molekularna PFS przeŝycie wolne od progresji OS całkowite przeŝycie PIŚMIENNICTWO 1. Baccarani i wsp., Evolving concepts in the management of chronic myeloid leukemia: recommendations from an expert panel on behalf of the European LeukemiaNet. Blood, 2006; 108:

13 Rekomendacje dot. Stosowania analizy mutacji genu BCR-ABL Branford i wsp., Detection of BCR-ABL mutations in patients with CML treated with imatinib is virtually always accompanied by clinical resistance, and mutations in the ATP phosphate-binding loop (Ploop) are associated with a poor prognosis. Blood, 2003; 102: Branford i wsp., The frequency of detection of BCR-ABL mutations in imatinib treated patients with chronic phase CML who attain a complete cytogenetic response (CCR) does not diminish with increasing duration of CCR but the associated loss of response is usually gradual. Blood, 2004; 104: abs Chu i wsp., Detection of BCR-ABL kinase mutations in CD34+ cells from chronic myelogenous leukemia patients in complete cytogenetic remission on imatinib mesylate treatment. Blood, 2005; 105: Copland i wsp., Dasatinib (BMS ) targets an earlier progenitor population than imatinib in primary CML but does not eliminate the quiescent fraction. Blood, 2006; 107: Cortes i wsp., Dasatinib induces complete hematologic and cytogenetic responses in patients with imatinib-resistant or intolerant chronic myeloid leukemia in blast crisis. Blood, 2007 (przed drukiem, dostęp online). 7. Cowan-Jacob i wsp., Imatinib (STI571) resistance in chronic myelogeneous leukemia: molecular basis of the underlying mechanisms and potential strategies for treatment. Mini. Rev. Med. Chem., 2004; 4: Deininger i wsp., The development of imatinib as a therapeutic agent for chronic myeloid leukemia. Blood, 2005; 105: Druker i wsp., Five-year follow-up of patients receiving imatinib for chronic myeloid leukemia. N. Engl. J. Med., 2006; 355: Griswold i wsp., Kinase domain mutants of BCR-ABL exhibit altered transformation potency, kinase activity, and substrate utilization, irrespective of sensitivity to imatinib. Moll. Cell. Biol., 2006; 26: Guilhot i wsp., Dasatinib induces significant hematologic and cytogenetic responses in patients with imatinib-resistant or -intolerant chronic myeloid leukaemia in accelerated phase. Blood, 2007 (przed drukiem, dostęp online). 12. Hellmann i wsp., Aktualne uzgodnienia dotyczące stosowania dazatynibu u chorych na przewlekłą białaczkę szpikową lub ostrą białaczkę limfoblastyczną z obecnością chromosomu Ph. Acta Haematol. Pol., 2007; 38: Hochhaus i wsp., Dasatinib induces notable hematologic and cytogenetic responses in chronicphase chronic myeloid leukemia after failure of imatinib therapy. Blood, 2007; 109: Hughes i wsp., Monitoring CML patients responding to treatment with tyrosine kinase inhibitors: review and recommendations for harmonizing current methodology for detecting BCR-ABL transcripts and kinase domain mutations and for expressing results. Blood, 2006; 108: Jørgensen i wsp., Nilotinib exerts equipotent anti-proliferative effects to imatinib, functions as an ABCG2 inhibitor, but does not induce apoptosis in CD34+ CML cells. Blood, 2007 (przed drukiem, dostęp online). 16. Kantarjian i wsp., Nilotinib in Imatinib-Resistant CML and Philadelphia Chromosome Positive ALL. N. Engl. J. Med., 2006; 354: (suppl.). 17. Kantarjian i wsp., Dasatinib or high-dose imatinib for chronic-phase chronic myeloid leukemia after failure of first-line imatinib: a randomized phase-ii trial. Blood, 2007 (przed drukiem, dostęp online). 18. Martinelli i wsp., New tyrosine kinase inhibitors in chronic myeloid leukemia. Haematologica, 2005; 90: Nicolini i wsp., Mutation status and clinical outcome of 89 imatinib mesylate-resistant chronic myelogenous leukemia patients: a retrospective analysis from the French intergroup of CML (Fi(ϕ)-LMC GROUP). Leukemia, 2006; 20: Nicolini i wsp., BCR-ABL mutant kinetics in CML patients treated with dasatinib. Leuk. Res., 2007 (przed drukiem, dostęp online).

14 374 A. HELLMANN i wsp. 21. NCCN, National Comprehensive Cancer Network, Practice Guidelines in Oncology, Chronic Meylogenous Leukemia, v , (dostęp: ). 22. O Hare i wsp., In vitro activity of BCR-ABL inhibitors AMN107 and BMS against clinically relevant imatinib-resistant Abl kinase domain mutants. Cancer Res., 2005; 65: Penserga i wsp., Fusion tyrosine kinases: a result and cause of genomic instability. Oncogene, 2007; 26: Roeder i wsp., Dynamic modeling of imatinib-treated chronic myeloid leukemia: functional insights and clinical implications. Nature Med., 2006; 12: Sherbenou i wsp., Mutations of the BCR-ABL-kinase domain occur in a minority of patients with stable complete cytogenetic response to imatinib. Leukemia, 2007; 21: Soverini i wsp., ABL mutations in late chronic phase chronic myeloid leukemia patients with upfront cytogenetic resistance to imatinib are associated with a greater likelihood of progression to blast crisis and shorter survival: a study by the GIMEMA Working Party on chronic myeloid leukemia. J. Clin. Oncol., 2005; 23: Weisberg i wsp., AMN107 (nilotinib): a novel and selective inhibitor of BCR-ABL. Brit. J. Cancer, 2006; 94: Willis i wsp., High-sensitivity detection of BCR-ABL kinase domain mutations in imatinib-naive patients: correlation with clonal cytogenetic evolution but not response to therapy. Blood, 2005; 106: Praca wpłynęła do Redakcji r. i została zakwalifikowana do druku r. Adres Autora: Prof. dr med. Andrzej Hellmann Katedra i Klinika Hematologii i Transfuzjologii Akademia Medyczna w Gdańsku ul. Dębinki Gdańsk