(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:

RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP 1944 Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: 06.09.0 0778218.7 (97) O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono:.04.11 Europejski Biuletyn Patentowy 11/16 EP 1944 B1 (13) (1) T3 Int.Cl. C12N 1/82 (06.01) C07K 14/41 (06.01) C12N 1/29 (06.01) A01H /00 (06.01) A01H / (06.01) (4) Tytuł wynalazku: Zastosowanie sekwencji kwasu nukleinowego do wytwarzania transgenicznej rośliny o zwiększonej tolerancji na suszę () Pierwszeństwo: (43) Zgłoszenie ogłoszono: 09.07.08 w Europejskim Biuletynie Patentowym nr 08/28 (4) O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono:.09.11 Wiadomości Urzędu Patentowego 11/09 (73) Uprawniony z patentu: Stichting Dienst Landbouwkundig Onderzoek, Wageningen, NL (72) Twórca(y) wynalazku: PL/EP 1944 T3 ASAPH AHARONI, Rehovot, IL SHITAL DIXIT, Wageningen, NL KURNIAWAN RUDI TRIJATMIKO, Bogor, ID JELLE HIEMSTRA, Wageningen, NL ANDY PEREIRA, Ede, NL (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Urszula Bartnik POLSERVICE KANCELARIA RZECZNIKÓW PATENTOWYCH SP. Z O.O. ul. Bluszczańska 73 00-712 Warszawa Uwaga: W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejskiego Urzędu Patentowego sprzeciw dotyczący udzielonego patentu europejskiego. Sprzeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą wniesienia opłaty za sprzeciw (Art. 99 (1) Konwencji o udzielaniu patentów europejskich).

2 14/P28249PL00 EP 1 941 04 B1 Opis DZIEDZINA WYNALAZKU [0001] Niniejszy wynalazek dotyczy zastosowania sekwencji kwasu nukleinowego do wytwarzania transgenicznych roślin o zwiększonej tolerancji na suszę oraz sposobu wytwarzania transgenicznych roślin o zwiększonej tolerancji na suszę. TŁO WYNALAZKU 1 2 [0002] Rośliny są stale poddawane środowiskowym czynnikom stresowym, które wpływają na ich przeżywalność. Szkodliwe biotyczne i abiotyczne czynniki stresowe mogą zmniejszać wzrost i produktywność roślin uprawnych. Ze względu na to, że tolerancja na stresy biotyczne i abiotyczne ma bezpośredni wpływ na produktywność roślin (wydajność i jakość produktu), prowadzi się szeroko zakrojone badania nad mechanizmami nadawania albo zwiększania tolerancji na stres; w stanie techniki opisano rozmaite metody nadawania tolerancji na stres środowiskowy. Jednakże, podczas gdy najlepiej przebadane mechanizmy dotyczą interakcji stresowych biotycznych lub abiotycznych, w naturze rośliny odpowiadają na wiele czynników stresowych i opierają się im. [0003] Szacuje się, że środowiskowe czynniki stresowe powodują obniżenie wydajności upraw aż do 70% w porównaniu z wydajnością w warunkach korzystnych

3 1 2 (Boyer, Science 218, 443-448, 1982). Stabilność roślin uprawnych wobec zmian czynników środowiskowych jest zatem jedną z najbardziej cenionych właściwości przy prowadzeniu hodowli. W tradycyjnej hodowli na przeszkodzie stoi jednak złożoność cech tolerancji na stres, niskie zróżnicowanie genetyczne składników wydajności i brak wydajnych technik selekcji. Przydatne może zatem być śledzenie w hodowli specyficznych genów kodujących składniki tolerancji na stres, poprzez selekcję z wykorzystaniem markera, jak również poprzez poddanie roślin zabiegom inżynierii genetycznej, żeby nadać im większą tolerancję na stres. [0004] Pośród złożoności reakcji roślinach uprawnych na stres środowiskowy możliwość dokładnej analizy genetycznej szlaków reakcji na stres wspólnych dla większości roślin zapewnia zastosowanie prostego modelu Arabidopsis. O adekwatności modelu Arabidopsis świadczą ostatnie przykłady ulepszania tolerancji na suszę, zasolenie i mróz (Jaglo-Ottosen i wsp., Science 280, 4-6, 1998; Kasuga i wsp., Nat. Biotechnol. 17, 287-291, 1999) z zastosowaniem genów zidentyfikowanych u Arabidopsis. Te geny to czynniki transkrypcyjne z rodziny ERF/AP2, które regulują ekspresję wielu leżących poniżej genów nadających oporność na stres w wielu roślinach heterologicznych. [000] Jednym z poważniejszych stresów abiotycznych, z którymi rośliny na całym świecie muszą sobie radzić, jest stres suszy, czyli odwodnienia. Cztery dziesiąte światowych gruntów rolnych leży w strefie suchej lub półsuchej. Niezależnie od tego, również rośliny rosnące w regionach o stosunkowo dużych opadach mogą być

4 1 2 narażone na krótkie okresy suszy w trakcie sezonu uprawnego. W wielu regionach rolniczych, szczególnie w krajach rozwijających się, opady są stale niewielkie i utrzymanie wydajności wymaga prowadzenia nawadniania. Wody brakuje w wielu regionach, a jej wartość będzie niewątpliwie wzrastać wraz z globalnym ociepleniem, prowadząc do jeszcze większego zapotrzebowania na rośliny uprawne z tolerancją na suszę, które zachowują poziom wydajności (a nawet mają wyższą wydajność) i jakość uzysku przy małej dostępności wody. Szacuje się, że wytwarzanie 1 kg bawełny wymaga około 1 000 litrów wody przy uprawie nawadnianej, natomiast 1 kg ryżu wymaga 4000 litrów. Zwiększenie albo uzyskanie tolerancji w roślinach uprawnych na krótsze albo dłuższe okresy suszy i zmniejszenie wymagań wodnych roślin uprawnych hodowanych w uprawach nawadnianych jest ewidentnie ważnym celem. [0006] Jakkolwiek prowadzenie hodowli (np. z wykorzystaniem markera) pod kątem tolerancji na suszę jest możliwe i czyni się to dla wielu gatunków uprawnych (głównie zbóż, takich jak kukurydza, ryż wyżynny, pszenica, sorgo, proso perłowe, ale również inne gatunki, takie jak fasolnik chiński, groch gołębi i fasola zwyczajna), jest to niezwykle trudne i żmudne, ponieważ tolerancja lub odporność na suszę jest cechą złożoną, determinowaną przez oddziaływanie wielu loci i oddziaływania między genami a środowiskiem. Poszukuje się zatem pojedynczych, dominujących genów, które nadają albo ulepszają tolerancję na suszę i które można łatwo przenosić do wysokowydajnych odmian uprawnych i linii hodowlanych. Większość wody jest tracona przez

1 2 liście, poprzez transpirację; wiele metod z wykorzystaniem roślin transgenicznych polega głównie na modyfikacji utraty wody poprzez dokonanie zmian w liściach. W WO00/7347 opisano na przykład ekspresję enzymu C4 NADP + -kwas jabłkowy z kukurydzy w komórkach naskórkowych i komórkach szparkowych tytoniu, która, zgodnie z ujawnieniem, zwiększa wydajność wykorzystania wody przez roślinę poprzez modulowanie stopnia rozwarcia aparatu szparkowego. Inne metody obejmują na przykład ekspresję ochronnych czynników osmotycznych, takich jak cukry (np. enzymów biosyntezy trehalozy) w roślinach w celu zwiększenia tolerancji na stres wodny; patrz np. WO99/46370. W jeszcze innym podejściu skupiono się na zmianie architektury korzeni roślin. [0007] Jak dotąd, innym obiecującym podejściem zwiększenia tolerancji na suszę jest nadekspresja genów CBF/DREB ( DREB to skrót od wiązania elementu odpowiedzi na odwodnienie, ang. dehydration response element binding; wiązanie DRE), kodujących różne czynniki transkrypcyjne AP2/ERF (ang. ethylene response factor, czynnik odpowiedzi na etylen) (WO98/0921). Nadekspresja białek CBF/DREB1 w Arabidopsis spowodowała zwiększenie tolerancji na mróz (zwanej również tolerancją na odwodnienie indukowane mrozem) (Jaglo- Ottosen i wsp., Science 280, 4-6, 1998; Liu i wsp., Plant Cell, 1391-1406, 1998; Kasuga i wsp., Nat. Biotechnol. 17, 287-291, 1999; Gilmour i wsp. Plant Physiol. 124, 184-186, 00) oraz zwiększenie tolerancji rekombinowanych roślin na odwodnienie powodowane bądź niedoborem wody, bądź ekspozycją na wysokie zasolenie (Liu i wsp., 1998, jak wyżej; Kasuga

6 1 2 i wsp., 1999, jak wyżej). Jako regulator adaptacji do suszy u Arabidopsis opisano inny czynnik transkrypcyjny CBF, CBF4 (Haake i wsp. 02, Plant Physiology 1, 639-648). [0008] W WO 04/031349 opisano czynnik transkrypcyjny nazwany G173, o sekwencji SEK ID NR: 3, jak ujawniono w dalszej części niniejszego opisu. W tym odnośniku opisano również transgeniczne rośliny uprawne, zawierające sekwencję kwasu nukleinowego kodującą białko o sekwencji SEK ID NR: 3. Według tego odnośnika G173 można zastosować do wytworzenia postaci karłowatych roślin ozdobnych i zmiany przekazywania sygnałów przez cukry w roślinach. [0009] Pomimo dostępności pewnych genów, dla których wykazano, że zwiększają tolerancję na suszę u wielu gatunków roślin, takich jak Brassicaceae i Solanaceae, istnieje potrzeba identyfikacji innych genów ze zdolnością do nadawania albo ulepszania tolerancji na suszę, kiedy podlegają ekspresji w roślinach uprawnych. W jednym z wykonań, niniejszy wynalazek zapewnia zastosowanie genu do wytwarzania roślin transgenicznych z kombinacją jednego albo większej liczby następujących fenotypów: zwiększonej tolerancji na suszę, zwiększonej odporności na choroby i zwiększonej struktury korzeniowej. [00] Najpowszechniejszymi są stresami biotyczne, takie jak patogeny (bakterie, grzyby, wirusy) lub szkodniki (owad, nicień) i zwykle wiele mechanizmów chroni rośliny przed większością tych zagrożeń. Jednakże, w niektórych przypadkach rośliny wykazują reakcję wrażliwości na konkretne patogeny albo

7 1 2 szkodniki i uważa się je za gospodarza dla danego patogenu lub szkodnika. Oddziaływanie gospodarz patogen zostało dobrze opisane przez hipotezę gen-za-gen, w której zakłada się oddziaływanie konkretnych genów z gospodarza roślinnego i patogenu/szkodnika z wyzwoleniem (albo nie) reakcji wrażliwości albo odporności. Jakkolwiek genetyka molekularna takich oddziaływań została w ostatnich latach dobrze poznana, zastosowanie takich prostych genów odporności napotkało przeszkodę ze strony powszechnie występującego systemu powstawania mutacji patogenu, który prowadzi do wytworzenia zróżnicowania umożliwiającego przezwyciężenie genów odporności. Generalnie, geny odporności należą do kilku ogólnych klas białek, które zawierają powtórzenia bogate w prolinę i dodatkowe domeny. Jakkolwiek te geny i oddziaływania genetyczne są interesujące do badania oddziaływań roślina-patogen, ich zastosowanie do ochrony upraw przed różnorodnym zakresem patogenów to nadal daleka droga. Innym sposobem, który może dostarczyć odporności, jest zastosowanie genów, które uczestniczą w ochronie roślin przed różnorodnymi patogenami przy wykorzystaniu mechanizmów, które nie opierają się na rozpoznawaniu rośliny i patogenów. To mogłoby nadawać odporność nieswoistą wobec rodzaju, a więc bardziej rozległą, zapewniając odporność na szerszy zakres patogenów. DEFINICJE OGÓLNE [0011] Termin sekwencja kwasu nukleinowego (albo cząsteczka kwasu nukleinowego ) dotyczy cząsteczki DNA lub RNA w postaci jedno- albo dwuniciowej, a konkretnie DNA kodującego białko albo fragment białka według

8 1 2 wynalazku. Termin wyizolowana sekwencja kwasu nukleinowego dotyczy sekwencji kwasu nukleinowego, która nie znajduje się już w środowisku naturalnym, z którego została wyizolowana, np. sekwencji kwasu nukleinowego w komórce gospodarza bakteryjnego albo w roślinnym genomie jądrowym lub plastydowym. [0012] Terminy białko lub polipeptyd są stosowane wymiennie i dotyczą cząsteczek składających się z łańcucha aminokwasów, bez odnoszenia się do konkretnego sposobu działania, wielkości, struktury trójwymiarowej ani pochodzenia. Fragment albo część białka można zatem nadal traktować jako białko. Pojęcie białko wyizolowane stosuje się w odniesieniu do białka, które nie znajduje się już w środowisku naturalnym, na przykład znajduje się in vitro albo w rekombinowanej bakteryjnej albo roślinnej komórce gospodarza. [0013] Termin gen oznacza sekwencję DNA zawierającą region (region podlegający transkrypcji), który jest transkrybowany w komórce do cząsteczki RNA (np. mrna), połączony w sposób umożliwiający działanie z odpowiednimi sekwencjami regulacyjnymi (np. promotorem). Gen może zatem zawierać kilka sekwencji połączonych w sposób umożliwiający działanie, takich jak promotor, sekwencja liderowa ' zawierająca np. sekwencje uczestniczące w inicjacji translacji, region kodujący (białko) (cdna albo DNA genomowy) i niepodlegająca translacji sekwencja 3' zawierająca np. miejsca terminacji translacji. [0014] Termin gen chimerowy (albo gen zrekombinowany) dotyczy dowolnego genu, który nie znajduje się normalnie w naturze w żadnym gatunku, a konkretnie gen,

9 1 2 w którym obecne są jedna albo więcej części sekwencji kwasu nukleinowego, które nie są związane ze sobą w naturze. W naturze promotor nie jest na przykład związany z całym ani z częścią regionu podlegającego transkrypcji, ani z innym regionem regulacyjnym. Termin gen chimerowy rozumie się jako obejmujący konstrukty ekspresyjne, w których promotor lub transkrypcyjna sekwencja regulacyjna jest połączona w sposób umożliwiający działanie z jedną lub większą liczbą sekwencji kodujących albo z sekwencją antysensowną (odwrócona sekwencja komplementarna do nici sensownej) lub z odwróconym powtórzeniem (sensownym i antysensownym, dzięki czemu transkrypt RNA tworzy po transkrypcji dwuniciowy RNA). [001] Ekspresja genu dotyczy procesu, w którym region DNA, który jest połączony w sposób umożliwiający działanie z odpowiednimi regionami regulacyjnymi, a konkretnie z promotorem, podlega transkrypcji do RNA, który jest aktywny biologicznie, tj. który może podlegać translacji do aktywnego biologicznie białka lub peptydu (albo aktywnego fragmentu peptydowego), albo który jest sam aktywny (np. w potranskrypcyjnym wyciszaniu genów albo RNAi). Aktywne białko w niektórych wykonaniach oznacza białko posiadające funkcję dominującą negatywną dzięki obecnej w nim domeny represorowej. Korzystne jest, jeżeli sekwencja kodująca jest w orientacji sensownej i koduje pożądane, aktywne biologicznie białko lub peptyd albo aktywny fragment peptydowy. W metodzie wyciszania genów korzystne jest, jeżeli sekwencja DNA jest obecna w postaci antysensownego DNA lub DNA z odwróconym

1 2 powtórzeniem, zawierającego krótką sekwencję genu docelowego w orientacji antysensownej albo w orientacji sensownej i antysensownej. Ekspresja ektopowa dotyczy ekspresji w tkance, w której gen nie podlega normalnie ekspresji. [0016] Transkrypcyjną sekwencję regulacyjną definiuje się w niniejszym opisie jako sekwencję kwasu nukleinowego, która jest zdolna do regulowania szybkości transkrypcji sekwencji (kodującej) przyłączonej w sposób umożliwiający działanie do transkrypcyjnej sekwencji regulacyjnej. Transkrypcyjna sekwencja regulacyjna, zgodna z definicją w niniejszym opisie, będzie zatem zawierać wszystkie elementy sekwencji niezbędne do inicjacji transkrypcji (elementy promotorowe), do utrzymywania i do regulowania transkrypcji, w tym np. atenuatory lub wzmacniacze. Jakkolwiek dotyczy to przede wszystkim transkrypcyjnych sekwencji regulacyjnych leżących powyżej (w kierunku ) sekwencji kodującej, sekwencje regulacyjne znajdujące się poniżej sekwencji kodującej (w kierunku 3') są również objęte tą definicją. [0017] Stosowany tu termin promotor dotyczy fragmentu kwasu nukleinowego, którego działanie polega na kontrolowaniu transkrypcji jednego albo większej liczby genów, położonych powyżej w odniesieniu do kierunku transkrypcji w miejscu inicjacji transkrypcji genu i który jest strukturalnie identyfikowany poprzez obecność miejsca wiązania dla polimerazy RNA zależnej od DNA, miejsc inicjacji transkrypcji i wszelkich innych sekwencji DNA, w tym między innymi miejsc wiązania czynników transkrypcyjnych, miejsc wiązania

11 1 2 białek represorowych i aktywatorowych i dowolnych innych sekwencji nukleotydów znanych specjaliście, bezpośrednio albo pośrednio regulujących ilościowo transkrypcję z promotora. Promotor konstytutywny to promotor, który jest aktywny w większości tkanek w większości warunków fizjologicznych i rozwojowych. Promotor indukowalny to promotor, który jest regulowany fizjologicznie (np. przez zewnętrzne zastosowanie pewnych związków) albo rozwojowo. Promotor specyficzny tkankowo jest aktywny jedynie w specyficznych typach tkanek lub komórek. [0018] Stosowany tu termin połączony w sposób umożliwiający działanie dotyczy połączenia elementów polinukleotydowych w związek funkcjonalny. Kwas nukleinowy jest połączony w sposób umożliwiający działanie, kiedy jest umieszczony tak, aby utworzyć związek funkcjonalny z inną sekwencją kwasu nukleinowego. Promotor, albo raczej transkrypcyjna sekwencja regulacyjna, jest na przykład połączony w sposób umożliwiający działanie z sekwencją kodującą, jeżeli wpływa na transkrypcję sekwencji kodującej. Połączony w sposób umożliwiający działanie oznacza, że połączone ze sobą sekwencje DNA są zazwyczaj ciągłe i, gdy konieczne jest połączenie dwóch regionów kodujących białko, ciągłe i w ramce odczytu, tak aby wytworzyć białko chimerowe. Białko chimerowe albo białko hybrydowe to białko składające się z różnych domen (albo motywów) białkowych, które nie występują jako takie w naturze, ale są połączone z wytworzeniem funkcjonalnego białka, które wykazuje funkcjonalność połączonych domen (np. wiązania DNA lub represji, co

12 1 2 prowadzi do funkcji dominującej negatywnej). Białko chimerowe może być również fuzją białkową dwóch lub większej liczby białek występujących w naturze. Stosowany tu termin domena oznacza dowolną część (części) lub domenę (domeny) białka o specyficznej strukturze albo funkcji, którą można przenieść do innego białka w celu dostarczenia nowego hybrydowego białka z co najmniej jedną właściwością funkcjonalną domeny. Specyficzne domeny można również zastosować do identyfikowania przedstawicieli białek należących do grupy podobnych czynników transkrypcyjnych, takich jak ortologi z innych gatunków roślin. [0019] Termin peptyd kierujący dotyczy sekwencji aminokwasowych, które kierują białko do organelli wewnątrzkomórkowych, takich jak plastydy, korzystnie chloroplasty, mitochondria, albo do przestrzeni zewnątrzkomórkowej (wydzielniczy peptyd sygnałowy). Sekwencja kwasu nukleinowego kodująca peptyd kierujący może być połączona (w ramce) z sekwencją kwasu nukleinowego kodującą koniec aminowy (koniec N) białka. [00] Konstrukt kwasu nukleinowego lub wektor jest tu rozumiany jako oznaczający cząsteczkę kwasu nukleinowego wytworzoną przez człowieka, będącą skutkiem zastosowania technologii rekombinowania DNA, używaną do dostarczania egzogennego DNA do komórki gospodarza. Szkieletem wektorowym może być na przykład wektor binarny albo superbinarny (patrz np. US91616, US02138879 i WO906722), wektor kointegracyjny albo wektor na bazie T-DNA, co jest znane w stanie techniki i co opisano w innym miejscu niniejszego opisu; do takiego wektora wstawiony jest gen chimerowy, albo,

13 1 2 jeżeli odpowiednia transkrypcyjna sekwencja regulacyjna jest już obecna, wstawiona jest jedynie pożądana sekwencja kwasu nukleinowego (np. sekwencja kodująca, sekwencja antysensowna lub z odwróconym powtórzeniem) poniżej transkrypcyjnej sekwencji regulacyjnej. Wektory zazwyczaj zawierają dalsze elementy genetyczne, służące ułatwieniu ich stosowania w klonowaniu molekularnym, takie jak markery selekcyjne, zgrupowanie miejsc do klonowania i tym podobne (patrz poniżej). [0021] Komórka gospodarza, rekombinowana komórka gospodarza lub komórka transformowana to terminy dotyczące nowej pojedynczej komórki (albo organizmu) powstającej jako wynik wprowadzenia do takiej komórki co najmniej jednej cząsteczki kwasu nukleinowego, szczególnie zawierającej gen chimerowy kodujący pożądane białko albo sekwencję kwasu nukleinowego, która po transkrypcji daje antysensowny RNA albo RNA z odwróconym powtórzeniem (RNA w formie spinki do włosów) celem wyciszania docelowego genu/rodziny genowej. Komórka gospodarza może zawierać konstrukt kwasu nukleinowego jako cząsteczkę replikującą się pozachromosomowo (episomową), a korzystniej, zawiera gen chimerowy włączony do genomu jądrowego albo plastydowego komórki gospodarza. [0022] Termin marker selekcyjny jest terminem znanym specjaliście i jest tu stosowany do opisania dowolnej jednostki genetycznej, którą po ekspresji można zastosować do selekcji komórki albo komórek zawierających marker selekcyjny. Produkty genów markerów selekcyjnych nadają na przykład oporność na antybiotyk, a korzystniej, oporność na herbicyd albo

14 1 2 inną cechę selekcyjną, taką jak cecha fenotypowa (np. zmiana pigmentacji) albo wymagania pokarmowe. Termin reporter jest stosowany głównie w odniesieniu do markerów, które można zobaczyć, takich jak białko o zielonej fluorescencji (GFP), egfp, lucyferaza, GUS i tym podobne. [0023] Termin ortolog genu albo białka dotyczy tu homologicznego genu albo białka obecnego u innych gatunków, które ma taką samą funkcję, jak dany gen lub białko, ale (zazwyczaj) uległo dywergencji sekwencji od punktu czasowego, kiedy gatunki, w których te geny się znajdują, rozpoczęły dywergencję (tj. geny wyewoluowały ze wspólnego przodka poprzez proces specjacji). Ortologi genu Arabidopsis można zatem zidentyfikować w innych gatunkach roślin na podstawie porównania obydwu sekwencji (np. na podstawie procentu identyczności sekwencji na obszarze całej sekwencji albo na obszarze konkretnych domen) i analizy funkcjonalnej. [0024] Terminy homologiczny i heterologiczny dotyczą związku między sekwencją kwasu nukleinowego lub aminokwasową a komórką lub organizmem, który jest jej gospodarzem, szczególnie w kontekście organizmów transgenicznych. Sekwencja homologiczna znajduje się zatem naturalnie w gatunku gospodarza (np. roślina pomidor transformowana genem pomidora), natomiast sekwencja heterologiczna nie znajduje się naturalnie w komórce gospodarza (na przykład roślina-pomidor transformowana genem ziemniaka). W zależności od kontekstu, termin homolog lub homologiczny może alternatywnie odnosić się do sekwencji, które pochodzą

1 1 2 z sekwencji wspólnego przodka (np. mogą być ortologami). [002] Ostre warunki hybrydyzacji można zastosować w celu zidentyfikowania sekwencji nukleotydowych, które są zasadniczo identyczne z daną sekwencją nukleotydową. Ostre warunki są uzależnione od sekwencji i będą różne w różnych okolicznościach. Generalnie, ostre warunki dobiera się tak, aby temperatura była o około C niższa od temperatury topnienia (T m ) konkretnych sekwencji przy określonej sile jonowej i ph. Temperatura T m to temperatura (przy określonej sile jonowej i ph), w której 0% docelowej sekwencji hybrydyzuje z idealnie pasującą sondą. Typowo, dobiera się takie ostre warunki, w których stężenie soli jest około 0,02 molarne przy ph 7, a temperatura wynosi co najmniej 60 C. Obniżenie stężenia soli i/lub zwiększenie temperatury zwiększa ostrość. Ostre warunki dla hybrydyzacji RNA-DNA (analiza Northern z zastosowaniem sondy np. 0 nt) to na przykład takie, które obejmują co najmniej jedno płukanie w 0,2X SSC w temperaturze 63 C przez min albo warunki równoważne. Ostre warunki dla hybrydyzacji DNA-DNA (analiza Southern z zastosowaniem sondy np. 0 nt) to na przykład takie, które obejmują co najmniej jedno płukanie (zazwyczaj 2) w 0,2X SSC w temperaturze 0 C, zazwyczaj w temperaturze około C przez min albo warunki równoważne. Patrz również Sambrook i wsp. (1989) oraz Sambrook i Russell (01). [0026] Identyczność sekwencji i podobieństwo sekwencji można określić poprzez przyrównanie dwóch sekwencji peptydowych albo nukleotydowych przy

16 1 2 zastosowaniu algorytmu przyrównania globalnego albo lokalnego. Sekwencje można następnie uznać za zasadniczo identyczne albo zasadniczo podobne, jeżeli (po optymalnym zastawieniu na przykład przez programy GAP lub BESTFIT z zastosowaniem parametrów domyślnych) wykazują co najmniej pewien minimalny procent identyczności sekwencji (jak zdefiniowano poniżej). W GAP wykorzystuje się algorytm przyrównania globalnego według Needlemana i Wunscha do dopasowania dwóch sekwencji na całej ich długości, maksymalizując liczbę pozycji dopasowanych i minimalizując liczbę luk. Generalnie, stosuje się domyślne parametry GAP, z karą za utworzenie luki = 0 (nukleotydy)/8 (białka) i karą za rozszerzenie luki = 3 (nukleotydy)/2 (białka). W przypadku nukleotydów, stosowana domyślna macierz porównania to nwsgapdna, a w przypadku białek domyślna macierz porównania to Blosum62 (Henikoff i Henikoff, 1992, PNAS 89, 91-919). Przyrównanie sekwencji i wyniki dla procentu identyczności sekwencji można uzyskać przy zastosowaniu programów komputerowych, takich jak pakiet GCG Wisconsin Package, wersja.3, dostępny w firmie Accelrys Inc., 968 Scranton Road, San Diego, CA 92121-372 USA. Alternatywnie procent podobieństwa albo identyczności sekwencji można określić poprzez przeszukiwanie baz danych, takich jak FASTA, BLAST itd. [0027] W tym dokumencie i jego zastrzeżeniach czasownik zawierać i jego odmiany stosowane są w nieograniczającym sensie, w znaczeniu, że pozycje następujące po tym wyrazie są zawarte, ale pozycje, które nie zostały konkretnie wzmiankowane, nie są

17 1 2 wykluczone. Dodatkowo, odniesienie się do jakiegoś elementu w liczbie pojedynczej nie wyklucza możliwości, że obecny jest więcej niż jeden element, o ile kontekst nie wymaga wyraźnie, żeby obecny był jeden i tylko jeden z elementów. Oznacza zatem zazwyczaj co najmniej jeden. Jest ponadto zrozumiałe, że kiedy w niniejszym dokumencie następuje odniesienie do sekwencji, generalnie dotyczy to konkretnych cząsteczek fizycznych o pewnej sekwencji podjednostek (np. aminokwasów). SZCZEGÓLOWY OPIS WYNALAZKU [0028] Stosując identyfikację poprzez aktywację (ang. activation tagging), wynalazcy wyizolowali i scharakteryzowali gen Arabidopsis określany jako HARDY (HRD), którego nadekspresja skutkowała wieloma zmianami w architekturze roślin i związanych z nią strukturach wewnętrznych w porównaniu do typu dzikiego. Aktywacja HRD prowadziła do powstawania liści, które wyglądają na grubsze, z mniejszą, zwartą, odporną strukturą rośliny. Roślinę trudniej wyciągnąć z ziemi, prawdopodobnie na skutek zwiększonej bocznej sieci korzeniowej. Gen HRD sklonowano i zsekwencjonowano i stwierdzono, że jest podobny do czynników transkrypcyjnych zdefiniowanych jako AP2/ERF (Alonso i wsp. 03, Science 1, 63-67). Nie opisano jednak żadnych funkcji HRD i w stanie techniki nie sugerowano żadnych zastosowań genu HRD. [0029] Konstytutywna ekspresja genu HRD w transgenicznych roślinach Arabidopsis wykazywała ten sam fenotyp, co wyjściowa linia identyfikowana poprzez aktywację, jakkolwiek fenotyp był silniejszy. Wyjściowego mutanta hrd z nadekspresją testowano pod

18 1 2 kątem odporności na warunki stresu abiotycznego i biotycznego i stwierdzono, że jest znacznie bardziej odporny niż kontrole typu dzikiego. Dodatkowo, strategia nadekspresji warunkowej z zastosowaniem fuzji HRD z receptorem glikokortykoidu wykazała, że fenotyp może być indukowany, a rośliny z fenotypem łagodnym albo prawie bez fenotypu były odporne na testy stresowe. Doświadczenia z mikromacierzami dla mutanta hrd z zastosowaniem mikromacierzy dla całego genomu Arabidopsis wykazały różnicową ekspresję zestawu genów, które były różne niż przy nadekspresji innych znanych genów odporności na stres AP2/ERF, takich jak DREB1A, co wskazuje na odmienny mechanizm nadawania ogólnej odporności na stres. Sekwencje kwasów nukleinowych i białka zastosowane w wynalazku [00] W wynalazku stosowane są sekwencje kwasów nukleinowych i sekwencje aminokwasowe przedstawicieli czynników transkrypcyjnych HARDY. [0031] Funkcję białka można badać przy zastosowaniu rozmaitych znanych metod, korzystnie poprzez porównywanie fenotypu transformantów z konstytutywną ekspresją badanego białka z fenotypem transformantów z nadekspresją HRD w tym samym gatunku (i odmianie) gospodarza (korzystnie zawierającym chimerowy kodujący gen HRD stabilnie włączony do genomu gospodarza), umożliwiając bezpośrednie porównanie efektu funkcjonalnego na fenotyp transformantów. Rozumie się, że w doświadczeniach transformacyjnych widoczny jest pewien stopień zróżnicowania fenotypu, normalnie na skutek efektu pozycyjnego w genomie i/lub z powodu

19 1 2 liczby kopii. Specjalista będzie wiedział, w jaki sposób porównywać ze sobą transformanty, np. poprzez selekcję pojedynczych zdarzeń i analizę ich fenotypów. Inne metody określania albo potwierdzania funkcji genu/białka in vivo obejmują wytwarzanie mutantów z nokautem albo badania z przejściową ekspresją. Informacji dotyczącej przestrzenno-czasowego wzoru ekspresji i roli białka mogą również dostarczyć badania promotor-ekspresja genu reporterowego. [0032] Konstytutywna (nad)ekspresja przedstawiciela genu HARDY prowadzi do jednej lub większej liczby następujących zmian fenotypowych w porównaniu z typem dzikim albo transformantami kontrolnymi: - Grubsze liście ze zwiększoną warstwą mezofilową - Mniejsza, zwarta i silnie wyglądająca roślina - Mocniejsza struktura korzeniowa ze zwiększeniem korzeni bocznych - Zwiększona odporność na patogen, np. nieswoisty wobec odmiany (Verticillium) - Zwiększona tolerancja na suszę, widoczna jako wyższa przeżywalność niż typ dziki [0033] Te fenotypy można wykorzystać do wytwarzania transgenicznych roślin lub tkanek organów roślinnych ze zmodyfikowanymi i ulepszonymi właściwościami agronomicznymi, takimi jak zwiększona tolerancja na suszę i innymi, jak tu opisano w innym miejscu. [0034] Wynalazek dostarcza zastosowania sekwencji kwasu nukleinowego kodującej białko o sekwencji SEK ID NR: 3 lub białko w co najmniej 70% identyczne z SEK ID NR: 3 albo białko ortologiczne, do wytwarzania roślin transgenicznych wykazujących kombinację dwóch albo

1 2 większej liczby fenotypów wybranych z grupy obejmującej: zwiększoną tolerancję na suszę, zwiększoną odporność na choroby i ulepszoną strukturę korzeniową. [003] Wynalazek dostarcza ponadto sposobu wytwarzania transgenicznych roślin wykazujących kombinację dwóch albo większej liczby fenotypów wybranych z grupy obejmującej: zwiększoną tolerancję na suszę, zwiększoną odporność na choroby i ulepszoną strukturę korzeniową, zawierających wstawiony do genomu rośliny chimerowy gen zawierający transkrypcyjną sekwencję regulacyjną aktywną w komórkach roślinnych, przyłączoną w sposób umożliwiający działanie do sekwencji kwasu nukleinowego kodującej białko o sekwencji SEK ID NR: 3 lub białko w co najmniej 70% identyczne z SEK ID NR: 3 albo białko ortologiczne. [0036] W korzystnym wykonaniu taka transkrypcyjna sekwencja regulacyjna jest wybrana z grupy składającej się z promotora konstytutywnego, promotora indukowalnego, promotora specyficznego tkankowo i promotora regulowanego w rozwoju. [0037] Ponadto korzystne jest, jeżeli transkrypcyjna sekwencja regulacyjna jest promotorem indukowalnym stresem. [0038] Korzystne jest, jeżeli kodująca sekwencja kwasu nukleinowego zastosowana w tym wynalazku ma sekwencję SEK ID NR: 1. [0039] Innych przedstawicieli podobnych do HARDY można zidentyfikować in silico, np. poprzez identyfikowanie sekwencji kwasu nukleinowego albo białkowych w istniejących bazach danych kwasów nukleinowych lub białek (np. GENBANK, SWISSPROT, TrEMBL), z

21 1 2 zastosowaniem standardowego oprogramowania do analizy sekwencji, takiego jak narzędzia do poszukiwania podobieństwa sekwencji (BLASTN, BLASTP, BLASTX, TBLAST, FASTA itd.). [0040] Białka HRD stosowane w wynalazku, których przykład podano jako SEK ID NR: 3, mogą być izolowane ze źródeł naturalnych, syntetyzowane de novo poprzez syntezę chemiczną (z użyciem np. syntetyzatora peptydów, takiego jak dostarczany przez firmę Applied Biosystems) albo wytwarzane przez rekombinowane komórki gospodarza. Białek HRD stosowanych w wynalazku można użyć do uzyskania przeciwciał mono- i poliklonalnych, które można zastosować na przykład do wykrywania białek HRD w próbkach (metody i zestawy analiz immunochemicznych). [0041] Chimerowe lub hybrydowe białka HRD zawierają odcinki domeny AP2 lub inne części białka HRD. Domeny można wymieniać (tasowanie domen) między białkami HRD i innymi niespokrewnionymi białkami, o ile funkcjonalność otrzymanych w rezultacie białek chimerowych jest zasadniczo podobna do HRD. Chimerowe białko HRD może zatem zawierać na przykład białko HRD, zawierające domenę AP2 i dodatkowo, jedną albo większą liczbę domen, których normalnie nie ma w białkach HRD, takie jak domeny stabilizujące, domeny wiążące (np. domeny wiążące hormon, takie jak znajdujące się w receptorze glikokortykoidu, czego rezultatem jest indukowalność) itd. W innym wykonaniu dostarczone są chimerowe białka HRD, które zawierają fuzję HRD-domena represora, taką jak fuzja HRD-EAR opisana poniżej. W roślinach transgenicznych nadekspresja tych chimerowych białek

22 1 2 prowadzi do fenotypu dominującego negatywnego. Fuzja HRD-domena represora może również zawierać dodatkowe przyłączone do niej domeny, takie jak np. domena wiążąca hormon (patrz np. Markel i wsp. 02, Nucl. Acid Res., 4709-4719). [0042] Dostarcza się również sekwencje kwasów nukleinowych (genomowego DNA, cdna, RNA) kodujące białko HRD, takie jak na przykład HRD, jak zdefiniowano powyżej (w tym dowolne chimerowe lub hybrydowe białka HRD), albo dowolne białko HRD z innego gatunku. Na skutek degeneracji kodu genetycznego różne sekwencje kwasu nukleinowego mogą kodować taką samą sekwencję aminokwasową. Dostarczone sekwencje kwasów nukleinowych obejmują sekwencje kwasów nukleinowych występujące naturalnie, sztuczne albo syntetyczne. Przykład sekwencji kwasu nukleinowego kodującego HRD podano w SEK ID NR: 1 (sekwencja kodująca białka HRD z Arabidopsis) i SEK ID NR: 2 (genomowa sekwencja HRD z Arabidopsis). Rozumie się, że kiedy sekwencje są przedstawiane jako sekwencje DNA, przy odnoszeniu się do RNA, sekwencja zasad cząsteczki RNA jest identyczna, z tą różnicą, że tymina (T) jest zastąpiona przez uracyl (U). [0043] Jest jasne, że w celu zidentyfikowania, zsyntetyzowania lub wyizolowania wariantów lub fragmentów sekwencji kwasów nukleinowych można zastosować wiele metod, takich jak hybrydyzacja kwasu nukleinowego, technologia PCR, analiza in silico oraz synteza kwasu nukleinowego i tym podobne. [0044] Sekwencję kwasu nukleinowego, a konkretnie sekwencję DNA kodującą białka HRD stosowane w tym

23 1 2 wynalazku, można wstawić do wektorów ekspresyjnych w celu wytworzenia dużych ilości białek HRD (albo np. chimerowych białek HRD), jak opisano poniżej. Celem optymalnej ekspresji HRD w gospodarzu sekwencje DNA można optymalizować pod względem kodonów poprzez przystosowanie wykorzystywania kodonów do najbardziej preferowanego w genach roślinnych, szczególnie genach natywnych dla rodzaju albo gatunku rośliny będącego przedmiotem zainteresowania (Bennetzen i Hall, 1982, J. Biol. Chem. 27, 26-31; Itakura i wsp., 1977 Science 198, 6-63), stosując dostępne tabele wykorzystywania kodonów (np. bardziej przystosowane do ekspresji w bawełnie, soi, kukurydzy lub ryżu). Tabele wykorzystywania kodonów dla różnych gatunków roślin opublikowali na przykład Ikemura (1993, w Plant Molecular Biology Labfax, Croy, red., Bios Scientific Publishers Ltd.) i Nakamura i wsp. (00, Nucl. Acids Res. 28, 292), są one również dostępne w głównych bazach danych dla sekwencji DNA (np. EMBL w Heidelbergu, Niemcy). Można zatem skonstruować syntetyczne sekwencje DNA tak, że wytwarzane są takie same albo zasadniczo takie same biała. W piśmiennictwie patentowym i naukowym można znaleźć kilka technik modyfikacji wykorzystywania kodonów do preferowanego przez komórki gospodarza. Dokładna metoda modyfikacji wykorzystywania kodonów nie jest krytyczna dla tego wynalazku. [004] Niewielkich modyfikacji sekwencji DNA, takich jak opisane powyżej, można dokonać rutynowo, tj., poprzez mutagenezę za pośrednictwem PCR (Ho i wsp., 1989, Gene 77, 1-9, White i wsp., 1989, Trends in

24 1 2 Genet., 18-189). Znaczniejszych modyfikacji sekwencji DNA można dokonać poprzez syntezę DNA de novo pożądanych regionów kodujących, stosując dostępne techniki. [0046] Również sekwencje kwasów nukleinowych HRD można modyfikować w taki sposób, że koniec N białka HRD ma optymalny kontekst inicjacji translacji, poprzez dodanie albo delecję jednego albo większej liczby aminokwasów na końcu N białka. Często korzystne jest, jeżeli białka według wynalazku, które mają ulegać ekspresji w roślinach, zaczynają się od dipeptydu Met- Asp lub Met-Ala celem optymalnej inicjacji translacji. Kodon Asp lub Ala może być zatem wstawiony po istniejącej Met, albo drugi kodon, Val, może być zastąpiony przez kodon dla Asp (GAT lub GAC) albo Ala (GCT, GCC, GCA lub GCG). Sekwencje DNA mogą być również modyfikowane w celu usunięcia nieuprawnionych miejsc składania RNA. [0047] W jednym z wykonań wynalazku ekspresja genu HRD jest obniżona w komórce gospodarza, roślinie albo konkretnej tkance (tkankach) poprzez metody z wykorzystaniem RNAi, jak opisano w innym miejscu niniejszego opisu. W jeszcze innym wykonaniu fenotypy utraty funkcji dla HRD (w komórkach, tkankach albo całych roślinach gospodarza) wytwarza się poprzez ekspresję sekwencji kwasu nukleinowego kodującej fuzję białkową białka HRD (jak tu zdefiniowano) z (dominującą) domeną represorową. Utrata funkcji odnosząca się tutaj do utraty funkcji białka HRD w tkance albo organizmach gospodarza, obejmuje funkcję na poziomie molekularnym (np. utratę aktywacji

2 1 2 transkrypcyjnej leżących poniżej genów docelowych czynnika transkrypcyjnego HRD), a korzystnie również na poziomie fenotypowym. Żeby zapewnić utratę funkcji, wytwarza się na przykład fuzje białka HRD z 12- aminokwasową domeną represorową EAR, jak opisano w Hiratsu i wsp., 03 (Plant J. 34:733-739). Te fuzje domeny represorowej z dowolnym z białek HRD (jak tu zdefiniowano), nazywane tu fuzjami białkowymi HRD- EAR, są zdolne do powodowania represji leżących poniżej genów docelowych, prowadzą zatem do powstania działającego mutanta z utratą funkcji (efekt dominujący negatywny). Te funkcje represorowe zapewniają również represję w roślinach heterologicznych, w których geny ortologiczne nie zostały jeszcze zidentyfikowane. W jednym z wykonań dostarcza się sekwencję kwasu nukleinowego, która koduje chimerową fuzję białkową domena represorowa-hrd, a konkretnie fuzję białkową HRD-EAR. Dodatkowo, dostarcza się wektor zawierający taką sekwencję kwasu nukleinowego oraz komórkę, tkankę i/lub organizm gospodarza zawierający chimerowy gen. W celu wytworzenia fuzji białkowej domena represorowa- HRD, sekwencję kwasu nukleinowego kodująca domenę represorową przyłącza się translacyjnie do sekwencji kwasu nukleinowego zawierającej sekwencję kodującą HRD. Sekwencję kwasu nukleinowego kodującą fuzję białkową domena represorowa-hrd (konkretnie HRD-EAR) umieszcza się pod kontrolą promotorów konstytutywnych albo specyficznych (np. specyficznych tkankowo albo regulowanych w rozwoju). Ekspresja konstytutywna zapewnia utratę funkcji we wszystkich tkankach gospodarza, gdzie zachodzi ekspresja HRD albo ortologów

26 1 2 i gdzie są one niezbędne dla funkcji. Ekspresja specyficzna białka HRD-EAR zapewnia utratę funkcji w konkretnych tkankach lub warunkach, np. kiedy promotor specyficzny jest połączony w sposób umożliwiający działanie z kwasem nukleinowym kodującym fuzję białkową HRD-EAR. [0048] Rozumie się, że białka HRD mogą być przyłączone w sposób umożliwiający działanie do innej domeny represorowej znanej w stanie techniki, która działa w komórkach roślinnych. Obejmuje to domeny represorowe białek zwierzęcych, takie jak domena represorowa ENGRAILED (En) Drosophila. Do białka HRD według wynalazku można na przykład przyłączyć 298 N-końcowych aminokwasów, tworząc chimerowe białko dominującenegatywne (patrz Markel i wsp. 02, Nucleic Acid Research, tom, 4709-4719 oraz Chandler i Werr 03, Trends in Plant Science, tom 8, 279-28). Należy zaznaczyć, że domeny represorowe mogą być przyłączone do białka HRD na końcu C albo końcu N, w zależności od domeny. Sekwencję kwasu nukleinowego kodującą fuzję białkową dominującą-negatywną można określić jako chimerowy gen dominujący-negatywny, a kiedy przenosi się go do genomu gospodarza - jako transgen dominujący-negatywny (bądź włączony stabilnie do genomu gospodarza, bądź podlegający ekspresji przejściowej). Innymi roślinnymi domenami represorowymi są na przykład korepresory LEUNG i SEUSS białek AGAMOUS, FLC i polycomb. Inne zwierzęce domeny represorowe obejmują na przykład bloki związane z WT1, eve, c-erba i v-erba oraz Krüppel (patrz Chandler i Werr, 03, jak wyżej i odnośniki tam zawarte).

27 1 2 [0049] Do wykrywania sekwencji DNA HRD można zastosować startery i/lub sondy i zestawy do PCR. Zdegenerowane albo specyficzne pary starterów do amplifikacji DNA HRD z próbek można zsyntetyzować na podstawie SEK ID NR: 3, jak wiadomo ze stanu techniki (patrz Dieffenbach i Dveksler (199) PCR Primer: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press oraz McPherson i wsp. (00) PCR-Basics: From Background to Bench, wydanie pierwsze, Springer Verlag, Niemcy). Analogicznie, fragmenty jako sondy do hybrydyzacji można zastosować DNA o SEK ID NR: 1-2. Zestawy do wykrywania HRD mogą zawierać startery specyficzne dla HRD i/lub sondy specyficzne dla HDR i dołączony protokół stosowania starterów lub sond do wykrywania DNA HRD w próbce. Taki zestaw do wykrywania można zastosować na przykład do określenia, czy roślina została transformowana genem HRD (albo jego częścią) według wynalazku. Dzięki degeneracji kodu genetycznego, niektóre kodony dla aminokwasów można zastąpić innymi bez zmiany sekwencji aminokwasowej białka. [000] Można zastosować przeciwciała, które wiążą się swoiście z białkiem HRD zastosowanym w wynalazku. Konkretnie, uwzględnia się tutaj przeciwciała monoklonalne albo poliklonalne, które wiążą się z HRD albo jego fragmentami lub wariantami. Przeciwciało można wytworzyć przy użyciu zastosowanego w wynalazku białka HRD jako antygenu u zwierząt, stosując metody znane w stanie techniki, opisane na przykład w Harlow i Lane Using Antibodies: A laboratory manual (New York: Cold Spring Harbor Press 1998) oraz w Liddell i Cryer A Practical Guide to Monoclonal Antibodies (Wiley and

28 1 2 Sons, 1991). Przeciwciał można następnie użyć do izolacji, identyfikacji, określania charakterystyki lub oczyszczania białka HRD, z którym się wiążą, na przykład do wykrywania białka HRD w próbce, umożliwiając tworzenie się kompleksu immunologicznego i wykrywanie obecności kompleksu immunologicznego np. poprzez test ELISA (enzymatyczny test immunologiczny) lub analizę Western. Dostarcza się również zestawy immunologiczne, przydatne do wykrywania białek HRD, fragmentów białkowych albo epitopów w próbce. Próbkami mogą być komórki, nadsącze komórkowe, tkanki itd. Takie zestawy zawierają co najmniej przeciwciało, które wiąże się z białkiem HRD i jeden albo większą liczbę odczynników do immunodetekcji. Przeciwciała można również zastosować do izolacji/identyfikacji innych białek HRD, na przykład przy zastosowaniu testu ELISA albo analizy Western. [001] Dodatkowo, można tu zastosować sekwencje kwasu nukleinowego zawierające promotor HRD. Transkrypcyjne sekwencje regulacyjne mogą znajdować się około 1 kb przed kodonem ATG o SEK ID NR: 1. Transkrypcyjną sekwencję regulacyjną HRD podano w SEK ID NR: 2, jako region ' o wielkości 1,1 kb. Tych transkrypcyjnych sekwencji regulacyjnych można użyć do konstrukcji genów chimerowych i do ekspresji sekwencji kwasu nukleinowego przyłączonych w sposób umożliwiający działanie w gospodarzach albo komórkach gospodarzy. Transkrypcyjną sekwencję regulacyjną HRD można zastosować zwłaszcza do ekspresji genów wczesnej tolerancji na stres w nasieniu i zarodku. Rozumie się, że swoistość tkankową transkrypcyjnych sekwencji regulacyjnych można ulepszyć

29 albo określić poprzez analizę fragmentów delecyjnych dostarczonych sekwencji pod kątem ich zdolności do kierowania ekspresji sekwencji kwasów nukleinowych przyłączonych do nich w sposób umożliwiający działanie. Taka analiza delecyjna umożliwia usunięcie części kwasów nukleinowych, powodujących ekspresję niespecyficzną (na poziomie tła). Podobnie, transkrypcyjne sekwencje regulacyjne innych genów HRDpodobnych można izolować poprzez sekwencjonowanie genomowego DNA powyżej kodonu ATG, stosując metody takie, jak TAIL-PCR. Geny chimerowe, wektory i rekombinowane drobnoustroje zastosowane w wynalazku 1 2 [002] W wynalazku sekwencje kwasów nukleinowych kodujące białka HRD (obejmujące np. fuzje białkowe, takie jak HRD-GR i HRD-EAR), jak opisano powyżej, stosuje się do wytworzenia genów chimerowych i wektorów je zawierających do przenoszenia genu chimerowego do komórki gospodarza i wytworzenia białka (białek) HRD w komórkach gospodarza, takich jak komórki, tkanki, narządy lub organizmy pochodzące z transformowanej komórki(komórek). Korzystne jest, jeżeli komórkami gospodarzy są komórki roślinne, ale bierze się również pod uwagę gospodarzy-drobnoustroje (bakterie, drożdże, grzyby itd.). Odpowiednim gospodarzem może być dowolna roślina uprawna, taka jak rośliny jednoliścienne lub rośliny dwuliścienne, na przykład kukurydza (gatunki Zea, np. Z. mays, Z. diploperennis (chapule), Zea luxurians (teosinte gwatemalska), Zea mays podgat. huehuetenangensis (teosinte San Antonio Huista), Z.

1 2 mays podgat. mexicana (teosinte meksykańska), Z. mays podgat. parviglumis (teosinte Balsas), Z. perennis (teosinte trwała) i Z. ramosa), pszenica (gatunki Triticum), jęczmień (np. Hordeum vulgare), owies (np. Avena sativa), sorgo (Sorghum bicolor), żyto (Secale cereale), soja (Glycine spp, np. G. max), bawełna (gatunki Gossypium, np. G. hirsutum, G. barbadense), Brassica spp. (np. B. napus, B. juncea, B. oleracea, B. rapa itd.), słonecznik (Helianthus annus), tytoń (gatunki Nicotiana), lucerna (Medicago sativa), ryż (gatunki Oryza, np. O. sativa grupa odmiany lub grupa odmiany indica lub grupa odmiany japonica), trawy paszowe, proso perłowe (Pennisetum spp., np. P. glaucum), gatunki drzew, gatunki warzyw, takie jak Lycopersicon spp. (np. Lycopersicon esculentum), ziemniak (Solanum tuberosum, inne gatunki Solanum), oberżyna (Solanum melongena), pieprze (Capsicum annuum, Capsicum frutescens), groch, fasola (np. gatunki Phaseolus), owoce mięsiste (winogrona, brzoskwinie, śliwki, truskawki, mango), gatunki ozdobne (np. gatunki róż, petunii, chryzantem, lilii, gerber), drzewa leśne (np. gatunki Populus, Salix, Quercus, Eucalyptus), gatunki włókniste, np. len (Linum usitatissimum) i konopie (Cannabis sativa). [003] Roślina uprawna dotyczy tu gatunków roślin, które są uprawiane i hodowane przez ludzi w konkretnych celach. Roślinę uprawną można hodować w celach spożywczych (np. rośliny uprawne z pól) albo celach ozdobnych (np. wytwarzania kwiatów ciętych, traw na trawniki itd.). Pojęcie rośliny uprawnej według definicji z niniejszego opisu obejmuje rośliny, z

31 1 2 których uzyskuje się produkty niespożywcze, takie jak olej do paliwa, plastykowe polimery, produkty farmaceutyczne, korek i tym podobne. [004] Konstrukcja chimerowych genów i wektorów celem, korzystnie stabilnego, wprowadzania sekwencji kwasu nukleinowego kodujących białko HRD do genomu komórek gospodarza jest generalnie znana w stanie techniki. W celu wytworzenia genu chimerowego, sekwencję kwasu nukleinowego kodującą białko HRD (albo np. fuzję białkową HRD-domena GR) przyłącza się w sposób umożliwiający działanie do sekwencji promotorowej, odpowiedniej do ekspresji w komórkach gospodarza przy zastosowaniu standardowych technik biologii molekularnej. Sekwencja promotorowa może być już obecna w wektorze, tak, że sekwencja HRD jest po prostu wstawiana do wektora poniżej sekwencji promotorowej. Wektor jest następnie używany do transformowania komórek gospodarza i chimerowy gen wstawia się do genomu jądrowego albo do genomu plastydowego, mitochondrialnego albo chloroplastowego i poddaje tam ekspresji przy zastosowaniu odpowiedniego promotora (np. Mc Bride i wsp., 199 Bio/Technology 13, 362; US,693, 07). W jednym z wykonań gen chimerowy zawiera odpowiedni promotor do ekspresji w komórkach roślinnych albo drobnoustrojów (np. bakterii), przyłączoną do niego w sposób umożliwiający działanie sekwencję kwasu nukleinowego kodującą białko HRD albo fuzję białkową według wynalazku, po której następuje ewentualnie sekwencja kwasu nukleinowego nieulegająca translacji po stronie 3'.

32 1 2 [00] Sekwencja kwasu nukleinowego HRD, korzystnie chimerowy gen HRD, kodujący funkcjonalne białko HRD (albo, w niektórych wykonaniach, fuzję białkową HRDdomena GR), może być stabilnie wstawiona do genomu jądrowego pojedynczej komórki roślinnej w konwencjonalny sposób i otrzymana w ten sposób stransformowana komórka może być wykorzystana w konwencjonalny sposób do wytworzenia transformowanej rośliny, której fenotyp jest zmieniony na skutek obecności białka HRD w pewnych komórkach w pewnym czasie. W tym przypadku, wektora na bazie T-DNA, zawierającego sekwencję kwasu nukleinowego kodującą białko HRD, w Agrobacterium tumefaciens, można użyć do transformowania komórki roślinnej, a następnie z transformowanej komórki roślinnej można regenerować transformowaną roślinę, stosując procedury opisane na przykład w EP 0116718, EP 0270822, publikacji PCT WO84/02913 i opublikowanym europejskim zgłoszeniu patentowym EP 0242246 oraz w Gould i wsp. (1991, Plant Physiol. 9,426-434). Konstrukcja wektora na bazie T- DNA do transformacji roślin za pośrednictwem Agrobacterium jest dobrze znana w stanie techniki: wektor na bazie T-DNA może być bądź wektorem binarnym, jak opisano w EP 0161 i EP 011, bądź wektorem kointegracyjnym, który może włączać się do plazmidu Ti Agrobacterium poprzez rekombinację homologiczną, jak opisano w EP 0116718. [006] Każdy z korzystnych wektorów na bazie T-DNA zawiera promotor przyłączony w sposób umożliwiający działanie do sekwencji kwasu nukleinowego kodującej białko HRD, między sekwencjami granicznymi T-DNA albo

33 1 2 położony co najmniej po lewej stronie prawej sekwencji granicznej. Sekwencje graniczne są opisane w Gielen i wsp. (1984, EMBO J. 3, 83-84). Oczywiście do transformowania komórek roślinnych można zastosować inne typy wektorów, z wykorzystaniem procedur takich, jak bezpośredni transfer genów (jak opisano na przykład w EP 0223247), transformację za pośrednictwem pyłku (jak opisano na przykład w EP 027036 i WO8/0186), transformację protoplastu, jak opisano na przykład w US 4,684,611, transformację za pośrednictwem roślinnego wirusa RNA (jak opisano na przykład w EP 00673 i US 4,407,96), transformację za pośrednictwem liposomów (jak opisano na przykład w US 4,36,47) oraz inne metody, takie jak metody opisane w odniesieniu do transformowana pewnych linii kukurydzy (np. US 6,140,3; Fromm i wsp., 1990, Bio/Technology 8, 833-839; Gordon-Kamm i wsp., 1990, The Plant Cell 2, 603-618) i ryżu (Shimamoto i wsp., 1989, Nature 338, 274-276; Datta i wsp. 1990, Bio/Technology 8, 736-740) oraz ogólną metodę transformowania roślin jednoliściennych (publikacja PCT WO92/09696). Opis transformacji bawełny - patrz również WO 00/71733; opis transformacji ryżu - patrz również metody opisane w W092/09696, W094/00977 i W09/06722. Opis transformacji sorgo - patrz np. Jeoung JM i wsp. 02, Hereditas 137: -8 lub Zhao ZY i wsp. 00, Plant Mol Biol. 44: 789-98). Analogicznie, selekcja i regeneracja transformowanych roślin z transformowanych komórek jest dobrze znana w stanie techniki. Oczywiście, protokoły konkretnie adaptuje się do regeneracji transformantów z wysoką częstością w

34 1 2 przypadku różnych gatunków, a nawet różnych odmian lub odmian hodowlanych pojedynczego gatunku. [007] Poza transformacją genomu jądrowego, wynalazek obejmuje również transformację genomu plastydowego, korzystnie genomu chloroplastowego. Jedną z zalet transformacji genomu plastydowego jest to, że zmniejszone jest ryzyko rozprzestrzenienia się transgenu (transgenów). Transformację genomu plastydowego można przeprowadzić tak, jak to jest znane w stanie techniki: patrz np. Sidorov VA i wsp. 1999, Plant J. 19: 9-216 oraz Lutz KA i wsp. 04, Plant J. 37 (6): 906-13. [008] Otrzymane w rezultacie transformowane rośliny można wykorzystać w konwencjonalnym schemacie uprawy roślin do wytworzenia większej liczby transformowanych roślin z takimi samymi właściwościami albo do wprowadzenia części genów do innych odmian tego samego albo spokrewnionego gatunku rośliny. Nasiona, które otrzymuje się z transformowanych roślin, zawierają chimerowy gen HRD jako stabilną wstawkę genomową. Komórki transformowanej rośliny można hodować w konwencjonalny sposób w celu wytworzenia białka HRD, które można odzyskać do innych zastosowań, np. wytwarzania przeciwciał. [009] Sekwencję kwasu nukleinowego HRD wstawia się do genomu komórki roślinnej w taki sposób, że wstawiona sekwencja kodująca znajduje się poniżej (tj. po stronie 3 ) i pod kontrolą promotora, który kieruje ekspresją w komórce roślinnej. Korzystnie, dokonuje się tego poprzez wstawienie chimerowego genu do genomu komórki

3 1 2 roślinnej, a konkretnie genomu jądrowego lub plastydowego (np. chloroplastowego). [0060] Korzystne promotory obejmują: silne konstytutywne promotory 3S lub wzmocnione promotory 3S ( promotory 3S ) wirusa mozaiki kalafiora (CaMV): izolatów CM 1841 (Gardner i wsp., 1981, Nucleic Acids Research 9, 2871-2887), CabbB-S (Franck i wsp., 1980, Cell 21, 28-294) oraz CabbB-JI (Hull i Howell, 1987, Virology 86, 482-493); promotor 3S opisany przez Odell i wsp. (198, Nature 313, 8-812) oraz w US164316, promotory z rodziny ubikwitiny (np. promotor ubikwitiny kukurydzy z Christensen i wsp., 1992, Plant Mol. Biol. 18, 67-689, EP 0 342 926, patrz również Cornejo i wsp. 1993, Plant Mol. Biol. 23, 67-81), promotor gos2 (de Pater i wsp., 1992 Plant J. 2, 834-844), promotor emu (Last i wsp., 1990, Theor. Appl. Genet. 81, 81-88), promotory aktynowe Arabidopsis, takie jak promotor opisany przez An i wsp. (1996, Plant J., 7), promotory aktyny ryżu, takie jak promotor opisany przez Zhang i wsp. (1991, The Plant Cell 3, 11-116) oraz promotor opisany w US,641,876 lub promotor aktyny ryżu 2, jak opisano w WO070067; promotory wirusa mozaiki manioku (ang. Cassava vein mosaic virus) (WO 97/48819, Verdaguer i wsp. 1998, Plant Mol. Biol. 37, -67), seria promotorów pplex z wirusa karłowatości soi (ang. Subterranean Clover Stunt Virus) (WO 96/06932, a w szczególności promotor S7), promotor dehydrogenazy alkoholowej, np. padh1s (numery dostępu GenBank X04049, X0081) oraz promotor TR1' i promotor TR2' (odpowiednio, promotor TR1 i promotor TR2 ), które kierują ekspresją, odpowiednio,

36 1 2 genów 1' i 2' T-DNA (Velten i wsp., 1984, EMBO J 3, 2723-27), wirusa mozaiki trędownika (ang. Figwort Mosaic Virus), opisany w US60173 i w EP426641, promotory genów histonowych, takie jak promotor Ph4a748 z Arabidopsis (PMB 8: 179-191) lub inne. [0061] Alternatywnie, można zastosować promotor, który nie jest konstytutywny, ale raczej specyficzny dla jednej albo większej liczny tkanek albo organów rośliny (promotory z preferencją wobec tkanki, specyficzne tkankowo, w tym regulowane w rozwoju), na przykład z preferencją wobec liści, z preferencją wobec naskórka, z preferencją wobec korzeni, z preferencją wobec tkanki kwiatu, na przykład tapetum lub pylnika, z preferencją wobec nasienia, z preferencją wobec strąka itd., przy czym gen HRD (w tym np. gen kodujący fuzję białkową HRD-GR) podlega ekspresji jedynie w komórkach specyficznej tkanki (tkanek) lub organu (organów) i/lub jedynie w pewnym stadium rozwojowym. Gen(y) HRD mogą na przykład ulegać wybiórczej ekspresji w liściach rośliny poprzez umieszczenie sekwencji kodującej pod kontrolą promotora indukowalnego światłem, takiego jak promotor genu małej podjednostki karboksylazy rybulozo-1,- dwufosforanu z tej samej rośliny albo innej rośliny, takiej jak groch, jak ujawniono w US,24,799 lub Arabidopsis, jak ujawniono w US034322. Wybór promotora jest determinowany przez fenotyp, który chce się uzyskać, jak to zostanie opisane bardziej szczegółowo poniżej. [0062] W celu uzyskania tolerancji na suszę, odpowiedni będzie promotor konstytutywny, specyficzny wobec korzeni, indukowalny stresem albo patogenem.

37 1 2 Odpowiednim promotorem, indukowalnym stresem abiotycznym, byłby promotor rd29a (Kasuga i wsp. 1999). [0063] Promotor preferencyjnie aktywny w korzeniach, do ekspresji w tkance korzenia, opisano w WO00/2966. Innym promotorem preferencyjnej ekspresji w korzeniu jest promotor ZRP (i jego modyfikacje), jak opisano w US,633,363. Inny promotor specyficzny dla korzenia podano w tym wykonaniu jako promotor BOUNTIFUL (Pereira i wsp., nieopublikowane). [0064] Inną możliwością jest zastosowanie promotora, którego ekspresja jest indukowalna. Przykłady promotorów indukowalnych to promotory indukowalne przez zranienie, takie jak promotor MPI opisany przez Cordera i wsp. (1994, The Plant Journal 6, 141), który jest indukowany przez zranienie (powodowane na przykład przez owada albo bodźce fizyczne), albo promotor COMPTII (WO006897) lub promotor opisany w US603111. Alternatywnie promotor może być indukowalny przez związek chemiczny, taki jak deksametazon, jak opisali Aoyama i Chua (1997, Plant Journal 11: 60-612) oraz w US606398 albo tetracyklinę (promotor TOPFREE lub TOP, patrz Gatz, 1997, Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol. 48: 89-8 oraz Love i wsp. 00, Plant J. 21: 79-88). Innymi indukowalnymi promotorami są na przykład promotory indukowalne przez zmianę temperatury, takie jak promotor wstrząsu cieplnego opisany w US,447,88, przez warunki beztlenowe (np. promotor ADH1S kukurydzy), przez światło (US64760), przez patogeny (np. EP7908 lub EP9862) albo starzenie (SAG12 i SAG13, patrz US689042). Oczywiście, istnieją rozmaite inne dostępne promotory.

38 1 2 [006] Sekwencję kodującą HRD (lub sekwencję kodującą chimerowe białko HRD) wstawia się do genomu rośliny w taki sposób, że sekwencja kodująca znajduje się powyżej (tj. po stronie ') odpowiednich transkrypcyjnych sygnałów regulacyjnych na końcu 3' ( koniec 3' ) (tj. sygnały formowania transkryptu i poliadenylacji). Sygnały formowania transkryptu i poliadenylacji obejmują sygnały z genu 3S CaMV ( 3' 3S ), genu syntazy nopaliny ( 3' nos ) (Depicker i wsp., 1982 J. Molec. Appl. Genetics 1, 61-73), genu syntazy oktopiny ( 3'ocs ) (Gielen i wsp., 1984, EMBO J 3, 83-84) oraz genu 7 T-DNA ( 3' genu 7 ) (Velten i Schell, 198, Nucleic Acids Research 13, 6981-6998), które działają jako niepodlegające translacji sekwencje DNA po stronie 3' w transformowanych komórkach roślinnych, i inne. [0066] Wprowadzenie wektora na bazie T-DNA do Agrobacterium można przeprowadzić przy zastosowaniu znanych metod, takich jak elektroporacja lub krzyżowanie trójrodzicielskie. [0067] Sekwencję kwasu nukleinowego kodującą HRD można ewentualnie wstawić do genomu rośliny jako sekwencję genu hybrydowego, przy czym sekwencja HRD jest przyłączona w ramce (US,24, 799; Vaeck i wsp., 1987, Nature 328, 33-37) do genu kodującego podlegający selekcji albo wyróżnialny marker, taki jak na przykład gen neo (lub nptii) (EP 0 242 236) kodujący oporność na kanamycynę, tak, że roślina wykazuje ekspresję fuzji białkowej, którą można łatwo wykryć. [0068] Transformację komórek roślinnych można również zastosować do wytworzenia białka (białek) HRD

39 1 2 stosowanych w wynalazku w dużych ilościach w hodowli komórek roślinnych, które są odporne na wiele stresów i mogą być stosowane do wytwarzania konkretnych produktów w hodowli. Kiedy w niniejszym opisie znajduje się odniesienie do transgenicznej komórki roślinnej, oznacza to komórkę roślinną (albo także protoplast roślinny) jako taką w postaci wyizolowanej lub w hodowli tkankowej, albo komórkę roślinną (lub protoplast) zawartą w roślinie lub narządzie lub tkance po zróżnicowaniu i obydwie sytuacje są tu konkretnie uwzględnione. Odniesienie się do komórki roślinnej w opisie albo zastrzeżeniach nie oznacza zatem odniesienia jedynie do izolowanych komórek w hodowli, ale odnosi się do dowolnej komórki roślinnej, gdziekolwiek by się znajdowała albo w jakimkolwiek typie tkanki roślinnej lub narządzie byłaby obecna. [0069] Wszystkie albo część sekwencji kwasu nukleinowego HRD, kodującej białko HRD (lub chimerowe białko HRD), można również zastosować do transformacji drobnoustrojów, takich jak bakterie (np. Escherichia coli, Pseudomonas, Agrobacterium, Bacillus itd.), grzyby, wirusy, glony lub owady. Transformacja bakterii całą albo częścią sekwencji kwasu nukleinowego HRD według tego wynalazku, włączonego do odpowiedniego nośnika do klonowania, można przeprowadzić w konwencjonalny sposób, korzystnie przy zastosowaniu konwencjonalnych technik elektroporacji, takich jak opisane w Maillon i wsp. (1989, FEMS Microbiol. Letters 60, -2) oraz WO 90/06999. Celem ekspresji w komórkach gospodarza prokariotycznego wykorzystanie kodonów w sekwencji kwasu nukleinowego można

40 1 2 odpowiednio optymalizować (jak opisano powyżej w odniesieniu do roślin). Sekwencje intronowe powinny być usunięte i, jak wiadomo, można dokonać innych adaptacji celem uzyskania optymalnej ekspresji. [0070] W celu uzyskania wzmocnionej ekspresji w roślinach jednoliściennych, takich jak gatunki traw, np. kukurydzy lub ryżu, do chimerowego genu można dodać intron, korzystnie intron roślin jednoliściennych. Wykazano na przykład, że wstawienie intronu genu Adh1 kukurydzy do regionu regulacyjnego po stronie ' wzmacnia ekspresję w kukurydzy (Callis i wsp., 1987, Genes Develop. 1: 1183-10). Analogicznie, do wzmocnienia ekspresji można zastosować intron HSP70, jak opisano w US,89,347. Sekwencję DNA w sekwencji kwasu nukleinowego HRD można ponadto zmieniać w sposób neutralny dla translacji w celu modyfikowania potencjalnie hamujących sekwencji DNA obecnych w części genowej poprzez ukierunkowane wstawienie intronu i/lub poprzez wprowadzenie zmian w wykorzystaniu kodonów, na przykład przez adaptację wykorzystania kodonów do wykorzystania najbardziej preferowanego przez rośliny, korzystnie przez konkretny odpowiedni rodzaj rośliny, jak opisano powyżej. [0071] Zgodnie z jednym z wykonań tego wynalazku, białka HRD (albo białka chimerowe) kieruje się do organelli wewnątrzkomórkowych, takich jak plastydy, korzystnie chloroplasty, mitochondria, albo są one wydzielane z komórki, potencjalnie optymalizując stabilność i/lub ekspresję białka. Podobnie, białko można kierować do wakuoli. W tym celu w jednym z wykonań wynalazku chimerowe geny według wynalazku

41 1 2 zawierają region kodujący peptyd sygnałowy albo kierujący, połączony z regionem kodującym białko HRD. Szczególnie korzystne peptydy do włączenia do białek zastosowanych w tym wynalazku to peptydy tranzytowe do kierowania do chloroplastów lub innych plastydów, a w szczególności zduplikowane regiony peptydu tranzytowego z genów roślinnych, których produkt genowy jest kierowany do plastydów, optymalizowany peptyd tranzytowy według Capellades i wsp. (US,63,618), peptyd tranzytowy oksydoreduktazy ferredoksyna-nadp + ze szpinaku (Oelmuller i wsp., 1993, Mol. Gen. Genet. 237, 261-272), peptyd tranzytowy opisany w Wong i wsp. (1992, Plant Molec. Biol., 81-93) oraz peptydy kierujące w opublikowanym zgłoszeniu patentowym PCT WO 00/26371. Korzystne są również peptydy sygnałowe wydzielania białka połączonego z takim peptydem na zewnątrz komórki, takie jak sygnał wydzielniczy inhibitora proteinazy 11 ziemniaka (Keil i wsp., 1986, Nucl. Acids Res. 14, 641-60), sygnał wydzielniczy genu alfa-amylazy 3 ryżu (Sutliff i wsp., 1991, Plant Molec. Biol. 16, 79-91) oraz sygnał wydzielniczy białka PR1 tytoniu (Cornelissen i wsp., 1986, EMBO J., 37-40). Szczególnie korzystne peptydy sygnałowe obejmują chloroplastowy peptyd tranzytowy (np. Van Den Broeck i wsp., 198, Nature 313, 38) albo optymalizowany chloroplastowy peptyd tranzytowy z US,,471 i US,63,618, powodujący transport białka do chloroplastów, wydzielniczy peptyd sygnałowy albo peptyd kierujący białko do innych plastydów, mitochondriów, ER lub innego organellum. Sekwencje sygnałowe do kierowania do organelli

42 1 2 wewnątrzkomórkowych albo do wydzielania poza komórkę roślinną albo do ściany komórkowej znajdują się w naturalnie kierowanych albo wydzielanych białkach, korzystnie białkach opisanych przez Klösgen i wsp. (1989, Mol. Gen. Genet. 217, 1-161), Klösgen i Weil (1991, Mol. Gen. Genet. 22, 297-4), Neuhaus i Rogers (1998, Plant Mol. Biol. 38, 127-144), Bih i wsp. (1999, J. Biol. Chem. 274, 22884-22894), Morris i wsp. (1999, Biochem. Biophys. Res. Commun. 2, 328-333), Hesse i wsp. (1989, EMBO J. 8, 243-2461), Tavladoraki i wsp. (1998, FEBS Lett. 426, 62-66), Terashima i wsp. (1999, Appl. Microbiol. Biotechnol. 2, 16-23), Park i wsp. (1997, J. Biol. Chem. 272, 6876-6881), Shcherban i wsp. (199, Proc. Natl. Acad. Sci USA 92, 924-9249). [0072] W celu umożliwienia wydzielania białek HRD na zewnątrz transformowanej komórki gospodarza, odpowiedni wydzielniczy peptyd sygnałowy może być przyłączony do końca aminowego (koniec N) białka HRD. Przypuszczalne peptydy sygnałowe można wykrywać przy zastosowaniu analizy komputerowej, stosując programy takie, jak program do poszukiwań sekwencji sygnałowych (SignalP VI.1 lub 2.0) (Von Heijne, Gunnar, 1986 oraz Nielsen i wsp., 1996). [0073] W jednym z wykonań kilka sekwencji kwasu nukleinowego kodujących HRD poddaje się koekspresji w jednym gospodarzu. Gospodarza-roślinę z koekspresją można łatwo otrzymać poprzez transformowanie rośliny, w której już ulega ekspresji białko HRD albo poprzez krzyżowanie roślin transformowanych różnymi białkami HRD. Alternatywnie, kilka sekwencji kwasu nukleinowego kodujących HRD może być obecnych na jednym wektorze do

43 1 2 transformacji lub być jednocześnie transformowanych w tym samym czasie przy zastosowaniu odrębnych wektorów i selekcji transformantów zawierających obydwa chimerowe geny. Podobnie, jeden albo większą liczbę genów kodujących HRD można poddać ekspresji w jednej roślinie razem z innymi chimerowymi genami, na przykład kodującymi inne białka, które zwiększają tolerancję na suszę, takimi jak CBF1, DREB1A i geny OsDREB ryżu (Dubouzet i wsp., 03, Plant J. 33: 71), geny SHINE (Aharoni i wsp. 04, Plant Cell 16: 2463-80) lub inne. [0074] Rozumie się, że różne białka mogą ulegać ekspresji w tej samej roślinie albo każde może ulegać ekspresji w pojedynczej roślinie, a następnie może być kojarzone w tej samej roślinie poprzez krzyżowanie pojedynczych roślin z innymi. Przy wytwarzaniu hybrydowych nasion, w każdej roślinie rodzicielskiej może na przykład ulegać ekspresji jedno białko. Po skrzyżowaniu roślin rodzicielskich w celu wytworzenia hybryd, oba białka kojarzy się ze sobą w roślinie hybrydowej. [007] Korzystne jest, jeżeli dla celów selekcji, ale również w przypadku zwalczania chwastów, transgeniczne rośliny otrzymane poprzez zastosowanie wynalazku transformuje się również DNA kodującym białko nadające oporność na herbicyd, taki jak herbicyd o szerokim spektrum, na przykład herbicydy oparte na glufozynacie amonowym jako składniku aktywnym (na przykład Liberty lub BASTA; oporność jest nadawana przez gen PAT lub bar; patrz EP 0242236 i EP 0242246) lub glifosacie (np. RoundUp ; oporność jest nadawana przez geny EPSPS, patrz np. EP008909 i EP 007698). Stosowanie genów

44 1 oporności na herbicyd (lub inne geny nadające pożądany fenotyp) jako markera selekcyjnego ma ponadto taką zaletę, że można uniknąć wprowadzania genów oporności na antybiotyki. [0076] Alternatywnie, można zastosować inne geny markerów selekcyjnych, takie jak geny oporności na antybiotyki. Jako, że ogólnie nie jest akceptowane pozostawianie genów oporności na antybiotyki w transformowanych roślinach gospodarzach, geny te można ponownie usunąć po selekcji transformantów. Istnieją różne technologie usuwania transgenów. Jedną z metod uzyskiwania usunięcia jest oflankowanie chimerowego genu miejscami lox i, po selekcji, krzyżowanie transformowanej rośliny z rośliną z ekspresją rekombinazy CRE (patrz np. EP06763B1). Rekombinacja specyficzna miejscowo skutkuje wycięciem genu markerowego. Innym systemem rekombinacji specyficznej miejscowo jest system FLP/FRT opisany w EP686191 i US2769. Systemy rekombinacji specyficznej miejscowo, takie jak CRE/LOX i FLP/FRT, można również zastosować dla celów gromadzenia genów. Ponadto opisano również jednoskładnikowe systemy wycinania, patrz np. WO9737012 lub WO900. 2 Transformowane komórki roślinne/rośliny/nasiona otrzymane poprzez zastosowanie wynalazku oraz zastosowanie sekwencji kwasu nukleinowego i białek według wynalazku [0077] W następującej dalej części opisane jest zastosowanie sekwencji HRD według wynalazku do

4 wytwarzania transgenicznych komórek roślinnych, roślin, nasion roślin i ich dowolnych pochodnych/potomstwa z jednym albo większą liczbą zmodyfikowanych fenotypów. A) Rośliny ze zwiększoną tolerancją na stres 1 [0078] Transgeniczne rośliny z tolerancją na stres można wytwarzać poprzez transformowanie komórki gospodarza roślinnego sekwencją kwasu nukleinowego kodującą białko HRD pod kontrolą odpowiedniego promotora, jak opisano powyżej, i regenerację transgenicznej rośliny z takiej komórki. Korzystnymi promotorami są promotory, które są indukowane specyficznie przez stresy (abiotyczne i biotyczne) albo po zastosowaniu związków chemicznych. Konkretnie, korzystne są następujące promotory: 2 Promotor PR ryżu (Hashimoto i wsp., 04, Plant Cell Physiol. 4: 0-9) Promotor AtPLA IIA Arabidopsis (Narusaka i wsp., 03, Plant Cell Physiol. 44: 1246-2) Promotor CYP83B1 Arabidopsis (Narusaka i wsp. 04, PMB : 327-342) Promotor germiny gf-2.8 pszenicy (Berna i Bernier, 1999, PMB 39: 39-49) Termin tolerancja na suszę albo zwiększona/wzmocniona tolerancja na suszę stosuje się tu w odniesieniu do zwiększonej zdolności transformantów (w porównaniu z kontrolą typu dzikiego albo transformantami kontrolnymi) do tolerowania okresu suszy (pozbawienie/brak wody

46 1 2 prowadzący np. do widocznych oznak więdnięcia liści w roślinach kontrolnych), a następnie powrotu do poprzedniego stanu, co prowadzi do zmniejszenia ogólnych strat wydajności, ponieważ więcej roślin na m 2 przeżywa i/lub wydajność przeżywających roślin nie jest znacząco zmniejszona. Tolerancję na suszę można badać w kontrolowanych warunkach środowiskowych (szklarnia lub komory hodowlane) poprzez umieszczenie co najmniej około transformantów na zdarzenie transformacyjne i co najmniej roślin kontrolnych przez różny czas (w zakresie od 1-4 tygodni lub dłużej) w warunkach bez podlewania, aż spowoduje to więdnięcie liści albo utratę turgoru u roślin kontrolnych, a następnie podlewanie roślin ponownie przez 1-2 tygodnie i analizę fenotypu powrotu do stanu poprzedniego. Transformanty z tolerancją na suszę przeżywają bez wody co najmniej 2, 3, 4,, 6, 7 dni, korzystnie co najmniej 2- dni dłużej niż transformanty kontrolne (np. transformowane pustym wektorem) albo rośliny typu dzikiego w tych samych warunkach, które wykazują nieodwracalne uszkodzenie tkanki. W innej metodzie szacowania tolerancji, powrót transformantów do poprzedniego stanu jest co najmniej około 2- razy wyższy niż u roślin kontrolnych (np. z % kontrolnym powrotem do stanu poprzedniego, 40-0% przeżywalnością u transformantów). Termin odporność na choroby lub zwiększona odporność na choroby stosuje się tu w odniesieniu do zwiększonej zdolności transformantów do

47 1 2 wykazywania zmniejszenia objawów chorobowych w porównaniu z typem dzikim albo transformantami kontrolnymi. Badanie pod kątem odporności na choroby wykonuje się przy zastosowaniu patogenu, który daje reakcję podatności u roślin typu dzikiego. W jednym z wykonań patogenem jest grzyb Verticillium dahliae, jako przykład odporności niespecyficznej względem gospodarza. W przypadku badania Arabidopsis, siewki hoduje się w komorze hodowlanej w temperaturze 22-24 C z 12 godzinami światła w doniczkach o średnicy cm, zawierających mieszaninę kompost: piasek: perlit (2:1:1). Po dwóch tygodniach po wykiełkowaniu siewki wyciąga się delikatnie z korzeniami i szybko zanurza w nasyconej zawiesinie hodowli Verticillium, a następnie umieszcza z powrotem w doniczkach z ziemią, zakrywając korzenie. Rośliny podlewa się normalnie po kilku dniach przerwy i bada w różnych stadiach pod kątem objawów chorobowych. Rośliny bada się w powtórzonych doniczkach na genotyp, a chorobę ocenia się jako częstość roślin, które przeżywają w stanie dojrzałości. Ekotyp typu dzikiego Wassilewskija wykazuje brak przeżywalności w tym teście, podczas gdy genotypy odporne na chorobę wykazują przeżywalność w zakresie od do 0%. [0079] Transformanty z ekspresją wysokiego poziomu białka HRD selekcjonuje się np. poprzez analizę liczby kopii (analiza Southern), poziomu transkryptu mrna (np. RT-PCR z zastosowaniem par starterów HRD lub starterów

48 1 2 flankujących) lub poprzez analizowanie obecności i poziomu białka HRD w różnych tkankach (np. SDS-PAGE; testy ELISA itd.). Z powodów regulacyjnych, korzystnie wybiera się transformanty o jednej kopii i przeprowadza się analizę sekwencji flankujących miejsce wstawienia chimerowego genu, korzystnie poprzez sekwencjonowanie, w celu określenia charakterystyki zdarzenia. Zdarzenia transgeniczne z wysoką ekspresją HRD wybiera się do dalszego krzyżowania/krzyżowania wstecznego/krzyżowania wsobnego, aż otrzyma się wysokiej jakości zdarzenie ze stabilnym transgenem HRD. Generalnie, poziom ekspresji genu HRD i poziom ekspresji białka HRD będzie korelować z fenotypem odporności na suszę. Szczególnie w jednym z wykonań dostarcza się transgeniczne nasiona pochodzące z takich roślin, które można sprzedawać jako tolerujące suszę. [0080] Transformanty z ekspresją jednego albo większej liczby genów HRD według wynalazku mogą również zawierać inne transgeny, takie jak inne geny nadające tolerancję na suszę lub nadające tolerancję na inne stresy biotyczne lub abiotyczne. W celu otrzymania takich roślin ze zgromadzonymi transgenami, można dokonać introgresji innych transgenów do transformantów HRD, lub transformanty HRD można transformować kolejno jednym lub większą liczbą genów, albo alternatywnie, do transformowania linii albo odmiany rośliny można zastosować kilka genów chimerowych. Na pojedynczym wektorze może być na przykład obecnych kilka genów chimerowych albo geny chimerowe mogą być obecne na różnych wektorach i kotransformowane.

49 1 2 [0081] W jednym z wykonań następujące geny kojarzy się z jednym albo większą liczbą genów HRD według wynalazku: geny kodujące inne czynniki transkrypcyjne typu AP2/ERF, korzystnie takie, które odgrywają rolę w odpowiedzi rośliny na stresy środowiskowe, takie jak na przykład geny CBF1, CBF2, CBF3 i/lub CBF4 Arabidopsis (Jaglo-Ottosen i wsp. 1998, Kasuga i wsp. 1999, jak wyżej) albo ich ortologi z innych gatunków (Dubouzet i wsp. 03, jak wyżej), geny SHN (Aharoni i wsp., 04, jak wyżej), z genami odporności na owady, takimi jak geny toksyny Bacillus thuringiensis (kodujące białka owadobójcze, takie jak geny cry, geny vip itd.; lista dostępnych genów - patrz http://www.biols.susx.ac.uk/home/), geny odporności na grzyby lub inne geny. [0082] Transformanty ze zgromadzonymi genami mogą zatem wykazywać szerszą tolerancję na stres środowiskowy, na przykład na zasolenie, stres zimna, odporność na owady, odporność na patogeny, tolerancję stres cieplny, stres wodny itd. [0083] Możliwe jest również wprowadzenia albo dokonanie introgresji genu HRD do roślinnej linii hodowlanej, która już wykazuje stosunkowo wysoką tolerancję na suszę i/lub patogen, przy czym u podłoża tej tolerancji może leżeć odmienny mechanizm molekularny (np. architektura korzeni). B) Rośliny nietransgeniczne o zmodyfikowanym fenotypie [0084] Wykonaniem wynalazku jest również zastosowanie metod nietransgenicznych, np. systemu mutagenezy,

0 takiego jak TILLING (ang. Targeting Induced Local Lesions IN Genomics; Celowane indukowane miejscowe zmiany genomiczne; McCallum i wsp., 00, Nat Biotech 18:4 oraz McCallum i wsp. 00, Plant Physiol. 123, 439-442) i selekcji w celu uzyskania linii roślin, które wytwarzają wyższy poziom jednego albo większej liczby białek HRD według wynalazku. Bez ograniczania zakresu wynalazku, uważa się, że takie rośliny mogłyby zawierać mutacje punktowe/delecje w promotorze, dotyczące miejsc wiązania białek represorowych, co mogłoby uczynić gen HRD gospodarza konstytutywnym lub o wyższej ekspresji. Korzystne jest, jeżeli poziom białka HRD w mutancie albo częściach mutanta jest o co najmniej około 2,,, 1% lub bardziej zwiększony w 1 porównaniu z roślinami niebędącymi mutantami. W TILLING stosuje się tradycyjną mutagenezę chemiczną (np. mutagenezę EMS), po której następuje wysokoprzepustowe przeszukiwanie pod kątem mutacji (np. z zastosowaniem cięcia Cel 1 heterodupleksów DNA mutanta-typu dzikiego i wykrywania przy użyciu systemu żelu do sekwencjonowania), patrz np. Henikoff i wsp. Plant Physiology Preview, 21 maja 04. Uwzględnia się tu zatem nietransgeniczne rośliny, nasiona lub tkanki o zwiększonej ekspresji genu HRD w jednej albo większej 2 liczbie tkanek i wykazujące jeden albo większą liczbę fenotypów HRD według wynalazku (np. zwiększoną tolerancję na suszę, zwiększoną odporność na choroby itd., wszystkie jak opisano powyżej) oraz sposoby wytwarzania i identyfikowania takich roślin. [008] Sposób obejmuje w jednym z wykonań etapy mutagenizowania nasion rośliny (np. poprzez mutagenezę

1 1 2 EMS), łączenia w pulę poszczególnych roślin lub DNA, amplifikacji w reakcji PCR regionu będącego przedmiotem zainteresowania, tworzenia heterodupleksu i wysokoprzepustowego wykrywania, identyfikacji zmutowanej rośliny, sekwencjonowania zmutowanego produktu PCR. Rozumie się, że w celu wytworzenia takich zmutowanych roślin można z równym powodzeniem zastosować inne metody mutagenezy i selekcji. Nasiona można na przykład napromieniować albo poddać obróbce chemicznej, a rośliny przeszukiwać pod kątem zmodyfikowanego fenotypu HRD, takiego jak zwiększona tolerancja na suszę. [0086] W innym wykonaniu wynalazku materiałem roślinnym są naturalne populacje gatunków albo gatunków spokrewnionych, które zawierają polimorfizmy albo różnice w sekwencji DNA sekwencji kodującej i/lub regulacyjnej ortologa HRD. Docelowy gen HRD można przeszukiwać pod kątem mutacji przy zastosowaniu metody ECOTILLING (Henikoff i wsp. 04, jak wyżej). W tej metodzie linie hodowlane albo spokrewnione gatunki przeszukuje się pod kątem naturalnych polimorfizmów przy zastosowaniu opisanej powyżej metodologii TILLING, w której indywidualne rośliny albo ich pule wykorzystuje się do amplifikacji w reakcji PCR docelowego HRD, tworzenia heterodupleksu i wysokoprzepustowej analizy. Po tym może nastąpić selekcja poszczególnych roślin z pożądaną mutacją, które można następnie wykorzystać w programie hodowlanym w celu włączenia pożądanego homologicznego allelu ortologa HRD, żeby wyprowadzić odmianę hodowlaną z pożądaną cechą.

2 [0087] Rośliny-mutanty można odróżnić od roślin niezmutowanych przy zastosowaniu metod molekularnych, na przykład na podstawie obecności mutacji (jednej lub więcej) w DNA, poziomu białka HRD, poziomu RNA HRD itd. i na podstawie zmodyfikowanych cech fenotypowych. [0088] Mutanty nietransgeniczne mogą być homozygotyczne lub heterozygotyczne pod względem mutacji powodującej zwiększoną ekspresję endogennego genu (genów) HRD albo pod względem zmutowanego allelu (alleli) HRD. SEKWENCJE [0089] 1 SEK ID NR 1: sekwencja kodująca HRD Arabidopsis thaliana SEK ID NR 2: genomowy DNA kodujący HRD Arabidopsis thaliana SEK ID NR 3: sekwencja aminokwasowa HRD Arabidopsis thaliana SEK ID NR 4: domena białka receptora glukokortykoidu (GR) SEK ID NR : sekwencja kodująca domeny GR z sekwencjami flankującymi do klonowania 2 OPIS RYSUNKÓW [0090] Fig. 1 Fenotyp mutanta hrd i roślin 3S::HRD. A) Fenotyp młodych roślin mutanta hrd z

3 widocznymi ciemnozielonymi liśćmi i mniejszą wielkością B) Przekrój przez liść mutanta hrd w porównaniu do typu dzikiego, z widoczną większą liczbą warstw komórek mezofilowych u mutanta hrd. Fig. 2 - Struktura korzeni mutanta hrd w porównaniu do typu dzikiego po 3 tygodniach po wykiełkowaniu, z widocznymi bardziej obfitymi korzeniami drugorzędowymi i trzeciorzędowymi leżącymi bliżej połączenia z łodygą lub podstawą korzenia, co daje ogólnie strukturę włóknistą. 1 Fig. 3 - Mutant hrd, analiza ekspresji i struktura białka HRD 2 A) Region genomowy mutanta hrd z ukazaniem genów sąsiadujących ze znacznikiem, zidentyfikowanych jako AP2-podobny i aldolaza, z ich promotorami położonymi w odległości 6 kb i 2,3 kb od tetrameru wzmacniacza CaMV z wstawki I-ATag. B) Analiza ekspresji poprzez RT-PCR dwóch genów, AP2-podobnego i aldolazy, sąsiadujących z wstawką znacznika aktywującego. Użyty RNA otrzymano z rozetek liściowych z 2 próbek typu dzikiego i mutanta hrd. Ekspresja genu aldolazy jest niezmieniona, natomiast gen AP2- podobny ulega nadekspresji w mutancie hrd,

4 prawdopodobnie zatem to on właśnie nadaje fenotyp. C) Sekwencja aminokwasowa HARDY z widoczną konserwowaną domeną AP2. Aminokwasy w zacienionych blokach są identyczne z domeną AP2, a aminokwasy wytłuszczone są podobne do sekwencji najwyższej zgodności domeny AP2. 1 Fig. 4 - Indukcja HRD-GR przy zastosowaniu DEX daje fenotyp mutanta hardy Linie transformowane HRD-GR porównywano z ekotypem Ws typu dzikiego i mutantem hrd. Genotypy hodowano w warunkach krótkiego dnia (8 godzin światła dziennego) przez 4 tygodnie w celu zwiększenia liczby liści. Genotypy traktowano induktorem steroidowym DEX albo pozostawiano bez traktowania. Genotyp HRD-GR traktowany DEX wykazywał podobny fenotyp ciemnozielonych liści, co mutant hrd. 2 Fig. Doświadczenie z tolerancją na suszę hrd i typu dzikiego Piętnastodniowe siewki Ws typu dzikiego, potomstwo linii mutanta hrd i kontrolę pozytywną linię rd29-dreb1a (zapewniającą tolerancję na suszę; Kasuga i wsp. 1999, jak wyżej) poddawano odwodnieniu przez okres od 9 do 12 dni. Następnie siewki podlewano; na zdjęciu przedstawiono ich wygląd po tygodniu (powrót do stanu początkowego) - poza pierwszym rzędem z 9 DOD; w tym przypadku zdjęcia zrobiono bezpośrednio po zakończeniu okresu odwodnienia). DOD - dni odwodnienia.

1 Fig. 6 Indukowalna steroidem tolerancja na suszę nadawana przez fuzję HRD-GR Linię 3S::HRD-GR, która wykazywała indukcję przez traktowanie µm DEX, testowano pod kątem odporności na suszę w porównaniu z mutantem hrd i ekotypem Ws typu dzikiego. Siewki z trzech genotypów traktowano DEX po wykiełkowaniu i porównywano z nietraktowanymmi genotypami w teście suszy. Dzień wystąpienia śmierci w przypadku typu dzikiego liczono jako 1 DAWD (ang. days after wildtype death, dni po śmierci typu dzikiego) i przeżywalność innych genotypów liczono względem tego dnia. W pierwszych dwóch rzędach ukazany jest typ dziki z widocznymi martwymi roślinami we wszystkich próbkach, a liczbę dni dla innych genotypów, przeżywających dłużej przy każdym traktowaniu, ukazano jako 1-3 DAWD. HRD-GR po indukcji DEX wykazuje wyraźną odporność w porównaniu do traktowania -DEX, podobnie jak ukazano dla mutanta + lub traktowanie DEX. 2 Fig. 7 - Odporność na choroby mutanta hrd w porównaniu do typu dzikiego Mutanta hrd (A) porównywano z rośliną kontrolną (B), traktowaną patogenem Verticillium (oznaczenie +V) i bez traktowania Verticillium (-V). Mutant hrd nie ulegał wpływowi Verticillium, podczas gdy rośliny kontrolne wykazywały fenotyp podatności na więdnięcie.

6 PRZYKŁADY 1 [0091] Następujące nieograniczające przykłady opisują zastosowanie genów HRD do modyfikowania fenotypów roślin. O ile w przykładach nie zaznaczono, że jest inaczej, wszystkie techniki rekombinowania DNA przeprowadzono zgodnie ze standardowymi protokołami, jak opisano w Sambrook i wsp. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, wydanie drugie, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Sambrook i Russell (01) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, wydanie trzecie, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY; oraz w tomach 1 i 2 w Ausubel i wsp. (1994) Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols, USA. Standardowe materiały i metody pracy z roślinami na poziomie molekularnym opisał w Plant Molecular Biology Labfax (1993) R. D. D. Croy; praca została opublikowana wspólnie przez BIOS Scientific Publications Ltd (Wielka Brytania) i Blackwell Scientific Publications, Wielka Brytania. Przykład 1 - Materiały i metody 2 1.1 Materiał roślinny i doświadczenie oceniające tolerancję na suszę [0092] Wszystkie rośliny, w tym populację z aktywacją znacznikiem (Marsch-Martinez i wsp., 02, Plant Physiol. 129: 144-16) i linie transgeniczne, hodowano w szklarni w temperaturze około 22 C; rośliny należały do ekotypu Wassilewskija (Ws) Arabidopsis.

7 [0093] W doświadczeniach dotyczących suszy mutant hardy ze znacznikiem aktywującym porównywano z linią rd29a- DREB-lA (wykazującą tolerancję na suszę; Kasuga i wsp., 1999), obydwie w ekotypie Ws Arabidopsis. Doświadczenie przeprowadzono w szklarni w temperaturze 22 C, rośliny hodowano w mieszance glebowej składającej się z jednej części piasku i perlitu i dwóch części kompostu (mieszanina utworzona z 2% gliny i 7% torfu z EC 1 / 4 1 [azot, fosfor i potas]; Hortimea, Elst, Holandia). Nasiona wysiewano (po trzech nocach w temperaturze 4 C) przy gęstości sześciu roślin na 4-cm doniczkę na tacy z 1 doniczkami (pojemniki Aracon; BetaTech, Gent, Belgia). Składniki odżywcze (Hydroagri, Rotterdam, Holandia; 2.6 EC) dostarczano dni po wykiełkowaniu i 1 w 2 tygodnie po wykiełkowaniu rośliny poddano suszy (przez 9,, 11 lub 12 dni) poprzez przeniesienie doniczek na suche tace (po wysuszeniu każdej doniczki z zewnątrz). Co dwa dni w suszy, rośliny przesuwano w obrębie tacy, żeby wyeliminować efekt pozycji doniczki. Następnie rośliny nawodniono i obserwowano powrót do stanu początkowego po 1 tygodniu. Doświadczenia porównujące tolerancję na suszę między roślinami typu dzikiego, DREB1A i hrd powtarzano trzykrotnie w czasie sezonu zimowego i letniego, stosując, odpowiednio, 2 warunki krótkiego i długiego dnia. Dodatkowo przeprowadzono doświadczenie z suszą (z podobnymi warunkami wzrostowym, jak opisano powyżej) z zastosowaniem indukcji DEX na roślinach zawierających fuzję 3S::HRD-GR, jak opisano poniżej. [0094] Czynnik indukujący μm DEX zastosowano na trzy różne sposoby wobec różnych genotypów (3S::HRD-GR, Ws

8 i hrd) w celu indukowania różnego poziomu funkcji HRD: a) DEX stosowano od spodu doniczek na tacy, b) rozpylony od góry rośliny i c) zarówno od spodu doniczek, jak i rozpylony. DEX stosowano po pojawieniu się pierwszych dwóch liści rośliny i stosowano co drugi dzień aż do 14. dnia po wykiełkowaniu. Następnie rośliny poddawano suszy, nawadniano, jak opisano uprzednio, i obserwowano pod kątem powrotu do stanu początkowego przez 1 tydzień. 1.2 Izolacja DNA flankującego i analiza sekwencji 1 2 [009] DNA izolowano według Pereira i Aarts (1998, Transposon tagging with the En-I system, Totowa, NJ, Humana Press), z dwóch liści lub młodych pączków kwiatowych i ng genomowego DNA użyto do termicznej asymetrycznej przeplatanej reakcji PCR (TAIL PCR, ang. Thermal Asymmetric Interlaced-PCR), jak opisali Marsch- Martinez i wsp., 02, jak wyżej. Reakcję re-pcr przeprowadzano generalnie przed sekwencjonowaniem powielonych fragmentów i identyfikowaniem pozycji wstawki w genomie Arabidopsis, stosując algorytm BlastN (Altschul i wsp. 1990, J. Mol. Biol. 21:403-4). Przyrównywanie wielu sekwencji przeprowadzano, stosując CLUSTAL X (Thompson i wsp. 1991, Nucl. Acid Res. 2, 4876-4882) i DNASTAR (DNASTAR Inc. Madison, WI), natomiast programy GENEDOC (Nicholas i wsp. 1991, EMBNET News 4, 1-4) i TreeView (Page, 1996, Comp. Applic. Biosci. 12: 37-38) stosowano, odpowiednio, do edycji przyrównania i wytworzenia drzewa filogenetycznego. Analizę filogenetyczną, w tym

9 bootstrapping, przeprowadzono w sposób opisany przez Lucker i wsp. (02, Eur. J. Biochem. 269, 3160-3171). 1 1.3 Wytwarzanie konstruktów do transformacji roślin i transgenicznego Arabidopsis [0096] Fragmenty kodujące geny albo sekwencje regulacyjne będące przedmiotem zainteresowania powielano przy zastosowaniu polimerazy DNA pfu z genomowego DNA. W tych przypadkach do fragmentów dodawano ogony A i wprowadzano do wektora pgem-t Easy według opisu producenta (Promega), a następnie sekwencjonowano z obydwu stron przed trawieniem i ligacją do wektora binarnego. Reakcję PCR, trawienia restrykcyjne, izolację plazmidowego DNA i elektroforezę w żelu przeprowadzono przy zastosowaniu standardowych protokołów. [0097] Fragmenty obejmujące regiony kodujące pełnej długości powielono (przy zastosowaniu polimerazy DNA pfu) z genomowego DNA (dla HRD, At2g3640) w celu uzyskania konstruktów z nadekspresją. Genomowy DNA użyty do amplifikacji należał do ekotypu Columbia Arabidopsis, z zastosowaniem starterów HRDF i HRDR. 2 [0098] Oligonukleotydy: HRDf ('- CGGATCCATGCAAGGAACCTCCAAAGAC - 3') SEK ID NR: 6 HRDr ('- CGTCGACGGTTTGTTTAACTATCATGG - 3') SEK ID NR: 7 [0099] Para oligonukleotydów wprowadzała miejsca restrykcyjne BamHI i SalI do powielanych fragmentów na

60 1 2 ich końcach, odpowiednio, ' i 3', które zastosowano do ligacji fragmentów regionu kodującego o wielkości bp (ang. base pairs - par zasad), w miejscach BamHI i SalI wektora binarnego pnew1 (zmodyfikowany wektor binarny pbi121, Nayelli Marsch-Martinez i Andy Pereira, nieopublikowane) między promotorem 3S wirusa mozaiki kalafiora (CaMV) a terminatorem syntazy nopaliny (NOS). Otrzymany w rezultacie konstrukt powodował nadekspresję czynnika transkrypcyjnego At2g3640 AP2 pod kontrolą promotora 3S. [00] W celu wytworzenia konstruktów promotor::gus, fragment powyżej kodonu ATG każdego genu (1 kb z HRD) powielono z genomowego DNA (ekotypu Columbia) przy zastosowaniu polimerazy DNA Taq i oligonukleotydów, które wprowadzały miejsca restrykcyjne XbaI i NcoI, odpowiednio, na końcach ' i 3'. To umożliwiło ligację fragmentów w miejscach XbaI i NcoI zmodyfikowanego wektora pbinplus (van Engelen i wsp., 199, Trans. Res. 4, 288-290) powyżej genu reporterowego β-glukuronidazy (GUS). [01] W celu wytworzenia konstruktów 3S::HRD-GR, fragment obejmujący region kodujący HRD pełnej długości powielono (przy zastosowaniu polimerazy DNA pfu) z genomowego DNA z młodych liści ekotypu Columbia Arabidopsis, stosując oligonukleotydy RP6 i RP6 w celu powielenia fragmentu o wielkości 0, kb, zawierającego region kodujący HRD pełnej długości. RP6 '- TTATTTCTAGAATGCAAGGAACCTCCAAAGAC - 3' SEK ID NR: 8

61 RP7 '- TTATTAGATCTTGGAAAATTCCACAAGTAATCG - 3' SEK ID NR: 9 1 2 [02] Para oligonukleotydów wprowadziła miejsca restrykcyjne XbaI i BglII do powielonych fragmentów na ich końcach, odpowiednio, ' i 3', które użyto do ligacji. Konstrukt 3S::HRD-GR złożono poprzez wielopunktowe ligacje, w których poszczególne fragmenty (promotor, gen HRD, fragment GR, terminator) z odpowiednimi kompatybilnymi lepkimi końcami poddawano razem ligacji w wektorze binarnym w jednej reakcji. Fragment promotorowy CaMV3S rozciągający się od -26 do miejsca startu transkrypcji otrzymano jako fragment HindIII-XbaI o wielkości 0, kb z pochodnej pdh1, pbs-sk + (Pietrzak i wsp., 1986, Nucl Acid Res 14: 87-68). Fragment GR otrzymano jako fragment BglII-XhoI o wielkości 0,8 kb z pmtl23 (SEK ID NR:, kodujący domenę białkową GR SEK ID NR: 4). Fragment terminatorowy CaMV3S otrzymano jako fragment SalI- EcoRI o wielkości 0,21 kb z pochodnej pdh1, pbs-sk + (Pietrzak i wsp., 1986, jak wyżej). Konstrukt wytworzono w wektorze binarnym pmog22 (ZENECA-MOGEN, NL), który zawiera chimerowy konstrukt CaMV 3Sfosfotransferaza higromycyny-tnos do selekcji w czasie transformacji. [03] Zastosowany konstrukt rd29a-dreb1a był podobny do opisanego (Kasuga i wsp. 1999, Nat. Biotech. 17, 287-291), z tą różnicą, że fuzja genowa była wstawiona do pbin-plus (van Engelen i wsp., 199, Trans. Res. 4, 288-290).

62 [04] Konstrukty wprowadzano do roślin przy zastosowaniu metody transformacji poprzez zanurzanie kwiatów (Clough i Bent, 1998, Plant J. 16, 73-743). Nasiona wysiewano na pożywkę Murashige i Skooga o połowie mocy (1/2MS; Murashige i Skoog, 1962, Physiol. Plant. 1, 473-497) i siewki selekcjonowane na 0 mg/l kanamycyny przenoszono następnie do szklarni. 1 2 1.4 Analizy ekspresji genów [0] Izolowano całkowity RNA dla reakcji odwrotna transkryptaza-pcr (RT-PCR, ang. Reverse Transcriptase- PCR) z dojrzałych, zielonych rozetek liściowych pochodzących z 4-tygodniowych mutantów hardy z aktywacją przy zastosowaniu znacznika oraz roślin typu dzikiego (ekotypu WS) przy użyciu odczynnika Trizol, zgodnie z opisem producenta (Invitrogen, Life Technologies). Około 1 μg całkowitego RNA użyto do traktowania DNazą I i syntezy cdna (z zastosowaniem odwrotnej transkryptazy SuperScriptII), zgodnie z opisem producenta (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). cdna rozcieńczono 0 razy i użyto do amplifikacji, stosując specyficzne oligonukleotydy dla genu aktyny w celu zrównania stężenia próbek cdna. RACTP1, '- GCGGTTTTCCCCAGTGTTGTTG -3 ' SEK ID NR: RACTP2, '- TGCCTGGACCTGCTTCATCATACT -3' SEK ID NR: 11 [06] Następnie rozcieńczony cdna zastosowano do przeprowadzenia reakcji PCR, stosując specyficzne

63 oligonukleotydy zaprojektowane do powielenia dwóch genów flankujących miejsce insercji. Do powielenia genu At2g3640 zastosowano oligonukleotydy HRDf i HRDr, a do genu At2g36460 zastosowano odpowiednie startery. Warunki reakcji PCR obejmowały etap denaturacji w temperaturze 9 C przez 3 min, po którym następowało 1- min 3 cykli w temperaturze 9 C, 1-min w temperaturze C i 1,-min w temperaturze 72 C, kończących się 1 2 etapem elongacji przez min w temperaturze 72 C. W kontrolnej reakcji PCR z oligonukleotydami aktynowymi zastosowano cykli amplifikacji. 1. Barwienie GUS i mikroskopia [07] Tkanki z różnych organów, bądź roślin rosnących w ziemi, bądź siewek rosnących na 1/2MS in vitro, analizowano pod kątem wzorów ekspresji GUS. Roztwór GUS zawierał 0 mm bufor - fosforan sodowy, ph 7,0, 0, mg/ml kwas -bromo-4-chloro-3-indolilo-β-d glukuronowy (X-Gluc, Duchefa, Holandia), 0,1% Triton i po 0, mm żelazi- i żelazocyjanku. Przeprowadzono infiltrację próbek pod próżnią, inkubowano w temperaturze 37 C przez 16-24 h i pozbawiano chlorofilu w 70% etanolu. Obserwację prowadzono bądź pod binokularem (WILD M3Z firmy Wild Heerbrugg, Szwajcaria, typ-s), bądź przy użyciu mikroskopu świetlnego (Zeiss), a do robienia zdjęć cyfrowych zastosowano aparat RS Photometries CoolSNAP (MediaCybernetics(R)), z odpowiednim oprogramowaniem CoolSNAP. [08] Do skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM, ang. Scanning Electron Microscopy) próbki przytwierdzono do uchwytu na próbki przy zastosowaniu przewodzącego kleju węglowego (Leit- C, Neubauer

64 1 Chemikalien, Niemcy), a następnie zamrożono w ciekłym azocie. Próbki przeniesiono pod próżnią do przeznaczonej dla nich kamer do sporządzania kriopreparatów (Oxford cryo-system, CT 100 HF, Eynsham, Wielka Brytania) z próbki trzymanej w temperaturze -90 C. Krio-rozłamania sporządzano w temp. około - 10 C przy zastosowaniu zimnego (-196 C) ostrza skalpela. Próbki rozłamań suszono w stanie zamrożonym przez 3 min w temperaturze -90 C pod próżnią (3x -7 Pa) w celu usunięcia zanieczyszczenia parą wodną. Po pokryciu powierzchni próbki poprzez napylanie katodowe nm platyny, przenoszono ją na zimny stolik na próbki (-190 C) wewnątrz Cryo-FESEM (JEOL 60F Field Emission SEM, Tokio, Japonia), a następnie analizowano przy zastosowaniu napięcia przyspieszającego kv. Obrazy zapisywano cyfrowo (Orion, Belgia). 1.6 Analiza mikromacierzy 2 [09] Całkowity RNA izolowano przy użyciu odczynnika TRIZOL (Life Technologies, Inc.), stosując dwie-cztery rozety liściowe Arabidopsis zgodnie z instrukcjami producenta i oczyszczono, stosując zestaw RNeasy Minelute Kit (Qiagen, Carlsbad, CA, USA). Amplifikację RNA przeprowadzono, stosując zestaw Amino Allyl MessageAmp Kit (Ambion, Austin, TX, USA). Pokrótce, przeprowadzono syntezę pierwszej nici cdna poprzez odwrotną transkrypcję, stosując 3 μg całkowitego RNA i 1 μl startera T7 Oligo(dT). Zsyntetyzowano pełnej długości dsdna przy użyciu mieszaniny reakcyjnej zawierającej 1x bufor do drugiej nici, 4 μl mieszaniny

6 dntp, 2 μl polimerazy DNA, 1 μl RNazy H, a następnie poprzez inkubację przez 2 h w temperaturze 16 C. Oczyszczono DNA poprzez nałożenie na zrównoważoną kasetę z filtrem. Oczyszczony cdna zatężono i objętość doprowadzono do 14 μl. Amplifikację antysensownego RNA przez T7 in vitro przeprowadzono w roztworze zawierającym 12 μl mieszaniny ATP, CTP, GTP (2 mm), 3 μl roztworu aautp (0 mm), 3 μl roztworu UTP (0 mm), 4 μl buforu do reakcji x, 4 μl mieszaniny enzymu T7 w 1 2 temperaturze 37 C przez 8 h. Następnie powielony arna oczyszczono poprzez nałożenie na zrównoważoną kasetę z filtrem. [01] Do hybrydyzacji użyliśmy zestawu nakropionych długich oligonukleotydów Operon z University of Arizona, zawierających 29 000 genów Arabidopsis (http://www.operon.com/arrays/omad.php). Próbki arna łączono z monoreaktywnymi estrami NHS Cy3 lub Cy (Amersham Biosciences) przez 2 h. Po wygaszeniu i oczyszczaniu barwnika próbki docelowe mieszano z 80 μl roztworu hybrydyzacyjnego, zawierającego 2xSSC, 0,06x płynnego odczynnika blokującego (Liquid Blocking Reagent, Amersham Biosciences) i 0,04% SDS. Po ogrzaniu do temperatury 9 C przez 2 min, a następnie schłodzeniu w lodzie, mieszaninę nakładano do szpary między szkiełkami a szkiełkiem nakrywkowym (LifterSlip, Erie Scientific). Szkiełka inkubowano w komorze hybrydyzacyjnej przez 9 h w temperaturze 6 C w piecu. Szkiełka przemywano w RT przez min w roztworach, kolejno, 2xSSC z 0,% SDS, 0,xSSC i 0,0xSSC, a

66 1 2 następnie suszono poprzez wirowanie przez min przy 00 obr./min. [0111] Szkiełka po hybrydyzacji skanowano przy zastosowaniu skanera ScanArray Express HT (Perkin Elmer), który daje obrazy Tiff w kanałach zarówno Cy3, jak i Cy. Napięcie ScanArray PMT nastawiono od 42 do 0 V, zależnie od pierwszych oznak wysyconego sygnału. Skanowane obrazy analizowano przy zastosowaniu oprogramowania ScanArray Express (Perkin Elmer). Do oceny ilościowej zastosowano metodę kół adaptacyjnych, a do normalizacji danych zastosowano metodę LOWESS. Do pomiarów jakości wybrano metodę sygnał do tła, stosując parametry domyślne (granica dolna 400, mnożnik 1,70) i wyniki zastosowano do sprawdzenia wydajności doświadczeń. [0112] Do dalszej analizy pobrano dane do arkuszy Excel i wybrano wartości ekspresji genów z kanału 1 lub kanału 2 (Cy3 lub Cy), które wykazywały więcej niż 2x wartości tła dla mediany intensywności. Dodatkowo dokonaliśmy filtrowania genów o znaczącej regulacji, które wykazywały stosunek median, który wynosił więcej niż 1, lub mniej niż 0,66 (wartości Log 2 +/- 0,8). Te listy ekspresji genów dostarczyły nam długą listę potencjalnie regulowanych genów, których użyto następnie do innych porównań między traktowaniami doświadczalnymi. W analizie konkretnych traktowań (np. suszy) geny z wartościami ekspresji w co najmniej jednym powtórzeniu większymi niż 2 razy (wartości log 2 +/-1) były brane do porównania z innymi traktowaniami. Przykład 2 Identyfikacja mutanta hardy i charakterystycznego fenotypu

67 1 2 [0113] Poprzez przeszukanie zbioru 00 linii Arabidopsis z aktywacją znacznikiem transpozonowym (Marsch-Martinez i wsp., 02) zidentyfikowano zmutowaną roślinę o powolnym wzroście i ciemnozielonych liściach. Zarówno liście rozetowe, jak i łodygowe mutanta (nazwanego hardy, hrd) były grubsze w porównaniu do roślin typu dzikiego. Mutant później kwitł i miał zmniejszoną ilość nasion. Najbardziej uderzającym fenotypem było to, że trudno było wyciągnąć dojrzałą roślinę z ziemi, prawdopodobnie na skutek silnej struktury korzeniowej. Rośliny, jak się wydawało, wykazywały dużą tolerancję na zmiany w warunkach szklarniowych, otrzymały zatem nazwę hardy (ang. wytrzymały ). Analiza potomstwa samozapylonej linii mutanta hrd sugerowała mutację dominującą (trzy czwarte roślin wykazywało fenotyp hrd). [0114] Segregujące zmutowane rośliny wykazywały różnice we wzorze wzrostu i rozmiarach w zakresie od roślin o wyglądzie średnim do roślin bardzo małych. Rośliny o wyglądzie średnim wystrzelały w górę w tym samym czasie co typ dziki, co wskazuje brak wpływu na czas kwitnienia u tych roślin, natomiast w mniejszych roślinach wystrzelanie rozpoczynało się prawie -6 dni później w porównaniu do typu dzikiego, co wskazuje, że czas kwitnienia mniejszych roślin był późniejszy. Pączki otwierały się jednak znacznie później u mutanta w porównaniu z jego typem dzikim. U średnich roślin hrd łodyga główna wydłużała się do -6 cm wysokości i miała większą liczbę łodyg bocznych o prawie takiej samej wysokości, co łodyga główna. W łodygach zmniejszona była długość międzywęźla. Rośliny wyglądały na bardziej

68 1 2 rozkrzewione i zwarte. Mniejsze rośliny hrd (Fig. 1A) miały bardzo krótkie łodygi główne i boczne, które nie wydłużały z powodu silnego zmniejszenia długości międzywęźla. Rośliny hrd zarówno o średnim, jak i o małym rozmiarze, wytwarzały bardzo dużo kwiatów w porównaniu z typem dzikim, ale miały bardzo mało nasion. [011] Strukturę liści analizowano poprzez analizę SEM krio-rozłamań dla struktury liścia, jak opisano w przykładzie 1,; wykazano, że liść jest znacznie grubszy, z dodatkową warstwą palisadową w porównaniu z typem dzikim (Fig. 1B). Ta dodatkowa warstwa prawdopodobnie nadaje liściowi fenotyp ciemnej zieleni na skutek wyższej gęstości chlorofilu wynikającej z mniejszych komórek i większej liczby warstw. [0116] Fenotyp korzeni badano poprzez hodowanie roślin hrd w piasku ze składnikami odżywczymi i odmycie piasku w celu uwidocznienia struktury korzenia. Strukturę korzenia analizowano poprzez liczenie i mierzenie: liczby i długości korzeni pierwszorzędowych, drugorzędowych i trzeciorzędowych (tabela 1). Najbardziej wyróżnialną cechą mutanta hrd było rozgałęzienie korzeni na korzenie drugorzędowe i trzeciorzędowe (tabela 1), bardzo blisko łodygi albo podstawy korzenia, tuż poniżej ziemi (Fig. 2), co dawało dłuższe drugorzędowe i trzeciorzędowe korzenie przy podstawie korzenia w porównaniu z typem dzikim, skutkując bardziej złożoną strukturą korzeniową, podobną do włóknistej struktury korzeni u roślin jednoliściennych. Te korzenie mają zatem większą powierzchnię do trzymania się przy podstawie, co

69 1 zwiększa zdolność kotwiczenia się w ziemi i powoduje, że rośliny są odporne na wyciąganie. Ten fenotyp zwiększonego rozgałęzienia blisko podstawy korzenia jest cechą, która przyczynia się do silniejszego fenotypu korzeni u mutanta hrd. Mutant hrd wymaga większej siły ciągnącej, co określa się poprzez zastosowanie siły ciągnącej wobec mutanta hrd i roślin typu dzikiego w wieku około 4 tygodni. Mutant hrd wymaga -0% więcej siły do wyciagnięcia z ziemi w porównaniu z typem dzikim. Wykazano, że siła ciągnięcia korzeni jest związana z cechą rozkładania się korzeni, ważnej cechy u zbóż i drzew, która umożliwia roślinie stanie prosto i opieranie się wyleganiu (Bruce i wsp., 01, J Exp Biol 2: 49-68; Bailey i wsp. 02, J Exp Biol 3: 333-340). Tabela 1: Pomiary korzeni 1 cm od podstawy korzenia u roślin w wieku 3 tygodni Linia roślin y N=4 Korzenie pierwszorzędow e (liczba Korzenie drugorzędow e (liczba Korzenie trzeciorzędow e (liczba Długość podstawy korzeniowe j (cm) ±SD korzeni ± SD) korzeni ± SD korzeni ± SD ± SD) WT hrd 1 ± 0,00 1 ± 0,00 1,0 ± 0,8 4,2 ± 0,0 0,00 ± 0,00 9,2 ± 1,26 0, ± 0,06 0,28 ± 0,0 Przykład 3 Czynnik transkrypcyjny AP2/ERF jest odpowiedzialny za fenotyp mutanta hrd [0117] Analiza DNA metodą Southern wykazała, że hrd zawiera pojedynczą insercję (dane nieukazane). Izolacja i analiza sekwencji DNA flankującego miejsce insercji

70 1 2 dalej wykazała, że insercja znajduje się w międzygenowym regionie na chromosomie 1 (Fig. 3A). Tetrametr wzmacniacza 3S jest położony między genem kodującym nieznane białko (402 par zasad powyżej promotora) a genem kodującym przedstawiciela specyficznej dla roślin rodziny czynników transkrypcyjnych AP2/ERF (6 par zasad powyżej promotora). W celu zbadania, czy te dwa geny były indukowane przy ekspresji hrd w porównaniu z typem dzikim, przeprowadziliśmy doświadczenie z odwrotną transkrypcją i reakcję PCT (RT-PCR), stosując cdna izolowany z tkanek liściowych hrd i typu dzikiego (Fig. 3B). Wyniki wykazały, że jedynie gen AP2/ERF, AT2g3640, w odległości 6 kb od tetrametra wzmacniacza 3S, był indukowany w liściach mutanta hrd w porównaniu z typem dzikim i to on najprawdopodobniej jest odpowiedzialny za fenotyp. [0118] Do roślinnej nadrodziny czynników transkrypcyjnych AP2/ERF należy u Arabidopsis 141 przedstawicieli (Alonso i wsp., 03, Science 1, 63-67), a białko HRD zawiera domenę AP2/ERF (Fig. 3C). Badanie homologii sekwencji i analiza filogenetyczna wśród całej rodziny AP2/ERF wykazała, że HRD jest podobny do kilku białek ryżu (dane nieukazane). Białka ryżu i Arabidopsis zawierają domenę AP2, jak również podobne reszty aminokwasowe na końcu C. Przykład 4 Rośliny transgeniczne z nadekspresją HRD [0119] Za fenotyp mutanta hrd z największym prawdopodobieństwem odpowiedzialny był leżący poniżej

71 1 gen (At2g3640), kodujący czynnik transkrypcyjny AP2/ERF. Sklonowano zatem region kodujący genu (nazwanego HRD) i poddano go konstytutywnej ekspresji w Arabidopsis pod kontrolą promotora 3S CaMV. Wszystkie uzyskane rośliny transgeniczne ( osobników) wykazywały fenotyp podobny do wyjściowej linii z aktywującym znacznikiem, a konkretnie ciemnozielone liście i mniejszy pokrój rośliny (dane nieukazane). Fenotyp większości linii 3S::HRD (zarówno transformantów pierwotnych, jak i następnych pokoleń) był silniejszy w porównaniu do wyjściowego mutanta hrd. W większości przypadków rośliny były mniejsze, a w niektórych przypadkach nawet karłowate (3- cm wielkości po osiągnięciu dojrzałości) (dane nieukazane). [01] Ten sam konstrukt transformowano do tytoniu i zaobserwowano fenotyp mniejszej rośliny z ciemnozielonymi liśćmi, co wykazuje, że fenotyp może być nadawany roślinom heterologicznym. Przykład Nadekspresja genu HRD w ryżu [0121] Wytworzono konstrukt do transformacji ryżu, zawierający region kodujący HRD pod kontrolą promotora 2 CaMV3S, w binarnym wektorze pmog22. Transformanty otrzymano w odmianie hodowlanej ryżu Nipponbare, stosując opracowany system z użyciem Agrobacterium. Kalusy i zregenerowane pędy selekcjonowano pod kątem oporności na higromycynę w stężeniu 2 mg/l. [0122] Po ukorzenieniu transformanty przeniesiono do szklarni i wykonano wstępną analizę fenotypową.

72 Następnie potomstwo z krzyżówki wsobnej zastosowano w szczegółowych testach fenotypowych i tolerancji na stres. Linie ryżu transformowane konstruktem z nadekspresją wykazywały obecność systemu korzeniowego, który był dłuższy z większą liczbą rozgałęzień bocznych niż typ dziki. Są to cechy, które okazały się przydatne w nadaniu ryżowi i innym zbożom większej odporności na suszę (Li i wsp., 0, TAG 1: 1244-2; Bruce i wsp. 01, jak wyżej). Przykład 6 Indukcja ekspresji HRD przy użyciu fuzji genowej z glukokortykoidem 1 2 [0123] W celu indukcji ekspresji genu HRD w różnych tkankach i stadiach rozwojowych, wytworzyliśmy linie transgeniczne, w których ekspresji ulega fuzja białka HRD i domena wiążąca hormon szczurzego receptora glikokortykoidu (GR; pod kontrolą promotora CaMV3S) (Chang i wsp., 1987, Nuc Acids Res, 22: 9603). Nasiona pierwotnych transformantów 3S::HRD-GR (T1) wysiewano na talerzach zawierających pożywkę z μm hormonu - deksametazonu (DEX) lub bez dodatku tego hormonu. Rośliny zasiane w pożywce uzupełnionej DEX wykazywały wyraźny fenotyp, obserwowany w mutancie hrd, z krótszymi siewkami z ciemnozielonymi liśćmi (Fig 4). [0124] W celu poznania mechanizmu ekspresji HRD nadającej różne fenotypy przeprowadzono doświadczenia z indukowaniem fuzji HRD-GR, stosując indukcję deksametazonem (DEX) w różnych stadiach wzrostu i częściach roślin. Siewki i w pełni wyrosłe rośliny zawierające transgen 3S::HRD-GR wykazywały fenotyp

73 1 2 typu dzikiego i brak fenotypu takiego, jak mutanty hrd (Fig 4). Siewki hodowane w szklarni lub komorze hodowlanej traktowano DEX w różnych punktach czasowych po wykiełkowaniu (1 tydzień, dni po wykiełkowaniu) albo od spodu przez irygację, albo przez rozpylenie od góry, albo zarówno przez rozpylenie, jak i przez irygację. Wczesne traktowanie i traktowane przez rozpylenie i irygację dawało rośliny z silniejszym fenotypem, śledzonym na poziomie liści. Indukcja była najsilniejsza przy zastosowaniu μm DEX: obserwowano wtedy fenotyp podobny do wyjściowego mutanta hrd. Różny indukowany DEX poziom 3S:: HRD-GR w transgenicznych liniach przy testowaniu pod kątem fenotypu indukcji stresu przedstawiono poniżej. [012] Rośliny 3S::HRD-GR, traktowane μm DEX od spodu przez irygację, dawały łagodny fenotyp hrd i były większe niż wyjściowy mutant hrd. Te rośliny wykazywały lekko podwinięte do dołu, ciemnozielone liście rozetowe z wydłużonymi łodygami, przy normalnie wyglądających liściach łodygowych i normalnym czasie kwitnienia (Fig. 4). Nie obserwowano żadnego istotnego wpływu na rozmiar liści rozetowych. Rośliny 3S::HRD-GR traktowane od góry przez rozpylenie DEX dawały podobny fenotyp co hrd, z mniejszą rozetą, lekko podwiniętą o ciemnozielonym kolorze. Jednakże główna łodyga wydłużała się normalnie do wysokości 7-8 cm, a czas kwitnienia mieścił się w zakresie od normalnego do późnego u niektórych roślin. Kiedy rośliny 3S:: HRD-GR traktowano DEX zarówno od spodu (irygacja), jak i od góry przez rozpylenie, wykazywały one bardzo silny

74 fenotyp mutanta hrd, z bardzo małymi mocno podwiniętymi ciemnozielonymi liśćmi rozetowymi i późnym kwitnieniem. Przykład 7 Przestrzenna i czasowa ekspresja genu HRD 1 [0126] W celu zbadania ekspresji genu HRD wytworzono konstrukt do transformacji roślin, który połączył sekwencje DNA o wielkości 1,0 kb powyżej (jak ukazano w SEK ID NR: 2) przewidywanego kodonu ATG genu z genem reporterowym - β-glukuronidazą (GUS). W transformantach Arabidopsis ekspresję GUS wykrywano w nasionach i zarodku. To odpowiada publicznie dostępnym danym z mikromacierzy dotyczącym ekspresji genu HRD i sugeruje, że gen działa normalnie w czasie rozwoju nasion, nadając tolerancję na stres w czasie dojrzewania nasion. Przykład 8 Rośliny z nadekspresją wykazują tolerancję na suszę 2 [0127] W celu zbadania, do jakiego stopnia zmiana w powierzchni rośliny w wyniku nadekspresji HRD wpływa na jej zdolność tolerowania suszy, 1-dniowe siewki wyjściowej linii hrd z aktywacją poprzez znacznik, odporną kontrolę 29A-DREB1A i typ dziki (ekotyp Wassilewskija) eksponowano na okres 9-12 dni odwodnienia (Fig. ). Następnie siewki nawodniono i obserwowano powrót do stanu początkowego przez tydzień. Podczas gdy rośliby typu dzikiego nie powracały do stanu początkowego po odwodnieniu dłuższym niż 9 dni i całkowicie wyschły, wszystkie siewki pochodzące z linii

7 1 2 z ekspresją genu HRD powracały do stanu początkowego i stawały się bardziej zielone i mocniejsze. [0128] Transformantów HRD-GR, które wykazywały związany z hardy fenotyp ciemnozielonych liści, użyto w doświadczeniach ze stresem suszy. Genotypy WT (typu dzikiego), mutanta hrd i 3S::HRD-GR poddano kiełkowaniu i bądź traktowano, bądź nie traktowano DEX. Traktowanie DEX przeprowadzono od spodu przez irygację, przez rozpylenie od góry albo zarówno przez rozpylenie, jak i przez irygację. Po 2 tygodniach wzrostu we wszystkich grupach traktowania, u wszystkich genotypów odstawiano wodę na okres 9-1 dni. Rośliny ponownie nawadniano każdego dnia, aby móc zbadać powrót do stanu początkowego. Zanotowano dzień obumarcia w przypadku typu dzikiego (WT) dla każdego traktowania i przeżywalność innych genotypów i traktowań odnoszono do tej daty. Zanotowane dni po śmierci typu dzikiego (DAWD) są takie, jak ukazano w tabeli 2. Na Fig. 6 przedstawiono wyniki tego doświadczenia. HRD-GR indukowany DEX wykazuje fenotyp tolerancji na suszę równoważny z mutantem hrd. Porównanie doświadczeń, traktowania DEX od spodu (irygacja do korzeni), rozpylenia od góry (liście) i traktowania zarówno od spodu, jak i od góry, wykazało, że kombinacja traktowań dawała najsilniejszy fenotyp tolerancji na suszę, co widać w przypadku fenotypu liści. Tabela 2 Linia 1 DAWD 2 DAWD 3 DAWD rośliny WT + Dex 0,00 0,00 0,00

76 WT - Dex 0,00 0,00 0,00 Hrd + Dex 93,33 92,31 96, hrd - Dex 93, 96,43 83,33 HRD-GR + Dex 83,33 7,00 71,43 HRD-GR - Dex 0,00 0,00 0,00 [0129] Podobnie, nadekspresja HRD w ryżu również prowadzi do zwiększonej tolerancji na suszę. Transformanty z konstruktem 3S::HRD są zdolne do przetrzymania długotrwałego więdnięcia liści przy niedoborze wody w porównaniu z roślinami kontrolnymi, co zbadano poprzez powrót do stanu początkowego po ponownym nawodnieniu. Przykład 9 Rośliny z nadekspresją HRD wykazują zwiększoną tolerancję na choroby 1 2 [01] W celu przetestowania pod kątem odporności na stres biotyczny linii z nadekspresją HRD, przeprowadzono badanie pod kątem odporności na Verticilllum dahliae, jako przykład odporności nieswoistej wobec gospodarza. Siewki hodowano w komorze hodowlanej w temperaturze 22-24 C z 12 godzinami światła w doniczkach o średnicy cm, zawierających mieszaninę kompost: piasek: perlit (2:1:1). Dwa tygodnie po wykiełkowaniu siewki łagodnie wyciągnięto korzeniami do góry i zamoczono krótko w nasyconej zawiesinie hodowli Verticillium, następnie umieszczono z powrotem w doniczkach z ziemią zakrywającą korzenie. Rośliny podlewano normalnie po kilku dniach przerwy i badano na różnych stadiach pod kątem objawów choroby.

77 1 Rośliny badano w powtórzonych doniczkach na genotyp i jako wyniki przy badaniu choroby przyjmowano częstość roślin, które przeżyły jako dojrzałe. Ekotyp typu dzikiego Ws nie wykazywał żadnej przeżywalności w tym teście, natomiast genotypy będące potencjalnie oporne wykazywały przeżywalność w zakresie -0%. [0131] W powtórzonym doświadczeniu z Verticillium, mutant hrd wykazujący wysoki poziom odporności nie wykazywał żadnego z objawów więdnięcia, widocznych w kontroli podatnych roślin typu dzikiego (Fi. 7). W celu potwierdzenia efektu genu HRD, testy odporności powtórzono w powtórzeniach linii z nadekspresją. W stanie dojrzałym nie były widoczne żadne objawy więdnięcia ani dowody obecności patogenu, co sugeruje fenotyp całkowitej oporności. Przykład Analiza mikromacierzy mutanta hrd wykazuje obecność genów odpowiedzialnych za fenotyp 2 [0132] Aby zrozumieć mechanizm połączonych odpowiedzi na stres abiotyczny i biotyczny, przeprowadzono doświadczenia z zastosowaniem mikromacierzy dla mutanta hrd z nadekspresją. W naszych badaniach nad poszukiwaniem genotypów Arabidopsis z tolerancją na suszę, typ dziki ekotyp Wassilewskija (WS) - wykazywał śmierć po dziewięciu dniach odstawienia wody, natomiast linie z nadekspresją rd29a::dreb1a i hrd przeżywały 12 dni odstawienia wody. Celem ujednolicenia testowanego materiału, zastosowaliśmy 8 dni odstawienia wody dla typu dzikiego Ws i zbieraliśmy próbki liści do izolacji RNA, i w tym samym czasie pobieraliśmy próbki

78 1 2 liści z kontroli typu dzikiego Ws, rd29a::drebla i hrd, które były regularnie podlewane. Do każdego porównania (kontrola typu dzikiego w porównaniu z linią z nadekspresją) użyliśmy, odpowiednio, dwóch powtórzeń biologicznych. arna z kontroli typu dzikiego były znakowane Cy3, a arna dla typu dzikiego z suszą lub linii z nadekspresją były znakowane Cy w obydwu powtórzeniach biologicznych. Kilka powtórzeń wykonano również dla doświadczeń z samym barwnikiem, jako kontrolę techniczną. Doświadczenia przeprowadzono w sposób opisany w przykładzie 1.6. [0133] W mutancie hrd doświadczenia z mikromacierzami wykazały 142 genów indukowanych i 11 reprymowanych, z uwzględnieniem genów o stałej ekspresji w obydwu powtórzeniach. W tabeli 3 poniżej przedstawiono selekcję regulonu HRD (zestaw genów podlegających wspólnej regulacji) z genami indukowanymi/reprymowanymi więcej niż dwukrotnie w porównaniu z typem dzikim. Geny indukowane przedstawiono w kolorze czerwonym (lub mocno zacienione), a geny reprymowane w kolorze zielonym (lekko zacienione). [0134] Wzór ekspresji HRD jest częściowo podobny do wzoru dla DREB1A, co sugeruje regulację genów, które nadają fenotyp tolerancji na stres. Jednakże duża liczba genów jest swoiście regulowana w rozwoju w liniach z nadekspresją i HRD, i DREB1A, jak ukazano w odniesieniu do genów indukowanych w tabeli 3. Genami specyficznie indukowanymi w regulonie HRD jest zestaw 4 TF, białka sygnalizacji Ca2+, jak również geny metabolizmu trehalozy i galaktynolu. Przykładem genów związanych ze stresem biotycznym są indukowane geny

79 defensyny PDF2, w odniesieniu do których wykazano, że są indukowane przez odpowiedzi na patogen w szlaku jasmonianu, i geny związane z represją patogenezy, PR- i Bet v1. Różnica w HRD i DREB1A w tych genach ze zmienionym wzorem ekspresji sugeruje odmienny mechanizm działania albo funkcję tych dwóch genów AP2/ERF. Te wyniki i publicznie dostępne dane dotyczące mikromacierzy wskazują, że gen HRD reguluje różne zestawy leżących poniżej genów niż opisane wcześniej dla innych czynników transkrypcyjnych AP2/ERF. Odmienny zestaw i wzór regulowanych genów nadaje specyficzny fenotyp mutanta hrd i linii z nadekspresją HRD. 1 Tabela 3: Geny z ekspresją zwiększoną przez nadekspresję HRD w porównaniu z DREB1A i Drought HARDY DREB1A DROUGHT Nazwa Opis 129 1 193 19 127 128 At2g4240 Regulowane zimnem 2,62 2,24 4,31,83 1,4 2,09 białko corla LEA Atg07 Białko odpowiadające 2,8 2,18 4,01 6, 1,3 2,3 na ABA (HVA22e) Atg4310 Białko ulegające 2,48 1,0 1,72 1,2 2,02 1,93 ekspresji Atg23 Białko odpowiadające 2,32 2,1 3,48,48 2,42 2,87 na wysychanie 29A (RD29A) /LTI78 Atg1970 Białko odpowiadające 2,2 2,8 1,08 3,82 2,06 2,2 na stres-kin2/cor6.6 At2g38 LTP2: niespecyficzne 2,14 1,97 3,82,47 0,94 0,87 transferowe białko 2 dla lipidów At3glS2 Czynnik 4 wiążący 1,81 1,6 1,38 0,72 1,26 1,2 element odpowiedzi na etylen (ERF4) At1g78070 Rodzina białek z 1,78 1,12 2,9 3,46 1,06 1,19 powtórzeniem WD-40 At1g440 Dehydryna (indukowane zimnem białko COR47) 1,74 1,7 4,19,7 1,4 1,49 At1g40 Dehydryna ERD (białko indukowane niską temperaturą LTI4) 1,6 1,47 3,2 4,17 0,99 1,39

80 HARDY DREB1A DROUGHT Atg070 At4g60 At3g4740 At4gl2470 At2g2460 Atg07000 At4g12480 At1g360 At1g332 At1g04240 At3gl6400 At1g44 At2g0 Podobne do sulfotransferazy steroidu 3 Białko odpowiadające na niską temperaturę i sól LTI6A Chitynaza temperaturowa, podobna do zasadowej endochitynazy CHB4 Inhibitor proteazy inhibitor/białko spichrzowe w nasieniu /transferu lipidów (LTP) Lipaza/hydrolaza z motywem GDSL, podobne do lipazy rodziny II, EXL3 Podobne do sulfotransferazy steroidu 3 Białko z rodziny białek transferowych dla lipidów (LTP) pearli 1 Białko wcześnie odpowiadające na stres odwodnienia (ERD4) Białko ulegające ekspresji Białko indukowane kwasem indolooctowym 3 (IAA3) Podobne do białka wiążącego myrozynazę, motyw Kelch Białko z rodziny dehydryny Fuzja białkowa roślinnej defensyny (PDF2.2) At3g0940 Białko z rodziny liazy pektanowej Atg08260 Białko z rodziny karboksypeptydazy serynowej Sl0 4,6 4,71 2,1 2,01-0,14 0 3,91 4,34 3,11 6,7-0,29 0,27 3,9 2,7 1,69 0,6 0,1 0,63 3,44 1,29 2,71 4,6 0,06-0,67 3,43 3,7 7 7,39-0,1 0,23 3,23 4,1 0,9 1,2-0,37 0,49 3,1 1,14,66,7 1,16-1,8 2,76 2,27 2,77 3,63-0,36-0,48 2,3 2,02 3,03 4,76 0,38 0,27 2,1 2,12 2,6 2,2-0,44-0,62 2,47 2,11 2,38 2,28 0,13 1,12 2,47 1,41 1,78 2,96 0,18 0,12 2,34 4 3,7 3,86-1,11-0,29 2,34 2, 1,74 1,87-0,7-0,49 1,97 2,0 0,99 1,17-0,4-0,12 At3g3990 Uniwersalne białko stresowe (USP, ang. Universal stress protein) 1,94 1,31 3,66 3,72-0,02-0,08

81 HARDY DREB1A DROUGHT At3g0880 Białko hydrofobowe RCI2A/LTI6A 1,87 1,4 2,84 4,04 0,0 0,86 Atg070 Białko z rodziny proteazy aspartylowej 1,6 2,1 1,13 2,07-0,33-0,19 At1g0870 Białko z rodziny 1,63 1,44 4,21 4,36 0,67 0,44 tioredoksyny At1g247 Białko ulegające 1,1 1,19 1,89 1,4 0, 0, ekspresji At2g280 Czynnik 1,3 1 1,63 0,76-0,09-0,06 transkrypcyjny zawierający domenę AP2 RAP2.7 At2g2680 Rodzina 1,28 1,7 1,77 2,06 0,19-0,1 specyficznego dla roślin czynnika transkrypcyjnego - YABBY At4g242 Białko ulegające 1,2 1,2 2,03 2,2 0,7 0,4 ekspresji, indukowane po zranieniu Atg860 Białko zawierające 1,2 1 0,88 0,8 0,2-0,04 domenę CBS At1g270 Białko ulegające 4,86,09,79,3-0,63-2,36 ekspresji At2g21660 Bogate w glicynę 1,17 1,82 2,79 2,3-1,82-1,86 białko wiążące RNA (GRP7) At4gl91 Białko wcześnie 1,16 1,37 0,7 1,03-1,82-1,01 odpowiadające na stres odwodnienia (ERD3) Atg01600 Ferrytyna 1 (ferl) 3,42 1,04 1,6-0,3 1,31 2,8 Atg226 Białko z rodziny 2,4 3,9 0,37 0 1,9 1,6 dehydratazy prefenianu At2g41180 Spokrewnione z 1,7 1,01 1,18 0,7 0,66 0,96 białkiem wiążącym Ig-A At2g46690 Podobne do białka 1,6 1,17 0,22-0,6 0,73 0,72 indukowanego kwasem indolo-3-octowym ARG7 Atg41400 Białko z rodziny 1,4 1,13 1,78 0,31 1, 1,36 palca cynkowego (palec RING typu C3HC4) At1g4000 Białko związane z 1,17 2,6 0 0 1,14 0,63 myrozynazą, lipazą GDSL-podobną At2g3640 Białko zawierające domenę AP2,83,72 0-0,3 0,19-0,

82 HARDY DREB1A DROUGHT At2g46970 Zasadowe białko helisa-pętla-helisa (bhlh) 2,97 3,48-0,71 3,99-0,73 0,31 At1g7840 Białko z rodziny wiążącej hem SOUL 2,76 2,6-0,99 1,01-0,42-0,78 At1g10 Beta-hydroksylaza 2,7 2,38 0 0-0,37-0,33 gibbereliny 3 (GA4) At1g60140 Białko z rodziny 2,2 1,76-0,76 1,8 0,41 0,18 fosfatazy trehalozy At3g046 Białko ulegające 2,09 1,9 1,1-0,2-0,93-0,71 ekspresji At2g021 Fuzja białkowa 1,97 2,23 0,34 2,13-0,64-0,1 roślinnej defensyny, (PDF2.3) At3gl42 Białko związane z 1,76 1,32-1,28-0,6-0,46-0,9 myrozynazą At3g0603 Białko ulegające 1,73 1,09 0,8 0,2 0,19-0,16 ekspresji (białko z kotwicą GPI) At1g21790 Białko ulegające 1,69 1,3 3,17 0 0,28 0,8 ekspresji Atg441 Białko 1,69 1,33-0,06 0,2-0,61-0,72 arabinogalaktanowe fascyklino-podobne At2g36460 Aldolaza fruktozobisfosforanowa 1,66 1,6 0,79 0,1 0,06 0,03 At4g660 Hydrofobowe białko RCI2A /LTI6A 1,9 1,16-0,37 0,89-0,26-0,4 At4g33490 Białko - nucelina 1, 1,83-1,13 2,47-0,1-0,61 At2g270 Kalmodulina-2/3/ 1,41 1,48 2,19-0,3-0,44-0,44 (CAM) (TCH1) At3g0970 Dehydryna xero2 1,39 1,14 8,89 0-1,06 2,31 (XER02) / LTI At2g03440 Podobne do wczesnego 1,39 1,12 0,23 0,7-0,19-0,08 prekursora noduliny 12B At4gl40 Podobne do wcześnie 1,38 1,73 0,77 0 0,77 0,39 odpowiadającego na stres odwodnienia ERD7 Atg067 Białko homeoboxsuwak 1,2 1,3-0,24 0,2-0,37-2,41 leucynowy 14 (HAT14)/HD-ZIP 14 Atg033 Białko ulegające 1,23 1,17-1,0-0,4 0,13-0,4 ekspresji At2g2 Białko zawierające 1,21 1,47 0,37 0,3 0,01 0,1 domenę C2 At3g60 Białko z rodziny palca cynkowego (typu GATA) 1,19 1 2,0 0 0,48 0,24 At1g0970 Fitochrom A (PHYA) 1,12 1,48-0,32 0,6 0,04-0,7

83 HARDY DREB1A DROUGHT At1g73480 Hydrolaza, podobieństwo do lipazy monoglicerydu 1,11 1,1-1,16 2,43 0,78 0,7 At2g28900 At3g6090 Atg114 At4g32280 At2g33370 At3g0740 At2g479 Podjednostka translokazy transportu mitochondrialnego do błony wewnętrznej Timl7 Podobne do prekursora podjednostki ferrytyny fasolnika chińskiego 2 Białko ulegające ekspresji Białko z rodziny odpowiadających na auksynę-aux/iaa Białko rybosomalne 60S L23 (RPL23B) Białko z rodziny UDPglukoronozylo/UDPglukozylo transferazy Glikoproteina bogata w hydroksyprolinę 2,69 2,6 0,1,71-1,1-0,93 1,8 1,09 0, -2,7-1,44-0,69 1,63 1,9 0,49 1,21-1,4-1,27 1,38 1,09 0 0-2,7-1,2 1,3 1,14 0,26 0,68-1,19-1,4 1,17 1,4 1,88 0-1, -1,74 1,11 1,34 0,23 0,77-0,97-1,91

84 LISTA SEKWENCJI [013] <1> Plant Research International B.V. <1> Transgeniczna roślina mająca zwiększoną tolerancję na suszę <1> PCTP176621 <140> <141> <160> 11 1 <170> PatentIn Ver. 2.1 <2> 1 <211> <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <400> 1 2 <2> 2 <211> 00 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <400> 2 3

8 <2> 3 <211> 184 <212> PRT <213> Arabidopsis thaliana <400> 3

86 <2> 4 <211> 284 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <2> <223> Opis sekwencji sztucznej: białko - domena receptora glikokortykoidu (GR) 1 <400> 4

87 1 2

88 <2> <211> 874 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <2> <223> Opis sekwencji sztucznej: sekwencja kodująca domeny GR z sekwencjami flankującymi do klonowania

89 <400> 1 <2> 6 <211> 28 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <2> <223> Opis sekwencji sztucznej: oligonukleotyd HRDf <400> 6 2 <2> 7 <211> 27 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <2> <223> Opis sekwencji sztucznej: oligonukleotyd HRDr 3 <400> 7 40 <2> 8 <211> 32 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna 4

90 <2> <223> Opis sekwencji sztucznej: oligonukleotyd RP6 <400> 8 <2> 9 <211> 33 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna 1 <2> <223> Opis sekwencji sztucznej: oligonukleotyd RP7 <400> 9 2 <2> <211> 22 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <2> <223> Opis sekwencji sztucznej: oligonukleotyd RACTP1 <400> 3 40 <2> 11 <211> 24 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna 4 <2> <223> Opis sekwencji sztucznej: oligonukleotyd RACTP2 <400> 11 0

91 Zastrzeżenia patentowe 1. Zastosowanie sekwencji kwasu nukleinowego kodującej białko o sekwencji SEK ID NR: 3 lub białko w co najmniej 70% identyczne z SEK ID NR: 3 albo białko ortologiczne do wytwarzania roślin transgenicznych o kombinacji dwóch albo większej liczby fenotypów wybranych z grupy obejmującej: zwiększoną tolerancję na suszę, zwiększoną odporność na choroby i ulepszoną strukturę korzeniową. 2. Sposób wytwarzania transgenicznych roślin wykazujących kombinację dwóch albo większej liczby fenotypów wybranych z grupy obejmującej: zwiększoną tolerancję na suszę, zwiększoną odporność na choroby i ulepszoną strukturę korzeniową, zawierających wstawiony do genomu rośliny chimerowy gen zawierający transkrypcyjną sekwencję regulacyjną aktywną w komórkach roślinnych, przyłączoną w sposób umożliwiający działanie do sekwencji kwasu nukleinowego kodującej białko o sekwencji SEK ID NR: 3 lub białko w co najmniej 70% identyczne z SEK ID NR: 3 albo białko ortologiczne. 3. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że taka transkrypcyjna sekwencja regulacyjna jest wybrana z grupy składającej się z promotora konstytutywnego, promotora indukowalnego, promotora specyficznego tkankowo i promotora regulowanego w rozwoju.

92 4. Sposób według zastrz. 2 albo 3, znamienny tym, że taka transkrypcyjna sekwencja regulacyjna jest promotorem indukowalnym stresem.. Sposób według dowolnego z zastrz. od 1 do 4, znamienny tym, że sekwencja takiej kodującej sekwencji kwasu nukleinowego to SEK ID NR: 1. Stichting Dienst Landbouwkundig Onderzoek Zastępca:

93

94

9

96

97

98

99