PRACE ORYGINALNE / ORIGINALS

49 metastases / Mikrośrodowisko guza stanowi zrąb nowotworu i jest miejscem determinującym wzrost nowotworu i rozwój jego zdolności do progresji i inicjowania przerzutu [1, 2]. Zrąb nowotworu nie jest tkanką nowotworową, ale tkanką, na którą nowotwór wywarł wpływ, jest zatem tkanką zmodyfikowaną przez guz. Wśród komórek zrębu występują komórki śródbłonka naczyń i ich prekursory, perycyty, komórki mięśni gładkich, fibroblasty, fibroblasty związane z nowotworem, miofibroblasty, neutrofile, eozynofile, bazofile, mastocyty, limfocyty T i B, komórki NK (natural killer cells), komórki prezentujące antygen (APC; antigen presenting cells), takie jak makrofagi, makrofagi związane z guzem (TAM; tumor associated macrophages) i komórki dendrytyczne [1, 2]. Zmodyfikowane przez nowotwór mikrośrodowisko jest często porównywane z niegojącą się raną [3]. Komórki

50 PRACE ORYGINALNE / ORIGINALS Tabela I. K K I II III IV N+ 8 nowotworów złośliwych są zdolne do inwazji otaczających zdrowych tkanek, tak więc ulegają wkomponowaniu w podścielisko nowotworu. Poprzez dokonywanie zmian w zrębie nowotworu guz modyfikuje skierowaną przeciw niemu odpowiedź układu odpornościowego [4]. Tworzenie przez guz mikrośrodowiska o hamującym profilu umożliwia komórkom nowotworu ucieczkę spod nadzoru immunologicznego ustroju, hamuje skuteczną odpowiedź przeciwnowotworową, w praktyce komórki te mają zmieniony profil aktywności i są przezeń wykorzystywane do rozwoju i inwazji [5]. Przebudowa mikrośrodowiska nowotworu jest warunkowana ekspresją wielu czynników modyfikujących aktywność komórek układu immunologicznego, w tym FasL, HLA-G. Wykładnikiem zmiany funkcji układu immunologicznego jest, między innymi, ekspresja RCAS1 przez makrofagi, która powoduje zmianę fenotypu tych komórek na makrofagi zmodyfikowane przez nowotwór. RCAS1 jest białkiem, którego ekspresję zidentyfikowano w wielu nowotworach złośliwych [6, 7]. Podstawową funkcją białka RCAS1 jest zahamowanie aktywowanych komórek układu odpornościowego, takich jak limfocyty T i B oraz komórki NK, i wywołanie ich apoptozy. Zatem białko RCAS1 jest odpowiedzialne za ucieczkę guza nowotworowego spod nadzoru immunologicznego ustroju oraz bierze udział w tworzeniu zjawiska tolerancji immunologicznej dla nowotworu [6, 8 16]. Zasugerowano, że RCAS1 bierze również udział w przebudowie mikrośrodowiska nowotworu w raku szyjki macicy [6, 14]. Sonoda i wsp. obserwowali znaczący związek między ekspresją RCAS1 w raku szyjki macicy a ekspresją VEGF oraz gęstością mikronaczyń w ten sposób RCAS1 może uczestniczyć w przebudowie mikrośrodowiska nowotworu poprzez udział w regulacji angiogenezy [6]. W naszych dotychczasowych badaniach ekspresję RCAS1 zidentyfikowano w tkance otoczenia nowotworu, gdzie immunoreaktywność RCAS1 w nabłonku sąsiedztwa nowotworu malała wraz z rosnącą odległością od nowotworu i była związana z wznową nowotworu [9]. Limfocytami gromadzącymi się w obrębie guza są limfocyty Treg CD4 + CD25 high Foxp3 + [16]. Ich obecność w mikrośrodowisku nowotworu jest odpowiedzialna za zahamowanie aktywności napływających komórek cytotoksycznych. Według ostatnich badań, limfocyty Treg stanowią jeden z najistotniejszych elementów zjawiska tolerancji immunologicznej względem nowotworu. Wykazano ponadto, że czynnik transkrypcyjny Foxp3 jest specyficznym markerem pozwalającym identyfikować te komórki regulatorowe [16]. Zarówno makrofagi związane z rakiem, jak i limfocyty Treg wydają się być zaangażowane w tworzenie hamującego profilu mikrośrodowiska. Przypuszcza się, że komórki te mogą wywierać wpływ hamujący odpowiedź immunologiczną i w ten sposób współtworzyć zjawisko tolerancji immunologicznej dla nowotworu. Celem niniejszej pracy była zatem analiza obecności immunoreaktywności RCAS1 w tkankach raka płaskonabłonkowego gardła środkowego oraz w jego mikrośrodowisku, a także makrofagów i limfocytów Treg oraz ocena ich udziału w tworzeniu hamującego profilu mikrośrodowiska. Do badania włączono wycinki tkankowe otrzymane od 60 chorych: 40 chorych z rakiem płaskonabłonkowym gardła środkowego, u których przeanalizowano tkankę raka płaskonabłonkowego oraz jego podścieliska, i 20 chorych z przewlekłym stanem zapalnym migdałków podniebiennych, u których przeanalizowano nabłonek migdałka. Analizowano tkankę nowotworu złośliwego oraz jego podścielisko wraz ze zdrowym otoczeniem nowotworu, które zdefiniowano jako tkankę o powierzchni 1 cm 2 makroskopowo i histologicznie wolną od utkania nowotworu. Na przeprowadzenie analizy molekularnej uzyskano zgodę Komisji Bioetycznej nr: KBET/90/B/2005. Materiał tkankowy analizowano histopatologicznie

51 Tabela II. K K A B Ryc. 1. w Zakładzie Patologii Nowotworów Centrum Onkologii w Bydgoszczy. Charakterystykę grupy badanej przedstawia tabela I. Grupę porównawczą stanowiło 20 chorych, u których usunięto migdałki podniebienne z powodu przewlekłego stanu zapalnego migdałków podniebiennych. Charakterystykę grupy porównawczej przedstawia tabela II. Analiza immunohistochemiczna Immunoreaktywność badanych antygenów oceniano zarówno w nabłonku, jak i w podścielisku w następujący sposób: RCAS1: 0 brak immunoreaktywności; +1 immunoreaktywność słaba (także ziarnisty typ immunoreaktywności w okolicy okołojądrowej, cytoplazmatyczny odczyn immunoreaktywności powyżej 10% komórek charakteryzujących się pozytywnym odczynem); +2 wyraźny odczyn cytoplazmatyczny (czasem razem z odczynem błonowym) obecny w 11 30% komórek; +3 wysoka immunoreaktywność (powyżej 30% komórek immunopozytywnych). komórki układu immunologicznego liczono w każdym badanym skrawku, podając średnią liczbę komórek w jednym polu widzenia (powiększenie 40x). Immunoreaktywność antygenów: CD3+, CD25+, CD68+ oraz Foxp3+ na komórkach układu immunologicznego oceniano półilościowo w zależności od liczby komórek w badanym skrawku następująco: 0 brak komórek immunopozytywnych względem danego antygenu; +1 pojedyncze immunopozytywne komórki w badanym skrawku tkankowym; +2 1 5 immunopozytywnych komórek w 1 polu widzenia; +3 powyżej 5 pozytywnych komórek w 1 polu widzenia. Analiza statystyczna Obliczenia statystyczne przeprowadzone zostały za pomocą programu Statistica 8.0 (StatSoft, Inc., USA). Porównano zmienne ilościowe w grupach badanych testem Kruskala-Wallisa wykazującym zróżnicowanie grup, a następnie testem wielokrotnych porównań Tukey a, za pomocą którego szczegółowo określano występowanie Ryc. 2. różnic pomiędzy badanymi grupami. Do porównywania zmiennych ilościowych w dwóch grupach niezależnych stosowano test Manna-Whitneya. Aby wykryć różnice w dwóch próbach zależnych, wykorzystano test kolejności par Wilcoxona. Zastosowano także test Grubbsa celem wykluczenia obserwacji odstających. Analiza immunoreaktywności antygenów CD3 i CD25 w badanych próbkach tkankowych: w tkankach raka płaskonabłonkowego immunoreaktywność antygenu CD3 była obecna w 90% preparatów raka oraz w 71% podścieliska raka (Ryc. 1A). Immunoreaktywność antygenu CD25 była obecna w 37,6% preparatów raka oraz w 14% podścieliska raka płaskonabłonkowego (Ryc. 1B). Reprezentowała ona błonowo-cytoplazmatyczny lub cytoplazmatyczny typ ekspresji.

52 PRACE ORYGINALNE / ORIGINALS Ryc. 3. A Ryc. 4. Analiza immunoreaktywności antygenu CD69 w badanych tkankach: immunoreaktywność antygenu CD69 była obecna w 34,7% preparatów raka płaskonabłonkowego oraz w 36,2% podścieliska (Ryc. 2). Analiza immunoreaktywności antygenu CD68 w badanych tkankach: w tkankach raka płaskonabłonkowego gardła środkowego immunoreaktywność antygenu CD68 była obecna w 59,4% preparatów raka oraz w 62,3% podścieliska, reprezentowała ona błonowo-cytoplazmatyczny typ ekspresji (Ryc. 3). Analiza immunoreaktywności antygenu Foxp3: w tkankach raka płaskonabłonkowego gardła środkowego nie obserwowano immunoreaktywności antygenu Foxp3, ale w podścielisku raka zauważono rozproszone limfocyty Foxp3 dodatnie w 5% badanych preparatów. B Analiza immunoreaktywności antygenu RCAS1 w badanych tkankach: w tkankach raka płaskonabłonkowego gardła środkowego immunoreaktywność RCAS1 była obecna w 85,5% preparatów raka. Najczęściej reprezentowała błonowo-cytoplazmatyczny typ ekspresji. Obserwowano również immunoreaktywność RCAS1 w 16% preparatów podścieliska raka płaskonabłonkowego migdałków podniebiennych. Zanotowano rozproszone komórki RCAS1 pozytywne w podścielisku raka płaskonabłonkowego migdałka, które zidentyfikowano jako makrofagi (Ryc. 4). Porównanie poziomu immunoreaktywności badanych antygenów w tkankach raka płaskonabłonkowego i podścielisku nowotworów: znamiennie statystycznie większą immunoreaktywność antygenu CD25 oraz RCAS1 stwierdzono w raku gardła środkowego w porównaniu z podścieliskiem nowotworu. Obserwowano znamiennie statystycznie większą immunoreaktywność antygenu CD68 (identyfikującego makrofagi) w podścielisku nowotworu aniżeli w tkankach raka płaskonabłonkowego. Nie stwierdzono różnic znamiennych statystycznie w immunoreaktywności antygenu CD3, CD69 oraz antygenu Foxp3 między rakiem płaskonabłonkowym a jego podścieliskiem (Tab. III). Porównanie immunoreaktywności badanych antygenów w tkance raka płaskonabłonkowego migdałka i w nabłonku migdałka podniebiennego w przewlekłym stanie zapalnym przedstawia tabela IV. Nie wykazano różnic znamiennych statystycznie w immunoreaktywności antygenu CD3, CD69 i Foxp3 między tkankami raka płaskonabłonkowego a grupą porównawczą. Obserwowano znamiennie statystycznie większą immunoreaktywność antygenu CD68 w raku niż w grupie porównawczej. Stwierdzono znamiennie statystycznie wyższą immunoreaktywność CD25 oraz RCAS1 w grupie porównawczej niż w raku płaskonabłonkowym gardła środkowego. Porównanie immunoreaktywności badanych antygenów w tkance podścieliska raka płaskonabłonkowego gardła środkowego i w nabłonku migdałka podniebiennego w przewlekłym stanie zapalnym przedstawia tabela V. Nie wykazano różnic znamiennych statystycznie w immunoreaktywności antygenów CD3 i Foxp3 między podścieliskiem raka płaskonabłonkowego a grupą porównawczą. Obserwowano znamiennie statystycznie wyższą immunoreaktywność antygenów CD25 oraz RCAS1 w grupie porównawczej niż w podścielisku raka. Znamiennie statystycznie wyższą immunoreaktywność antygenów CD68 oraz CD69 stwierdzono w podścielisku raka płaskonabłonkowego niż w grupie porównawczej. Analiza immunoreaktywności badanych antygenów w zależności od cech klinicznych raka płaskonabłonkowego gardła środkowego rozległości miejscowej nowotworu oraz histologicznego stopnia złośliwości komórek nowotworu określonego parametrem G, nie wykazała różnic znamiennych statystycznie.

53 Tabela III. Tabela IV. Analiza immunoreaktywności badanych antygenów w zależności od stadium zaawansowania nowotworu: wykazano znamiennie statystycznie wyższą immunoreaktywność antygenu RCAS1 w raku płaskonabłonkowym w zależności do stopnia zaawansowania nowotworu. Immunoreaktywność RCAS1 była znamiennie wyższa w stadium 4 w porównaniu ze stadium 1. Nie stwierdzono różnic w immunoreaktywności pozostałych badanych antygenów: CD3, CD25, CD68, CD69 oraz Foxp3 w zależności od stadium zaawansowania choroby. Wyniki analizy immunoreaktywności badanych antygenów w zależności od obecności przerzutów w regionalnych węzłach chłonnych przedstawia tabela VI. Obserwowano znamiennie statystycznie wyższą immunoreaktywność antygenów: CD3, CD68, CD69, Foxp3 oraz RCAS1 w podścielisku raka płaskonabłonkowego gardła środkowego u chorych z przerzutami w regionalnych węzłach chłonnych w porównaniu z chorymi bez przerzutów w regionalnych węzłach chłonnych. Stwierdzono statystycznie znamiennie wyższą immunoreaktywność antygenów CD68 oraz RCAS1 w raku gardła środkowego u chorych z przerzutami w regionalnych węzłach chłonnych w porównaniu z chorymi bez przerzutów. Analiza immunoreaktywności badanych antygenów w zależności od występowania wznowy procesu nowotworowego nie wykazała różnic znamiennych statystycznie.

PRACE ORYGINALNE / ORIGINALS 54 Tabela V. Tabela VI.

55 W przeprowadzonej analizie obserwowano związek między immunoreaktywnością białka RCAS1 a innymi uznanymi za niekorzystne czynnikami prognostycznymi. Wykazano znamiennie statystycznie wyższą immunoreaktywność RCAS1 w tkankach raka płaskonabłonkowego gardła środkowego u chorych, u których występowały przerzuty w okolicznych węzłach chłonnych w porównaniu z chorymi bez przerzutów w regionalnych węzłach chłonnych. W naszych wcześniejszych badaniach w rakach płaskonabłonkowych gardła i krtani obserwowano nie tylko wyższą ekspresję RCAS1 w guzach z przerzutami w porównaniu z guzami bez przerzutów, lecz także wyższą ekspresję RCAS1 w guzach z przejściem procesu nowotworowego poza torebkę węzłów chłonnych [9, 16 21]. Wyższa ekspresja RCAS1 w nowotworach złośliwych z obecnymi przerzutami w węzłach chłonnych była również obserwowana w nowotworach złośliwych przewodu pokarmowego, takich jak rak przełyku [21], żołądka [21, 22], pęcherzyka żółciowego [23], trzustki [24], jelita grubego [25], a także w innych nowotworach, np. w raku szyjki macicy [12]. W przedstawionej pracy wykazano znamiennie statystycznie wyższą immunoreaktywność RCAS1 w tkankach raka płaskonabłonkowego gardła środkowego w zależności od stadium zaawansowania nowotworu, podobnie jak w przypadku nowotworów złośliwych przełyku, pęcherzyka żółciowego, trzustki, raku endometrium, raka jajnika [26 30]. Wydaje się, że aktywność białka RCAS1 jest wielokierunkowa. Podstawową funkcją RCAS1 jest hamowanie aktywności i indukcja apoptozy w komórkach układu immunologicznego, limfocytach T, B oraz komórkach NK, czyli jest ono odpowiedzialne za ucieczkę nowotworu spod nadzoru immunologicznego ustroju. Bierze zatem udział w tworzeniu tolerancji układu immunologicznego względem nowotworu [31]. Poza tym Sonoda i wsp. zauważyli, że ekspresja RCAS1 w inwazyjnym raku szyjki macicy może mieć wpływ na przebudowę mikrośrodowiska guza. W raku szyjki macicy ekspresja RCAS1 była związana znamiennie statystycznie z ekspresją VEGF oraz z gęstością mikronaczyń, dlatego wydaje się, że kolejną znaczącą funkcją białka RCAS1 w rozwoju nowotworu jest regulacja jego wzrostu poprzez kontrolę angiogenezy. Z kolei proces angiogenezy jest istotną składową procesu przebudowy podścieliska nowotworu. Sonoda i wsp. zasugerowali, że ekspresja RCAS1 może ułatwiać inwazję komórek raka do tkanki łącznej poprzez zwiększenie potencjału inwazyjnego nowotworu oraz indukcję przebudowy tkankowej i ucieczki guza spod nadzoru immunologicznego gospodarza [31]. Immunoreaktywność RCAS1 w prezentowanej pracy była znamiennie statystycznie wyższa w tkankach raka płaskonabłonkowego w porównaniu z podścieliskiem nowotworu, zauważyliśmy także znamiennie statystycznie wyższą immunoreaktywność RCAS1 w podścielisku nowotworów u chorych, u których występowały przerzuty w regionalnych węzłach chłonnych w porównaniu z chorymi bez przerzutów. Podobne obserwacje poczyniliśmy w badaniach nad ekspresją RCAS1 w podścielisku raków gruczołowych, a także w pracy, w której obserwowaliśmy wolne od nowotworu otaczające tkanki tutaj ekspresja RCAS1 była związana z większym ryzykiem wznowy nowotworu [9, 32]. W chorobie nowotworowej występują co najmniej dwa zjawiska związane z aktywnością i funkcją białka RCAS1. Pierwsze, to przewlekły samonapędzający się proces zapalny towarzyszący nowotworowi i promujący jego wzrost; obejmuje nie tylko sam guz, lecz również jego zdrowe histopatologicznie mikrośrodowisko [32, 33]. Drugim zjawiskiem jest tolerancja immunologiczna względem nowotworu, zawierająca w sobie eliminację komórek odpowiedzi przeciwnowotworowej. Bierze w niej udział RCAS1 poprzez hamowanie aktywności limfocytów T, B, NK oraz indukcję apoptozy tych komórek [11, 34]. W przedstawionej pracy w podścielisku nowotworu obserwowano znamiennie statystycznie wyższą immunoreaktywność antygenu CD3 identyfikującego limfocyty T niż w raku płaskonabłonkowym gardła środkowego. Co więcej, w podścielisku nowotworu u chorych z przerzutami do węzłów chłonnych wykazano znamiennie statystycznie wyższą immunoreaktywność antygenu CD3 niż u chorych bez przerzutów. Może to wynikać z jednej strony z toczącego się równolegle do procesu nowotworowego procesu zapalnego. Należy zauważyć, że obserwowany poziom immunoreaktywności antygenu CD3 był odwrotnie proporcjonalny do poziomu immunoreaktywności RCAS1. Funkcja biologiczna białka RCAS1 zawiera w sobie zahamowanie aktywnych limfocytów cytotoksycznych oraz komórek NK i wywołanie ich apoptozy [35 37]. Ekspresja RCAS1 była odwrotnie proporcjonalna do nacieku limfocytów CD3 w raku szyjki macicy i raku piersi [27, 34], była też związana ze wzrostem liczby ulegających apoptozie limfocytów w raku płuc oraz chorobie Hodgkina [39]. Wzrost liczby limfocytów, głównie CD3 pozytywnych, ulegających apoptozie stwierdzono również w sąsiedztwie RCAS1 pozytywnych komórek raka jamy ustnej, raka szyjki macicy oraz RCAS1 pozytywnych przerzutowych komórek nowotworowych w węzłach chłonnych [30, 31, 36]. Pojawienie się przerzutów w okolicznych węzłach chłonnych może być wynikiem przełamania bariery odpowiedzi immunologicznej w wyniku ekspresji przez nowotwór takich białek, jak RCAS1, silnie hamujących aktywność limfocytów T i indukujących apoptozę tych komórek, umożliwiających w ten sposób rozsiew nowotworu. Sama liczba limfocytów naciekających guz i jego mikrośrodowisko nie świadczy, jak wiadomo, o sku-

56 PRACE ORYGINALNE / ORIGINALS tecznej odpowiedzi przeciwnowotworowej. W analizowanym materiale obserwowano znamiennie statystycznie wyższy poziom immunoreaktywności antygenu CD25 w raku gardła środkowego w porównaniu z podścieliskiem nowotworu. Oznacza to, że nasilenie odpowiedzi układu immunologicznego, zależnej od obecności IL-2 w samym nowotworze, jest wyższe niż w podścielisku nowotworu, a wzrost immunoreaktywności receptora dla tej interleukiny sugeruje większą liczbę komórek mogących odpowiedzieć na wzrost ilości tej cytokiny. Wyższa immunoreaktywność CD25 w raku w porównaniu z jego podścieliskiem może wskazywać na obecność limfocytów Treg, które charakteryzują się ekspresją CD25, a to byłoby wyrazem silnej immunosupresji w tkance raka w odniesieniu do tkanki podścieliska. Co więcej, w przeprowadzonym badaniu immunoreaktywność antygenu CD25 była znamiennie statystycznie niższa, zarówno w raku gardła środkowego, jak i w jego podścielisku niż w grupie referencyjnej. TIL (tumor infiltrating lymphocytes) są obecne w większości guzów litych oraz ich otoczenia i stanowią najczęściej limfocyty T CD3. Opisywano specyficzną cytolizę guza mediowaną przez TIL w raku piersi, wskazując na to, że IL-2 może być odpowiedzialna za tę odpowiedź [37]. Taką cytolizę opisywano również w czerniaku złośliwym oraz w raku nerki, a cytoliza była potęgowana przez stymulację IL-2. IL-2 powoduje aktywację limfocytów T po połączeniu z receptorem dla IL-2 (IL-2R) na powierzchni limfocytów T [38, 39]. W mikrośrodowisku raka piersi limfocyty TIL były aktywne (miały ekspresję antygenów CD69, CD43, CD38), ale miały znacząco obniżoną ekspresję IL-2R (obniżona ekspresja antygenu CD25, p55). Również produkcja cytokiny IL-2 była znacząco obniżona lub niewykrywalna w mikrośrodowisku raka piersi. A zatem, zarówno produkcja IL-2, jak i ekspresja IL-2R były znacząco zredukowane w mikrośrodowisku raka piersi [40]. Obniżenie ekspresji IL-2R oraz IL-2 może wynikać z indukcji tolerancji immunologicznej w mikrośrodowisku nowotworu, co pozostaje też w zgodności z wynikami badań przeprowadzonych in vitro, w których TIL mają słabą ekspresję IL-2R i słabo odpowiadają na IL-2 oraz stymulację mitogenem, wskazując na lokalną immunosupresję [41]. Zahamowanie ekspresji IL-2R (CD25) obserwowano również w wielu innych nowotworach (rak jelita grubego, rak szyjki macicy, rak nerki) [40, 42, 43]. Obecność TIL identyfikuje się w różnych nowotworach złośliwych, ale ich potencjał cytotoksyczny zwykle nie podlega ekspresji. IL-2Ra (CD25) jest receptorem podstawowym dla proliferacji limfocytów T, jego obniżona ekspresja może powodować supresję immunologiczną [44, 45]. Wszystkie cytowane doniesienia potwierdzają występowanie zjawiska selektywnej supresji limfocytów naciekających guz. W przeprowadzonej analizie również obserwowano immunoreaktywność antygenu CD69 zarówno w nowotworze, jak i jego podścielisku, nie zidentyfikowano różnic w immunoreaktywności antygenu CD69 między guzem a jego podścieliskiem. Natomiast znamiennie statystycznie wyższą immunoreaktywność CD69 obserwowano w raku gardła środkowego oraz jego podścielisku w porównaniu z nabłonkiem migdałka; przeciwnie do obserwowanej immunoreaktywności antygenu CD25, która była niższa w raku i podścielisku niż w grupie referencyjnej. Reasumując, stwierdzono obecność limfocytów naciekających guz (immunoreaktywność CD3) zarówno w tkance raka migdałka, jak i w jego zdrowym podścielisku. Są to komórki aktywowane (immunoreaktywność antygenu CD69 była wyższa w stosunku do grupy referencyjnej), ale o upośledzonej funkcji cytotoksycznej, na co może wskazywać obniżona immunoreaktywność antygenu CD25. Potwierdza to obecność selektywnie zahamowanych limfocytów w obrębie nowotworu oraz jego mikrośrodowiska. Taki profil ekspresji antygenów CD69 i CD25 jest zgodny z opisywanym przez Sheu i wsp. fenotypem selektywnie zahamowanych limfocytów znajdujących się w mikrośrodowisku raka [44]. Tolerancja immunologiczna względem nowotworu jest współtworzona przez białka i komórki, makrofagi związane z guzem znamiennie przewyższają liczbą inne komórki prezentujące antygen w guzach litych [46 48]. W przeprowadzonej analizie stwierdzono znamiennie statystycznie większą liczbę makrofagów w obrębie mikrośrodowiska nowotworu w porównaniu z samym nowotworem, przy czym liczba makrofagów w raku gardła środkowego oraz w jego podścielisku była znamiennie statystycznie większa niż w grupie referencyjnej. Co więcej, obserwowano statystycznie znamiennie większą liczbę makrofagów w raku płaskonabłonkowym gardła środkowego oraz w jego podścielisku u chorych z przerzutami do regionalnych węzłów chłonnych w porównaniu z chorymi bez przerzutów. Rola makrofagów naciekających guz zależnych od nowotworu, zwanych też makrofagami towarzyszącymi nowotworowi, wydaje się podwójna w rozwoju nowotworu. Makrofagi mogą z jednej strony stymulować rozwój nowotworu, z drugiej zaś prowadzić do jego odrzucenia [49]. Wykazano pozytywną korelację między liczbą makrofagów związanych z nowotworem a złym rokowaniem w wielu nowotworach złośliwych. Co więcej, makrofagi są obecne od najwcześniejszych etapów rozwoju nowotworu, w bliskim sąsiedztwie zmian o charakterze przerostu i atypii [32, 46, 50]. Nowotwór i jego podścielisko wykazują ekspresję czynników chemotaktycznych dla makrofagów [51]. Makrofagi z kolei wydzielają wiele czynników wzrostu oraz czynników angiogennych wpływających na podścielisko nowotworu i modyfikujących wzrost nowotworu [32]. Zahamowanie nacieku makrofagów korelowało z upośledzeniem wzrostu guza in vivo [52]. Monocyty/makrofagi napływające do guza i jego podścieliska nabywają, stymulowane przez czynniki podścieliska, dwa fenotypy, zwane M1 i M2 [53].

57 Fenotyp M1 jest związany ze stanem zapalnym oraz aktywnością przeciw czynnikom infekcyjnym, podczas gdy fenotyp M2 z remodelingiem tkankowym i aktywnością proangiogenną. Fenotyp M2 wydaje się kluczowy w rozwoju nowotworu. Interakcje guza z makrofagami prowadzą do uwolnienia przez makrofagi cytokin, chemokin, czynników wzrostu i aktywności (takich jak GM-CSF, IL-8, EGF), które z kolei potęgują dalszy napływ komórek układu immunologicznego, zwiększając odpowiedź zapalną w mikrośrodowisku guza [54]. W przeprowadzonej analizie stwierdzono, że makrofagi obecne w podścielisku nowotworu miały immunoreaktywność białka RCAS1. RCAS1-pozytywne makrofagi po raz pierwszy zidentyfikowano w szpiku kostnym, gdzie immunohistochemicznie wykazano obecność ekspresji RCAS1 w obrębie cytoplazmy makrofagów w tkance hemopoetycznej. RCAS1, które jest produkowane przez makrofagi w tkance szpiku kostnego, może odgrywać zasadniczą rolę w regulacji dojrzewania tych komórek, poprzez kontrolę ich apoptozy niezależną od Fas. RCAS1 wywołuje apoptozę aktywowanych limfocytów T, które wykazują ekspresję receptora dla RCAS1 [10]. Wykazano, że stymulacja makrofagów lipopolisachrydem powoduje wzrost ekspresji RCAS1, ze wzrostem RCAS1 mrna, a stymulowane lipopolisacharydem makrofagi indukowały śmierć progenitorowych komórek szeregu erytroblastycznego poprzez produkcję RCAS1. Wykazano zatem, że makrofagi poprzez ekspresję RCAS1 negatywnie regulują erytropoezę i mogą w ten sposób brać udział w powstawaniu anemii u chorych ze stanem zapalnym [55]. Obecność RCAS1-pozytywnych makrofagów opisaliśmy również w podścielisku polipów nosa, w którym obserwowano obfity naciek zapalny [56 59]. Ponieważ RCAS1-pozytywne makrofagi mają silną funkcję regulacyjną w stosunku do innych komórek układu immunologicznego, ich obecność w dużej liczbie w podścielisku nowotworu może świadczyć o dużym działaniu hamującym odpowiedź przeciwnowotworową. Przeprowadzona analiza potwierdza, że białko RCAS1, będąc aktywnym czynnikiem wydzielanym przez guz i obecnym w jego mikrośrodowisku, może odgrywać istotną rolę zarówno w zjawisku ucieczki guza spod nadzoru immunologicznego ustroju i kreowaniu tolerancji immunologicznej względem komórek nowotworu, jak i w przebudowie mikrośrodowiska guza w kierunku rozwoju jego supresyjnego profilu, umożliwiającego jego dalszy wzrost i tworzenie przerzutów. Autorzy dziękują Pani Profesor Romanie Tomaszewskiej oraz Pani Doktor Agacie Lazar za okazaną pomoc i wsparcie. 1. Cotran RS, Kumar V, Robbins SL (eds.) 1989. Pathologic Basis of Disease. W.B. Sannders Company, Philadelphia 1989,s.257 260. 2. Coussens LM, Werb Z. Inflammation and cancer. Nature 2002;420:860 867. 3. Dvorak HF. Tumors: wounds that do not heal. Similarities between tumor stroma generation and wound healing. N Engl J Med. 1986;315:1650 1659. 4. Singh S, Ross SR, Acena M, Rowley DA, Schreiber H. Stroma is critical for preventing or permitting immunological destruction of antigenic cancer cells. J Exp Med.1992;175:139 146. 5. Lorusso G, Ruegg C. The tumor microenvironment and its contribution to tumor evolution toward metastasis. Histochem Cell Biol. 2008;130:1091 1103. 6. Sonoda K, Miyamoto S, Nakashima M, Wake N. The biological role of the unique molecule RCAS1: a bioactive marker that induces connective tissue remodeling and lymphocyte apoptosis. Front Biosci. 2008;13:1106 1116. 7. Sonoda K. Novel therapeutic strategies to target RCAS1, which induces apoptosis via ectodomain shedding. Histol Histopathol. 2011;26:1475 1486. 8. Dutsch-Wicherek M, Wicherek Ł. The association of RCAS1 serum concentration with the reversibility or irreversibility of the process of immune cytotoxic activity restriction during normal menstrual cycle, cancer relapse, and surgical treatment for various types of squamous cell carcinomas and adenocarcinomas. Am J Reprod Immunol. 2008;59:266 275. 9. Dutsch-Wicherek M, Tomaszewska R, Lazar A, Wicherek Ł, Składzień J. The association between RCAS1 expression in laryngeal and pharyngeal cancer and its healthy stroma with cancer relapse. BMC Cancer 2009;9:35. 10. Matsushima T, Nakashima N, Oshima K, Abe Y, Nishimura J, Nawata H, et al. Receptor binding cancer antigen expressed on SiSo cells, a novel regulator of apoptosis of erythroid progenitor cells. Blood 2001;15:313 321. 11. Nakashima M, Sonoda K, Watanabe T. Inhibition of cell growth and induction of apoptotic cell death by the human tumor-associated antigen RCAS1. Nat Med. 1999;5: 928 942. 12. Sonoda K, Miyamoto S, Hirakawa T, Yagi H, Yotsumoto F, Nakashima M, et al. Invasive potency related to RCAS1 expression in uterine cervical cancer. Gynecol Oncol. 2005;99:189 198. 13. Sonoda K, Miyamoto S, Hirakawa T, Yagi H, Yotsumoto F, Nakashima M, et al. Clinical significance of RCAS1 as a biomarker of uterine cancer. Gynecol Oncol. 2006;103:924 931. 14. Sonoda K, Miyamoto S, Yotsumoto F, Yagi H, Nakashima M, Watanabe T, Nakano H. Clinical significance of RCAS1 as a biomarker of ovarian cancer. Oncol Rep. 2007;17:623 628. 15. Wicherek Ł. Alterations in RCAS1 serum concentration levels during the normal menstrual cycle and the lack of analogical changes in ovarian endometriosis. Am J Reprod Immunol. 2008;59:535 544.

58 PRACE ORYGINALNE / ORIGINALS 16. Albers AE, Ferris RL, Kim GG, Chikamatsu K, DeLeo AB, Whiteside TL. Immune responses to p53 in patients with cancer: enrichment in tetramer+ p53 peptide-specific T cells and regulatory T cells at tumor sites. Cancer Immunol Immunother. 2005;54:1072 1081. 17. Dutsch-Wicherek M, Wicherek Ł, Mak P, Skladzien J. Ocena ekspresji RCAS1 w wybranych stanach chorobowych narządów głowy i szyi. Assessment of RCAS1 expression in selected head and neck diseases. Otorynolaryngologia 2004;3:25 28. 18. Dutsch-Wicherek M, Popiela TJ, Wicherek Ł, Modrzejewski M, Tomaszewska R, Składzień J. RCAS1 expression in laryngeal and pharyngeal cancer with local lymph node metastasis. W: Papaspyrou S (ed).5th EUFOS 2004. Medimond S.r.l, Rodos 2004:345 348. 19. Dutsch-Wicherek M, Popiela TJ, Tomaszewska R, Wicherek Ł, Modrzejewski M, Składzień J. Prawdopodobne mechanizmy molekularne biorące udział w nawrocie raka krtani. Otorynolaryngologia 2004;3(Suppl 1):93. 20. Dutsch-Wicherek M, Wicherek Ł, Tadeusz JP, Tomaszewska R, Wierzchowski W, Modrzejewski M, Składzień J. Ekspresja RCAS1 jako czynnik rokowniczy w raku krtani. Otolaryngologia. 2005;4:84 88. 21. Tsujitani S, Saito H, Oka S, Sakamoto T, Kanaji S., Tatebe S, Ikeguchi M. Prognostic significance of RCAS1 expression in relation to the infiltration of dendritic cells and lymphocytes in patients with esophageal carcinoma. Dig Dis Sci. 2007;52:549 554. 22. Fukuda K, Tsujitani S, Maeta Y, Yamaguchi K, Ikeguchi M, Kaibara N. The expression of RCAS1 and tumor infiltrating lymphocytes in patients with T3 gastric carcinoma. Gastric Cancer. 2002;5:220 227. 23. Oshikiri T, Hida Y, Miyamoto M, Hashida H, Katoh K, Suzuoki M, et al. RCAS1 as a tumour progression marker: an independent negative prognostic factor in gallbladder cancer. Br J Cancer. 2001;85:1922 1927. 24. Hiraoka K, Hida Y, Miyamoto M, Oshikiri T, Suzuoki M, Nakakubo Y, et al. High expression of tumor-associated antigen RCAS1 in pancreatic ductal adenocarcinoma is an unfavorable prognostic marker. Int J Cancer 2002;99:418 423. 25. Okada T, Iiai T, Kawachi Y, Moroda T, Takii Y, Hatakeyama K, Abo T. Origin of CD57+ T cells which increase at tumour sites in patients with colorectal cancer. Clin Exp Immunol. 1995;102:159 166. 26. Akahira JI, Aoki M, Suzuki T, Moriya T, Niikura H, Ito K, et al. Expression of EBAG9/RCAS1 is associated with advanced disease in human epithelial ovarian cancer. Br J Cancer 2004;90:2197 2202. 27. Kato H, Nakajima M, Masuda N, Faried A, Sohda M, Fukai Y, et al. Expression of RCAS1 in esophageal squamous cell carcinoma is associated with a poor prognosis. J Surg Oncol. 2005;90:89 94. 28. Nakakubo Y, Hida Y, Miyamoto M, Hashida H, Oshikiri T, Kato K, et al. The prognostic significance of RCAS1 expression in squamous cell carcinoma of the oesophagus. Cancer Lett. 2002;177:101 105. 29. Sonoda K, Miyamoto S, Hirakawa T, Kaku T, Nakashima M, Watanabe T, et al. Association between RCAS1 expression and clinical outcome in uterine endometrial cancer. Br J Cancer 2003;89:546 551. 30. Sonoda K, Nakashima M, Kaku T, Kamura T, Nakano H, Watanabe T. A novel tumor-associated antigen expressed in human uterine and ovarian carcinomas. Cancer 1996;77:1501 1509. 31. Sonoda K, Miyamoto S, Hirakawa T, Yagi H, Yotsumoto F, Nakashima M, et al. Clinical significance of RCAS1 as a biomarker of uterine cancer. Gynecol Oncol. 2006; 103:924 931. 32. Mantovani A, Allavena P, Sica A, Balkwill F. Cancer-related inflammation. Nature 2008;454:436 444. 33. Mantovani A, Romero P, Palucka AK, Marincola FM. Tumour immunity: effector response to tumour and role of the microenvironment. Lancet 2008;371:771 783. 34. Suzuki T, Inoue S, Kawabata W, Akahira J, Morija T, Tsuchija F, et al. EBAG9/RCAS1 in human breast carcinoma a possible factore in endocine-immune interactions. Br J Cancer 2001;85:1731 1737. 35. Iwasaki T, Nakashima M, Watanabe T, Yamamoto S, Inoue Y, Yamanaka H, et al. Expression and prognostic significance in lung cancer of human tumor-associated antigen RCAS1. Int J Cancer 2000;89:488 493. 36. Fukuda M, Tanaka A, Hamao A, Suzuki S, Kusama K, Sakashita H. Expression of RCAS1 and its function in human squamous cell carcinoma of the oral cavity. Oncol Rep. 2004;12:259 267. 37. Baxevanis CN, Dedoussis GV, Papadopoulos NG, Missitzis I, Stathopoulos GP, Papamichail M. Tumor specific cytolysis by tumor infiltrating lymphocytes in breast cancer. Cancer 1994;74:1275 1282. 38. Parmiani G, Anichini A, Fossati G. Cellular immune response against autologous human malignant melanoma: are in vitro studies providing a framework for a more effective immunotherapy? J Natl Cancer Inst. 1990;82:361 370. 39. Parmiani G. An explanation of the variable clinical response to interleukin 2 and LAK cells. Immunol Today. 1990;11:113 115. 40. Coventry BJ, Weeks SC, Heckford SE, Sykes PJ, Bradley J, Skinner JM. Lack of IL-2 cytokine expression despite Il-2 messenger RNA transcription in tumor-infiltrating lymphocytes in primary human breast carcinoma: selective expression of early activation markers. J Immunol. 1996;156:3486 3492. 41. Miescher S, Whiteside TL, Moretta L, Von Fliedner V. Clonal and frequency analyses of tumor infiltrating T lymphocytes from human solid tumors. J Immunol. 1987;138:4004 4011. 42. Ebert EC, Roberts AI, Devereux D, Nagase H. Selective immunosuppressive action of a factor produced by colon cancer cells. Cancer Res. 1990;50:6158 6161. 43. Kolenko V, Wang Q, Riedy MC, O Shea J, Ritz J, Cathcart MK, et al. Tumor-induced suppression of T lymphocyte proliferation coincides with inhibition of Jak3 expression

59 and IL-2 receptor signaling: role of soluble products from human renal cell carcinomas. J Immunol. 1997;159:3057 3067. 44. Sheu BC, Lin RH, Ho HN, Huang SC. Down-regulation of CD25 expression on the surface of activated tumorinfiltrating lymphocytes in human cervical carcinoma. Hum Immunol. 1997;56:39 48. 45. Waldmann TA. The IL-2/IL-2 receptor system: a target for rational immune intervention. Immunol Today. 1993;14:264 270. 46. Pollard JW. Tumor-educated macrophages promote tumor progression and metastasis. Nat Rev Cancer 2004;4:71 78. 47. Wyckoff J, Wang W, Lin EY, Wang Y, Pixley F, Stanley ER, et al. A paracrine loop between tumor cells and macrophages is required for tumor cell migration in mammary tumors. Cancer Res. 2004;64:7022 7029. 48. Mantovani A, Bottazzi B, Colotta F, Sozzani S, Ruco L. The origin and function of tumor associated macrophages. Immunol Today. 1992;13:265 270. 49. Mantovani A, Schioppa T, Porta C, Allavena P, Sica A. Role of tumor-associated macrophages in tumor progression and invasion. Cancer Metastasis Rev. 2006;25:315 322. 50. Polverini P, Leibovich SJ. Induction of neovascularization in vivo and endothelial proliferation in vitro by tumorassociated macrophages. Lab Invest. 1984;51:635 642. 51. Bottazzi B, Polentarutti N, Acero R, Balsari A, Boraschi D, Ghezzi P, et al. Regulation of the macrophage content of neoplasms by chemoattractans. Science 1983;220:210 212. 52. Richter G, Kruger-Krasagakes S, Hein G, Huls C, Schmitt E, Diamantstein T, Blankenstein T. Interleukin 10 gene transfected into Chinese hamster ovary cells prevents tumor growth and macrophage infiltration. CancerRes. 1993;53:4134 4137. 53. Allavena P, Sica A, Garlanda C, Mantovania A. The yin- -yang of tumorassociated macrophages in neoplastic progression and immune surveillance. Immunol Rev. 2008;222:155 161. 54. Balkwill F. Cancer and the chemokine network. Nat. Rev. Cancer 2004;4:540 550. 55. Suehiro Y, Muta K, Nakashima M, Abe Y, Shiratsuchi M, Shiokawa S, et al. A novel mechanism in suppression of erythropoiesis during inflammation: a crucial role of RCAS1. Eur J Haematol. 2005;74:365 373. 56. Wicherek Ł, Dutsch-Wicherek M, Gałązka K, Banaś T, Popiela T, Lazar A, Kleinrok-Podsiadlo B. Comparison of RCAS1 and metallothionein expression and the presence and activity of immune cells in human ovarian and abdominal wall endometriomas. Reprod Biol Endocrinol. 2006;4:41. 57. Wicherek Ł, Klimek M, Galazka K, Obrzut B. Cycle dependent RCAS1 expression with respect to the immune cells presence and activity. NeuroEndocrinol Lett. 2006;5:645 650. 58. Wicherek Ł. Alterations in RCAS1 serum concentration levels during the normal menstrual cycle and the lack of analogical changes in ovarian endometriosis. Am. J. Reprod Immunol. 2008;59:535 544. 59. Dutsch-Wicherek M, Tomaszewska R, Stręk P, Wicherek Ł, Składzień J. The analysis of RCAS1 and DFF-45 expression in nasal polyps with respect to immune cells infiltration. BMC Immunol. 2006;7:4.