Błona komórkowa neuronu w TEM Grubość: 5 nm 1
Błona komórkowa neuronu (x436 tys.) 2
Struktura fosfolipidów fosfatydylocholina 3
Diagram dwuwarstwy lipidowej 4
Cholesterol w błonie komórek zwierzęcych 5
Cholesterol 6
7
Stężenie jonów w mm wewnątrz kom. zewnątrz kom. Na + 5-15 145 K + 140 5 Mg2 + 0,5 1-2 Ca2 + 10-4 1-2 H + 10-7,2 M 10-7,4 M Cl - 5-15 110 8
Obraz błony w metodzie freeze-fracture 9
Metoda freeze-fracture 10
Metoda freeze-fracture zamrożenie tkanki rozłupnie preparatu pokrycie odsłoniętej powierzchni warstwą węgla trawienie tkanki kwasem osadzenie repliki na siatce i pokrycie jej warstwą złota obserwacja w TEM i wykonanie zdjęć 11
Połączenia międzykomórkowe 12
Obraz połączenia szczelinowego w TEM 13
Model połączenia szczelinowego 14
Struktura koneksyn 15
Typy koneksonów 16
Połączenia szczelinowe w mięśniówce macicy świni (Cx-43 z Cy3) circ long 17
18
Połączenia szczelinowe w siatkówce myszy 19
Połączenie zamykające w TEM 20
Model połączenia zamykającego 21
Erytrocyty 22
EDTA (kwas wersenowy) Sól disodowa: wersenian sodu Środek kompleksujący kationy metali np.: Ca 2+, Mg 2+ Fe 3+ Kompleks chelatowy EDTA z jonem metalu Me 23
Rozpuszczanie błony komórkowej erytrocytów myszy 24
Transport przez błonę komórkową 25
26
27
Dyfuzja prosta 28
Ciśnienie osmotyczne P = crt R = 8,314 [J/(K mol)] = 0,0821 [dm3 atm/(k mol)] T = 309 [K], c stężenie molowe Stężenie molowe Wody destylowanej: 55,56 mol/dm3 Wody w roztworze soli fizjologicznej: 55,06 mol/dm3 Więc: P = 12,68 atm 29
30
Micele i liposomy 31
Liposomy PEG-Po 5-(4 -acryloyloxyphenyl)-10,15,20-tri(p-tolyl) porphyrin 32
Struktura kropli lipidowych TEM Fujimoto i wsp. 2011
Skład kropli lipidowych Rdzeń: Tri - trójglicerydy ech - estry cholesterolu Monowarstwa lipidowa: Ph - fosfolipidy fosfatydylocholina Ch - cholesterol
Struktura triglicerydu
Białka kropli lipidowych Strukturalne białka PAT: perylipiny, adipofilina, TIP47 Enzymy syntezy lipidów: syntaza acylo-coa acylotransferaza diacyloglicerolu Lipazy: hormonalnie zależna lipaza adipocytowa lipaza triglicerydów Białka transportu pęcherzyków: Rab, ARF1, SNARE, białka motoryczne
Funkcje kropli lipidowych 1. magazynowanie lipidów 2. magazynowanie białek (np. histonów) 3. wewnątrzkomórkowy transport lipidów i białek 4. kontrola metabolizmu lipidów
Komórka tłuszczowa - adipocyt
LD w komórkach wysp Langerhansa trzustki LD w hepatocytach
Krople tłuszczu w zarodkach świni 40
Oil red O 41
Drożdże Bodipy FL Nicień Czerwień Nilu Goodman i wsp. 2006 Ruwkun 2009
Przygotowanie materiału do mikroskopu świetlnego 1. Uśmiercenie zwierząt i preparacja wycinków (szybko) 2. Utrwalanie tkanek i komórek (zwykle w temp. 4ºC lub pokojowej, od kilkudziesięciu minut do paru dni w zależności od użytego utrwalacza i wielkości wycinka) 3. Odwodnienie utrwalonego materiału (w etanolu lub w acetonie, od kilkunastu minut do kilku godzin) 4. Przepojenie 5. Zatopienie w parafinie (lub w innych mediach) 6. Skrawanie skrawków 8. Odparafinowanie skrawków 9. Uwodnienie skrawków 10. Barwienie 11. Odwodnienie skrawków 12. Zabezpieczenie preparatów 43
Metody barwienia (kontrastowania) 1. Histologiczne 2. Histochemiczne 3. Reakcje enzymatyczne 4. Immunocytochemiczne 44
Trzustka psa, pęcherzyki końcowe części egzokrynowe. Powiększenie: 960. Barwienie: H+E 45
RER komórka pęcherzykowa trzustki nietoperza 46
Komórki nerwowe zwoju rdzenowego kota. Powiększenie: 960. Barwienie: osmowanie wg. Kolatscheva + safranina 47
Komórki nabłonkowe kanalików nerwowych. Powiększenie: 960 Barwienie: met. Fernandez-Galiano 48
Ad. 2. Reakcje histochemiczne Wykrywanie ściśle określonych składników komórkowych 1. kationów (AS, Zn, Al., Mg, Cu, K, Na, Ca, Fe) 2. anionów, węglanów i fosforanów 3. białek i aminokwasów 4. histonów 5. kwasów nukleinowych 6. lipidów 7. wielocukrów 8. hormonów Przykład: reakcja PAS na glikogen 49
Reakcja PAS (Periodic Acid Schiff) Reakcja polega na utlenieniu kwasem nadjodowym sąsiadujących ze sobą grup OH. Powstałe w łańcuchu wielocukrów grupy aldehydowe reagują z odczynnikiem Shiffa dając purpurowy produkt reakcji. WYKONANIE REAKCJI: 1. Odparafinowane skrawki płukać w 70% alkoholu 2. 5 min. w roztworze kw. Nadjodowego 3. Przemyć w 70% alkoholu 4. 1 min. w płynie redukującym 5. Płukanie w 70% alkoholu 6. Barwienie w odczynniku Schiffa 7. Płukanie w bieżącej wodzie 8. Odwodnienie 50
Tkanka łączna prowadząca naczynia krwionośne w śliniance podżuchwowej. Powiększenie: 200. Barwienie: PAS. 51
52
Oil red O 53
Czterotlenek osmu 54
Histochemiczna analiza lipidów w zarodkach świni Czerwień oleista Siarczan błękitu Nilu zygota późna blastocysta rozwój in vivo i in vitro cytoplazma: wolne kwasy tłuszczowe krople tłuszczu: wolne kwasy tłuszczowe lipidy nasycone lipidy nienasycone nienasycone estry Osm - etanol Sudan czarny B Romek M, Gajda B, Krzysztofowicz E, Smorag Z. (2010) Theriogenology 74: 265 276
Reakcje enzymatyczne - kwaśna fosfataza 56
Reakcje immunocytochemiczne 57
Cytokeratin 7, nowotwór embrionalny 58