Szkoła Główna Gospodarstwa Wiejskiego w Warszawie Wydział Ogrodnitwa i Arhitektury Krajorazu Katarzyna Barara Bązek Gromadzenie się związków iologiznie aktywnyh w eleuterokoku kolzystym (Eleutheroous sentiosus /Rupr. et Maxim./ Maxim.) uprawianym w Polse Autoreferat pray doktorskiej Praa wykonana pod kierunkiem Prof. dr ha. Zenona Węglarza w Katedrze Roślin Warzywnyh i Leznizyh Reenzeni: Dr ha. Ewa Capeka, UR im. Hugona Kołłątaja w Krakowie Dr ha. Ewa Osińska, prof. nadzw. SGGW Warszawa, 21
WSTĘP I CEL PRACY Eleuterokok kolzysty (Eleutheroous sentiosus /Rupr. et Maxim./ Maxim.) naleŝy do tyh nieliznyh roślin leznizyh, któryh działanie wyhodzi naprzeiw ozekiwaniom zarówno ludzi horyh, jak i zdrowyh. WiąŜe się to przede wszystkim z adaptogennymi właśiwośiami tej rośliny, polegająymi na normalizowaniu dysfunkji organizmu, zwiększeniu jego moŝliwośi adaptayjnyh w stosunku do hemiznyh, fizyznyh i iologiznyh stresorów oraz podnoszeniu niespeyfiznej odpornośi. Jest to krzew występująy dziko na oszarze dalekowshodniej Rosji, półnonyh Chin, Korei i Japonii. Surowem u tej rośliny są zróŝniowane morfologiznie i anatomiznie organy podziemne, traktowane jako jednorodny produkt, zwany potoznie korzeniem eleuterokoka (Eleutherooi radix). Spotyka się takŝe informaje o wykorzystywaniu kory organów podziemnyh, kory pędów i liśi. Wszystkie te surowe, jak do tej pory, pohodziły wyłąznie z roślin dziko rosnąyh. Eleuterokok kolzysty, szzególnie w latah 6., ył oiektem wnikliwyh adań, zarówno hemiznyh jak i farmakologiznyh. Otrzymywane z niego preparaty leznize testowane yły takŝe w warunkah kliniznyh. Roślina ta nie yła dotyhzas uprawiana, a jedyną wskazówką dotyząą wymagań jakośiowyh w stosunku do pozyskiwanyh z niej surowów jest informaja zawarta w Farmakopeah Brytyjskiej [28] i Europejskiej [21] odnośnie minimalnej zawartośi w korzeniah sumy eleuterozydów B i E. Celem nadrzędnym podjętyh adań yła próa określenia wartośi surowowej eleuterokoka kolzystego uprawianego w Polse. Szzególna uwaga zwróona została na poznanie zaleŝnośi pomiędzy rozwojem rośliny, a gromadzeniem się w jej organah związków, którym przypisywana jest odpowiedzialność za aktywność iologizną otrzymywanyh z niej ekstraktów. Określenie tyh zaleŝnośi, poza walorem poznawzym, ułatwiłoy standaryzaję wyjśiowyh surowów przeznazonyh dla przemysłu fitofarmaeutyznego. W śisłym związku z realizają elu nadrzędnego pozostają adania dotyząe próy określenia zakresu zróŝniowania (przede wszystkim hemiznego) w oręie rodzaju Eleutheroous i gatunku Eleutheroous sentiosus, potenjału reprodukyjnego tego ostatniego oraz oeny hemiznej uzyskanyh izolatów. 2
MATERIAŁ I METODY I. Badania polowe Doświadzenia polowe prowadzono na Polu Doświadzalnym SGGW w Wilanowie. 1. Dynamika przyrostu masy organów podziemnyh i nadziemnyh oraz dynamika gromadzenia się w nih związków iologiznie aktywnyh Doświadzenie prowadzono w latah 24-29. Śisłe adania porównawze dotyząe przyrostu masy roślin i zawartośi w nih związków iologiznie aktywnyh wykonano w latah 28-29, ze względu na to, Ŝe w tyh dwóh latah moŝna yło równoześnie porównać materiał roślinny ędąy w róŝnym wieku. Czynniki doświadzenia: Wiek roślin: 1-rozne 2-letnie 3-letnie 4-letnie Surowe: organy podziemne kora pędów liśie Z roślin 1-roznyh, ze względu na niską masę organów surowowyh, do adań poierano wyłąznie organy podziemne. Zioru dokonywano jednokrotnie - późną jesienią. Z roślin 2-, 3- i 4- letnih organy podziemne i korę pędów poierano trzykrotnie (latem, późną jesienią i wzesną wiosną następnego roku w końowym okresie spozynku roślin), natomiast liśie dwukrotnie - na pozątku kwitnienia roślin ( zerwa) oraz w zasie zawiązywania owoów ( lipa). Z kaŝdej kominaji organy surowowe pozyskiwano z 5 roślin. Określano ih świeŝą i powietrznie suhą masę (po wysuszeniu w temp. 4 C), a następnie poddawano je analizom hemiznym na zawartość związków fenolowyh (eleuterozydów B i E, kwasów polifenolowyh, flawonoidów) i steroli. Przedstawione wyniki stanowią średnie z 2 lat. 2. Porównanie wartośi surowowej kłązy i korzeni Doświadzenie prowadzono w latah 28-29. Organy podziemne roślin 2-, 3-, i 4-letnih wykopywano jesienią, pod konie wegetaji roślin. Z kaŝdej kominaji pozyskiwano po 5 roślin. Po ziorze organy podziemne myto i dokładnie oddzielano kłąza od korzeni, a następnie określano ih świeŝą i powietrznie suhą masę. Surowe suszono w suszarni typu Leśnizanka w temperaturze 4 C. W powietrznie suhyh surowah oznazano zawartość związków fenolowyh (eleuterozydów B i E oraz kwasów polifenolowyh) i steroli. Przedstawione wyniki stanowią średnie z 2 lat. 3. ZróŜniowanie hemizne w oręie gatunku Eleutheroous sentiosus Oiektem adań yły rośliny eleuterokoka, które pohodziły z wegetatywnego rozmnoŝenia pojedynzyh, losowo wyranyh roślin mateznyh sprowadzonyh z Instytutu Warzywnitwa w Mińsku Białoruskim. Na roślinah tyh przeprowadzono adania porównawze dotyząe masy oraz składu hemiznego kłązy, korzeni, kory z kłązy, kory z korzeni oraz kory z pędów nadziemnyh. Surowe te pozyskano jesienią, w pozątkowym okresie spozynku roślin. Organy podziemne po wykopaniu myto, oddzielano kłąza od korzeni, określano ih świeŝą i powietrznie suhą masę, po zym z połowy uzyskanego materiału pozyskano korę. Pędy nadziemne okorowano ezpośrednio po ziorze, po zym określano świeŝą i powietrznie suhą masę kory. Zarówno organy podziemne jak i korę pędów suszono w temperaturze 4 C i oznazano w nih zawartość związków fenolowyh (eleuterozydów B i E oraz kwasów polifenolowyh) i steroli. 3
II. Budowa anatomizna wyranyh organów gatunku Eleutheroous sentiosus z uwzględnieniem struktur wydzielnizyh Do oserwaji mikroskopowyh porano wyinki organów z krzewów rosnąyh na Polu Doświadzalnym SGGW w Wilanowie: kłązy z najgruszej jego zęśi, korzeni, międzywęźli pędów jednoroznyh i dwuletnih ogonków liśiowyh nerwu głównego liśia oraz wyinki laszki liśiowej z nerwem oznym I rzędu (poierane stopniowo od nerwu głównego ku krawędzi laszki). Z 6-tygodniowyh siewek eleuterokoka porano wyinki hypokotyli i korzeni ze strefą włośnikową. Oserwaje anatomizne i ih dokumentaja fotografizna yły wykonane w Katedrze Botaniki SGGW przy pomoy mikroskopu Provis AX (Olympus), wyposaŝonego w kamerę yfrową. Orazy yfrowe o wielkośi 2776x274 pikseli zapisywano w formaie tiff, wykorzystują optykę jasnego pola, DIC lu polaryzayjną. Autofluoresenję oserwowano uŝywają zestawu szerokopasmowego filtrów NU (filtr wzudzająy BP36-37 nm, filtr zaporowy BA42 nm, lustro dihroizne DM4 nm). Ultrastruktura yła oserwowana przy pomoy elektronowego mikroskopu transmisyjnego (TEM) Morgagni 268 (FEI Company), praująego przy 8 kv. Orazy yfrowe o wielkośi 3337x2472 pikseli zapisywano w formaie tiff przy pomoy kamery Morada (SIS). Orazy yfrowe poddawano oróe w programie Photoshop 7. CE (Adoe), uŝywają narzędzi Poziomy i Krzywe. Końowe orazy yły zapisywane w formaie jpg i przygotowane do druku w programie CorelDRAW 11 (Corel Corporation). III. ZróŜniowanie w oręie rodzaju Eleutheroous Materiał roślinny do adań pohodził z Aroretum SGGW w Rogowie. Oiektami adawzymi yły następująe gatunki: 1. E. sentiosus (Rupr. & Maxim.) Maxim. 2. E. sessiliflorus (Rupr. & Maxim.) S.Y. Hu 3. E. henryi Oliv. 4. E. giraldii (Harms) Nakai 5. E. leuorrhizus Oliv. 6. E. sethuenensis (Harms) Nakai 7. E. nodiflorus (Dunn) S.Y. Hu 8. E. divariatus (Sieold & Zu.) S.Y. Hu Materiałem roślinnym przeznazonym do adań yły organy podziemne i owoe pozyskane pod konie wegetaji roślin (październik 27 i 28 r.) oraz liśie i kora pędów zerane na pozątku kwitnienia roślin (zerwie 28 i 29 r.). Uzyskane surowe poddane zostały analizie hemiznej na zawartość związków fenolowyh (eleuterozydów B i E, kwasów polifenolowyh, flawonoidów). Przedstawione wyniki stanowią średnie z 2 lat. IV. RozmnaŜanie 1. Z NASION a. Wpływ sposou stratyfikaji nasion i uŝytego do tego zaiegu podłoŝa na dynamikę kiełkowania nasion i pozątkowy wzrost siewek Do doświadzeń wykorzystano nasiona zerane w 26 i 27 roku z krzewów eleuterokoka rosnąyh w kolekji roślin leznizyh na Polu Doświadzalnym SGGW w Wilanowie. Czynniki doświadzenia: a. Modele stratyfikaji: stratyfikaja ieplno-hłodna, podzas której nasiona przehowywane yły w temp. 2 C przez 1 tygodni, po zym temperaturę oniŝono do 2 C na okres 16 tygodni (model stratyfikaji nasion Ŝeń-szenia) stratyfikaja iepła, która polegała na przehowywaniu nasion w stałej temperaturze 1 C przez 18 miesięy rak stratyfikaji (kontrola). 4
. Wiek nasion: nasiona ezpośrednio po ziorze (ziór 2.9.27 roku), nasiona przehowywane przez 1 rok w temp. 16 C (ziór 26.9.26 roku).. PodłoŜe do stratyfikaji: torf o ph 6,5 z piaskiem (1:1), perforowane worezki foliowe.. Wpływ osadzenia nasion na roślinie na dynamikę ih kiełkowania i pozątkowy wzrost siewek Do doświadzeń wykorzystano nasiona zerane w 28 roku z krzewów eleuterokoka rosnąyh w kolekji roślin leznizyh na Polu Doświadzalnym SGGW w Wilanowie. Bezpośrednio po ziorze nasiona poddano stratyfikaji w stałej temperaturze 1 C przez 18 miesięy. Osadzenie nasion: owoostany (aldahy) szzytowe, owoostany (aldahy) ozne. Ze względu na długi okres kiełkowania nasion eleuterokoka oserwaje prowadzono przez 42 dni. 2. Z SADZONEK a. Wpływ rodzaju sadzonek i zastosowanego podłoŝa na ukorzenianie i przyjmowanie się sadzonek wegetatywnyh Doświadzenie prowadzono w 27 i 28 roku w Ośrodku Szklarniowym SGGW oraz na Polu Doświadzalnym KRWiL w Wilanowie. Materiałem wyjśiowym yły organy nadziemne i podziemne pozyskane z 5-letnih krzewów eleuterokoka kolzystego rosnąyh w kolekji roślin leznizyh na Polu Doświadzalnym KRWiL w Wilanowie. Sadzonki korzeniowo-pędowe otrzymywano przez podział roślin mateznyh późną jesienią ( listopada), natomiast sadzonki pędowe i zielne przygotowano na pozątku kwietnia z rosnąyh krzewów (Ta. 1). Przedstawione wyniki stanowią średnie z 2 lat. Ta. 1. Rodzaje sadzonek i podłoŝa uŝyte do ih ukorzeniania Rodzaj sadzonek Rodzaje zastosowanyh podłoŝy Liza przygotowanyh sadzonek korzeniowo pędowe torf : piasek (2:1) 75 torf 75 korzeniowe torf : piasek (2:1) 75 torf 75 pędowe półzdrewniałe torf : piasek (2:1) 75 torf : perlit (2:1) 75 perlit 75 zielne z piętką torf : piasek (2:1) 75 torf : perlit (2:1) 75 perlit 75 zielne ez piętki torf : piasek (2:1) 75 torf : perlit (2:1) 75 perlit 75 3. W KULTURACH IN VITRO a. Otrzymywanie siewek z wyizolowanyh zarodków zygotyznyh w zaleŝnośi od składu regulatorów wzrostu w poŝywe Materiałem wyjśiowym yły nasiona eleuterokoka kolzystego zerane ezpośrednio po dojrzeniu owoów. Przed izolają zarodków nasiona yły pozawiane łupiny nasiennej i dezynfekowane. OdkaŜone nasiona przenoszono na sterylną szalkę Pertri ego i pod mikroskopem steroskopowym izolowano zarodek, który umieszzano na poŝywe agarowej. Wszystkie zynnośi wykonywano w komorze laminarnej. PoŜywką, na którą wykładano zarodki, yła zmodyfikowana poŝywka MS/B5 według Murashige i Skoog [1962] oraz według Gamorg a i wsp. [1965]. PoŜywka zawierała równieŝ agar (6,5 g l -1 ) oraz saharozę (3 g l -1 ). Przed sterylizają jej ph doprowadzano do wartośi 5,7. PoŜywka sterylizowana yła w autoklawie w temp. 121 C przez 17 min. Dodatkowo (w stęŝeniah jak poniŝej) dodano do niej regulatory wzrostu: ytokininę (BA 6-enzyloadeninę) oraz 5
auksynę (NAA kwas α-naftyloksyotowy). Jako kontrolę potraktowano poŝywkę MS/B5 ez regulatorów wzrostu. StęŜenia regulatorów wzrostu: ez regulatorów wzrostu (kontrola),,1 mg l -1 BA,,1 mg l -1 NAA,,1 mg l -1 BA,,1 mg l -1 NAA,,1 mg l -1 NAA,,1 mg l -1 BA. KaŜda szalka Pertri ego zawierała około 3 ml poŝywki. Na 1 szalkę wykładano po 1 zarodków i przenoszono do pomieszzenia hodowlanego. Szalki z wyizolowanymi zarodkami umieszzano w iemnośi na okres 2 tygodni, po zym przenoszono je na oświetloną półkę regału hodowlanego. NatęŜenie światła wynosiło 2 µmol m -2 s -1 przy fotoperiodzie 16/8. Zastosowano stałą temp. 25 C. Po 3 dniah określano lizę skiełkowanyh i prawidłowo rozwiniętyh siewek, lizę siewek nieprawidłowo rozwiniętyh lu oumarłyh oraz lizę zarodków oumarłyh. Doświadzenie przeprowadzono w 5 powtórzeniah.. Adaptaja siewek otrzymanyh in vitro do warunków ex vitro Doświadzenie prowadzono w komorah klimatyznyh. Materiałem roślinnym do załoŝenia doświadzenia yły siewki eleuterokoka uzyskane z zarodków zygotyznyh w doświadzeniu 3a. W kaŝdej kominaji wysadzano po 2 roślin do oddzielnyh pojemników o poj. 1 ml wypełnionyh podłoŝem przygotowanym z torfu i piasku zmieszanyh w proporji 2:1. Czynniki doświadzenia: poziom ph: 5,5 6, 6,5 fotoperiod: 16/8 (22/18 C) 14/1 (22/18 C) 12/12 (2/16 C) Ze względu na zyt małą ilość wyjśiowego materiału roślinnego doświadzenie przeprowadzono w 1 powtórzeniu.. Wpływ regulatorów wzrostu oraz rodzaju uŝytyh eksplantatów na otrzymywanie zarodków somatyznyh Materiałem wyjśiowym yły 6-tygodniowe siewki eleuterokoka uzyskane w doświadzeniu 3a. Dla poranyh eksplantatów zastosowano poŝywkę MS z dodatkiem 2,4D kwasu 2,4- dihlorofenoksyotowego (1 mg l -1 ) zawierająą 3 g l -1 saharozy i 6,5 g l -1 agaru. Jej ph doprowadzono do wartośi 5,7. PoŜywka sterylizowana yła w autoklawie w temp. 121 C przez 17 min. Na kaŝdą szalkę wykładano po 1 eksplantatów. Po 6 tygodniah określono lizę eksplantatów nekrotyznyh, lizę eksplantatów ze zregenerowanymi ezpośrednio na nih zarodkami somatyznymi oraz lizę eksplantatów z wytworzonym kalusem. Ze względu na zyt małą ilość wyjśiowego materiału roślinnego doświadzenie przeprowadzono w 1 powtórzeniu. Czynniki doświadzenia: Skład regulatorów wzrostu w poŝywe, na której rosły uŝyte do doświadzenia siewki (źródło eksplantatów): ez regulatorów wzrostu (kontrola),,1 mg l -1 BA,,1 mg l -1 NAA,,1 mg l -1 BA. Rodzaje uŝytyh eksplantatów: pąk wierzhołkowy, fragmenty liśieni, fragmenty hypokotyli, fragmenty korzeni. 6
V. ZróŜniowanie hemizne ekstraktów w zaleŝnośi od sposou ih otrzymywania Badania przeprowadzono na świeŝyh i wysuszonyh organah podziemnyh (kłąza i korzenie) pozyskanyh jesienią 28 roku z roślin 4-letnih. Po wykopaniu roślin, organy podziemne ozyszzono, wstępnie rozdroniono i podzielono na dwie zęśi. Pierwszą zęść (świeŝy surowie) poddano ekstrakji ezpośrednio po ziorze. Drugą zęść ekstrahowano dopiero po wysuszeniu w temp. 4 C w suszarni typu Leśnizanka. Doświadzenie przeprowadzono w 3 powtórzeniah. Czynniki doświadzenia: metoda ekstrakji: A ekstrakja iągła wyzerpująa w zautomatyzowanym aparaie Soxhleta, B ekstrakja periodyzna dwustopniowa pod hłodnią, C ekstrakja periodyzna dwustopniowa wspomagana ultradźwiękami. medium ekstrakyjne: 4% roztwór etanolu, 7% roztwór etanolu, 96% roztwór etanolu, woda. VI. Badania fitohemizne Analizę jakośiową związków fenolowyh i steroli przeprowadzono przy uŝyiu wysokosprawnej hromatografii iezowej (HPLC). VII. Analiza statystyzna wyników Analizę statystyzną przeprowadzono przy uŝyiu programu STARGRAPHICS Plus, wersja 4.1. Do opraowania wyników uŝyto testu χ 2 na niezaleŝność eh oraz metody jednozynnikowej i dwuzynnikowej analizy warianji. Do porównania średnih zastosowano test Tukey a przy załoŝonym poziomie istotnośi α=,5 lu α=,1. 7
WYNIKI I DYSKUSJA Uzyskane wyniki wyraźnie pokazują, Ŝe masa organów podziemnyh, stanowiąyh główny surowie leznizy, w sposó ardzo dynamizny wzrastała w okresie ztereh lat prowadzonyh adań, przekrazają w zwartym roku 4 g powietrznie suhej masy w przelizeniu na jedną roślinę (Wyk. 1, Fot. 1). We wstępnyh adaniah nad eleuterokokiem prowadzonyh w Finlandii masa ta w szóstym roku oserwaji osiągnęła 497 g z rośliny [Galamosi i Slaanin 28]. Innym surowem pozyskiwanym z eleuterokoka jest kora pędów [Fujikawa i in. 1996]. Na ogół pozyskuje się ją tylko z pędów 2- lu 3-letnih. W niniejszej pray masa kory pędów osiągała swoje maksimum w trzeim roku i utrzymywała się na podonym poziomie w zwartym roku wegetaji (Wyk. 2). Stwierdzono istotny przyrost masy liśi w okresie od pozątku kwitnienia do wykształania owoów, przy zym przyrost ten ył najwyŝszy u roślin 2-letnih (Wyk. 3). [g roślina -1 ] 5 4 3 2 1 a α=,5 a a d d e [g roślina -1 ] 6 5 4 3 2 1 α=,5 a a d d d d XI IV VI XI IV VI XI IV VI XI IV VI XI IV VI XI IV VI XI rośliny 1- rozne rośliny 2-letnie rośliny 3-letnie rośliny 4-letnie rośliny 2-letnie rośliny 3-letnie rośliny 4-letnie Wyk. 1. Dynamika przyrostu powietrznie suhej masy Wyk. 2. Dynamika przyrostu powietrznie suhej organów podziemnyh [g roślina -1 ] masy kory pędów [g roślina -1 ] Jednakowymi literami oznazono wartośi nieróŝniąe się istotnie na poziomie α =,5 wg testu Tukey a [g roślina -1 ] 25 2 15 1 α=,5 a 5 kwitnienia owoowania kwitnienia owoowania kwitnienia owoowania rośliny 2-letnie rośliny 3-letnie rośliny 4-letnie Wyk. 3. Dynamika przyrostu powietrznie suhej masy liśi [g roślina -1 ] Jednakowymi literami oznazono wartośi nieróŝniąe się istotnie na poziomie α =,5 wg testu Tukey a Fot. 1. Roślina 4-letnia, ziór jesienny 8
Czteroletnie adania wykonane na roślinah ędąyh w róŝnym wieku (1-, 2-, 3-, 4-letnie) pozwoliły na dokładne określenie zmian dotyząyh zawartośi tyh związków w okresie sezonu wegetayjnego, a takŝe w kolejnyh latah rozwoju ontogenetyznego eleuterokoka. Dynamika gromadzenia się w organah podziemnyh dwóh najwaŝniejszyh eleuterozydów: B i E oraz kwasu hlorogenowego jest nieomal identyzna. NiezaleŜnie od wieku roślin występują one zawsze w największyh ilośiah wzesną wiosną, w końowym okresie spozynku zimowego. Ih zawartość wyraźnie rośnie od pierwszego do zwartego roku wegetaji (Wyk. 4 i 5, Ta. 2). Zawartość kwasu rozmarynowego i protokatehinowego oraz steroli: 3-O-β-glukozydu sitosterolu (eleuterozydu A) i β- sitosterolu osiąga swoje maksimum zawsze późną jesienią i wyraźnie podnosi się z wiekiem roślin (Ta. 2). [mg 1 g s.m. -1 ] 125 1 75 5 25 α=,5 a a d [mg 1 g s.m. -1 ] 125 1 75 5 25 α=,5 a a e d XI IV VI XI IV VI XI IV VI XI rośliny 1- rozne rośliny 2-letnie rośliny 3-letnie rośliny 4-letnie XI IV VI XI IV VI XI IV VI XI rośliny 1- rozne rośliny 2-letnie rośliny 3-letnie rośliny 4-letnie Wyk. 4. Dynamika gromadzenia się eleuterozydu B Wyk. 5. Dynamika gromadzenia się eleuterozydu E w organah podziemnyh [mg 1 g s. m. -1 ] w organah podziemnyh [mg 1 g s. m. -1 ] Jednakowymi literami oznazono wartośi nieróŝniąe się istotnie na poziomie α =,5 wg testu Tukey a Ta. 2. Dynamika gromadzenia się kwasów polifenolowyh i steroli w organah podziemnyh [mg 1 g s. m. -1 ] rośliny rośliny 2-letnie rośliny 3-letnie rośliny 4-letnie 1-rozne XI IV VI XI IV VI XI IV VI XI kwas hlorogenowy 644,9 898,1 549,44 811,65 127,5 d 49,65 a 747,86 1719,3 e 35,68 a 815,12 kwas rozmarynowy 115,41 33,37 a 93,84 118,53 36,81 a 5,76 a 125,57 29,23 a 71,54 195,16 d kwas protokatehinowy 29,55 d 1,1 a 9,46 35,96 d 1,28 a 6,67 29,3 d 1,3 a 2,22 37,34 d 3-O- β-d-glukozyd 6,17 a 4,95 a 6,54 a 1,55 7,84 a 6,98 a 63,48 d 48,23 48,36 123,1 e sitosterolu (eleuterozyd A) β-sitosterol 22,3, a, a 34,14, a, a 57,26, a, a 76,19 d Jednakowymi literami oznazono w wierszah wartośi nieróŝniąe się istotnie na poziomie α =,5 wg testu Tukey a Organy podziemne eleuterokoka składają się z kłązy i korzeni. Uzyskane wyniki pokazują, Ŝe ih masa kształtuje się w stosunku 6 : 4 (Wyk. 6, Fot. 2). Ih skład hemizny wyraźnie się róŝni. Kłąza są ogatsze w eleuterozydy B i E, a korzenie w kwasy fenolowe i sterole (Ta. 3). 1% 8% 37,3 38,7 41,9 6% 4% 62,7 61,3 58,1 2% % rośliny 2-letnie rośliny 3-letnie rośliny 4-letnie kłąza korzenie Wyk. 6. Udział kłązy i korzeni w powietrznie suhej masie organów podziemnyh zeranyh późną jesienią [%] 9 Fot. 2. Organy podziemne eleuterokoka
Ta. 3. Zawartość związków iologiznie aktywnyh w kłązah i korzeniah zeranyh pod konie wegetaji roślin [mg 1 g s. m. -1 ] rośliny 2-letnie rośliny 3-letnie rośliny 4-letnie średnio kłąza korzenie kłąza korzenie kłąza korzenie kłąza korzenie eleuterozyd B 65,82 48,52 8,25 56,27 99,11 85,97 81,73** 63,59 eleuterozyd E 58,64 35,67 75,2 47,37 81,29 55,61 71,65** 46,22 kwas holorogenowy 581,52 141,77 588,64 97,7 577,71 71,47 582,62 886,44** kwas rozmarynowy 61,58 171,48 74, 157,14 82,26 154,55 72,61 161,6** kwas protokatehinowy 24,46 47,45 13,18 25,41 21,16 33,51 19,6 35,46** 3-O-β-D-glukozyd 5,5 15,59 45,71 81,24 69,6 176,42 4,27 91,8** sitosterolu (eleuterozyd A) β-sitosterol 31,11 38,16 6,6 63,91 77,18 81,2 56,3 61,9 **p<,1 Kora pędów okazała się surowem ardzo ogatym, szzególnie w eleuterozyd B, 3-O-β-D glukozyd sitosterolu (eleuterozyd A) i β-sitosterol. Zawartość tyh związków yła najwyŝsza u roślin 4-letnih w końowej fazie wegetaji roślin (Wyk.7, Ta. 4). Gromadzenie eleuterozydu E w tym surowu przeiegało podonie jak w organah podziemnyh. Bez względu na wiek roślin jego zawartość yła najwyŝsza na pozątku wegetaji, a najniŝsza w okresie kwitnienia, przy zym rośliny 4-letnie gromadziły go w największyh ilośiah (48,21 mg 1g -1 ) (Wyk. 8). NiezaleŜnie od wieku roślin zawartość kwasu hlorogenowego w korze pędów yła najwyŝsza wzesną wiosną. Kora z roślin 4-letnih harakteryzowała się największą zawartośią tego związku (128,7 mg 1 g -1 ). Kwas protokatehinowy wystąpił w największyh ilośiah w surowah zeranyh wzesną wiosną (Ta. 4). 5 4 α=,5 d d d d 6 5 α=,5 [mg 1 g s. m. -1 ] 3 2 1 a a a [mg 1 g s.m. -1 ] 4 3 2 1 a a a IV VI XI IV VI XI IV VI XI rośliny 2-letnie rośliny3-letnie rośliny 4-letnie IV VI XI IV VI XI IV VI XI rośliny 2-letnie rośliny 3-letnie rośliny 4-letnie Wyk. 7. Dynamika gromadzenia się eleuterozydu B Wyk. 8. Dynamika gromadzenia się eleuterozydu E w korze pędów [mg 1 g s. m. -1 ] w korze pędów [mg 1 g s. m. -1 ] Jednakowymi literami oznazono wartośi nieróŝniąe się istotnie na poziomie α =,5 wg testu Tukey a Ta. 4. Dynamika gromadzenia się kwasów polifenolowyh i steroli w korze pędów [mg 1 g s. m. -1 ] rośliny 2-letnie rośliny 3-letnie rośliny 4-letnie IV VI XI IV VI XI IV VI XI kwas hlorogenowy 915,46 d 451,39 849,84 88,49 d 295,58 a 742,98 128,7 d 334,32 a 81,63 kwas rozmarynowy 5,53 a 36,71 31,24 11,39 a 44,29 33,67 6,62 a 47,24 54, kwas protokatehinowy 48,9 d 29,33 45,6 d 48,6 d 19,28 a 39,36 51,28 d 28,34 39,84 3-O- β-d-glukozyd 5,84 a 34,43 39,74 14,3 16,27 64,44 e 49,73 d 78,4 f 111,41 g sitosterolu (eleuterozyd A) β-sitosterol, a, a 47,17, a, a 74,76, a, a 114,63 d Jednakowymi literami oznazono w wierszah wartośi nieróŝniąe się istotnie na poziomie α =,5 wg testu Tukey a 1
W liśiah stwierdzono oeność dwóh flawonoidów: rutozydu i hiperozydu oraz kwasów polifenolowyh: hlorogenowego, rozmarynowego i ferulowego, nie stwierdzono natomiast oenośi eleuterozydów, kwasu protokatehinowego ani steroli. NiezaleŜnie od wieku roślin zawartość rutozydu yła wyŝsza w liśiah zieranyh na pozątku kwitnienia (od 245,88 do 286,13 mg 1 g -1 ) podzas gdy liśie pozyskane na pozątku owoowania harakteryzowały się istotnie wyŝszą zawartośią hiperozydu (od 27,7 do 45,92 mg 1 g -1 ). Rośliny 2-letnie harakteryzowały się najwyŝszą zawartośią flawonoidów. Zawartość kwasu hlorogenowego, rozmarynowego i ferulowego w liśiah yła równieŝ istotnie wyŝsza na pozątku kwitnienia roślin (Ta. 5). Ta. 5. Dynamika gromadzenia się flawonoidów i kwasów fenolowyh w liśiah [mg 1 g s. m. -1 ] rośliny 2-letnie rośliny 3-letnie rośliny 4-letnie kwitnienia owoowania kwitnienia owoowania kwitnienia owoowania rutozyd 286,13 199,7 279,62 113,64 a 245,98 17,82 hiperozyd,33 a 45,92 d,19 a 11,19,38 a 27,7 kwas hlorogenowy 812,5 d 635,75 76,81 316,84 a 689,88 394,4 a kwas rozmarynowy 135,33 78,98 172,76 d 27,68 a 163,95 d 27,86 a kwas ferulowy 112,48 62,74 113,89 35,72 a 183,68 d 57,78 Jednakowymi literami oznazono w wierszah wartośi nieróŝniąe się istotnie na poziomie α =,5 wg testu Tukey a W pray podjęto równieŝ adania nad zróŝniowaniem hemiznym w oręie gatunku E. sentiosus. Badane rośliny róŝniły się znaznie pod względem masy organów podziemnyh, jak i masy kory z pędów. Wystąpiły takŝe duŝe róŝnie pod względem zawartośi wszystkih oznazonyh związków iologiznie aktywnyh (dohodziły one do kilkuset proent), z tym Ŝe róŝnie te yły znaznie większe w przypadku związków występująyh w organah podziemnyh niŝ w korze pędów (Wyk. 9-12). 6 25 5 2 [mg 1 g s. m. -1 ] 4 3 2 1 [mg 1 g s. m. -1 ] 15 1 5 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 POJEDYNKI kłąza korzenie kora z kłązy kora z korzeni 1 POJEDYNKI kłąza korzenie kora z kłązy kora z korzeni Wyk. 9. Zawartość eleuterozydu B w organah podziemnyh [mg 1 g s. m. -1 ] Wyk. 1. Zawartość eleuterozydu E w organah podziemnyh [mg 1 g s. m. -1 ] 6 4 [mg 1 g s. m. -1 ] 5 4 3 2 1 [mg 1 g s. m. -1 ] 3 2 1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 POJEDYNKI POJEDYNKI Wyk. 11. Zawartość eleuterozydu B w korze pędów [mg 1 g s. m. -1 ] Wyk. 12. Zawartość eleuterozydu E w korze pędów [mg 1 g s. m. -1 ] 11
Oeniają osiem gatunków eleuterokoka pod względem zawartośi eleuterozydów B i E oraz wyranyh kwasów polifenolowyh i flawonoidów najardziej interesująe wydają się yć E. leuorrhizus, E. henryi i E. nodiflorus: pierwszy ze względu na wysoką zawartość w organah podziemnyh zarówno eleuterozydu B (125,34 mg 1 g -1 ), jak i E (178,1 mg 1 g -1 ), a takŝe w korze pędów eleuterozydu E (23,89 mg 1 g -1 ); drugi ze względu na zawartość eleuterozydu E w organah podziemnyh ( 123,52 mg 1 g -1 ); trzei ze względu na zawartość eleuterozydów B i E w korze pędów (odpowiednio: 263,74 i 99,81 mg 1 g -1 ) (Ta. 6 i 7, Wyk. 13). O wysokiej zawartośi eleuterozydów B i E oraz kwasów polifenolowyh w pędah pohodząyh z dziko rosnąyh gatunków eleuterokoka wspominali juŝ wześniej Lee i wsp. [25], Kang i wsp. [21] oraz Nishie i wsp. [199]. Ta. 6. Zawartość związków iologiznie aktywnyh w organah podziemnyh, korze pędów i liśiah ośmiu gatunków z rodzaju Eleutheroous [mg 1 g s. m. -1 ] eleuterozyd B eleuterozyd E kwas hlorogenowy E. E. E. E. surowe E. sentiosus E. henryi leuorrhizus E. nodiflorus divariatus sessiliflorus E. giraldii sethuenensis średnio organy podziemne 17,61 d 16,89 a 125,34 d 76,67 17,21 a 45,38 35,18 38,78 57,88 kora pędów 128,1 e 54,21 96,82 d 263,74 f 13,18 a 19,9 a 39,21 46,34 82,59 liśie,,,,,,,, - organy podziemne 56,82 123,52 d 178,1 e 53,23 56,19 78,38 62,17 3,45 a 79,85 kora pędów 31,22 a 9,54 d 23,89 e 99,81 d 45,29 37,26 a 3,7 a 62,33 75,13 liśie,,,,,,,, - organy podziemne 739,9 133,8 a 1 96,79 d 583,71 34,8 a 255,32 a 56,54 39,67 a 497,88 kora pędów 43,28 e 244,19 d 492,26 f 165,54 154,47 17,9 26,72 a 542,46 g 267,1 liśie 127,29 a 63,36 d 1 271,7 f 635,59 d 567,61 394,39 981,46 e 553,29 641,76 organy 26,81 a 26,57 a 99,2 a 126,27 e 21,22 a 66,84 47,61 76,94 61,41 podziemne kwas rozmarynowy kora pędów 46, d 19,42 a 16,36 a 23,88 19,24 a 17,79 a 17,3 34,11 24,26 liśie 129,62 183,44 458,67 d 444,16 d 33,34 a 57,8 a 186,92 a 15,48 199,84 organy,,,,,,,, kwas podziemne - kora pędów protokatehinowy 1,27 a 19,9 4,62 d 21,59 44,13 d 1,88 a 17,72 16,19 a 22,56 liśie,,,,,,,, - Jednakowymi literami oznazono w wierszah wartośi nieróŝniąe się istotnie na poziomie α =,5 wg testu Tukey a [mg 1 g s. m. -1 ] 1 8 6 4 2 E. sentiosus α=,5 E D D C B a E. henryi E. leuorrhizus E. nodiflorus AB AB a A a a a E. divariatus E. sessiliflorus rutozyd hiperozyd E. giraldii E. sethuenensis Ta. 7. Zawartość eleuterozydów B i E oraz kwasów fenolowyh w owoah pięiu gatunków z rodzaju Eleutheroous [mg 1 g s. m. -1 ] eleuterozyd B E. sentiosus E. henryi E. leuorrhizus E. nodiflorus E. divariatus 35,59 a 11,9 96,91 89,63 27,8 a eleuterozyd E 29,77 87,7 d 49,4 13,68 a 64,51 d kwas 49,28 673,71 836,12 d 297,3 a 316,64 a hlorogenowy kwas rozmarynowy 84,3 57,82 a 47,54 a 169,49 34,18 a Jednakowymi literami oznazono w wierszah wartośi nieróŝniąe się istotnie na poziomie α =,5 wg testu Tukey a Wyk. 13. Zawartość rutozydu i hiperozydu w liśiah ośmiu gatunków z rodzaju Eleutheroous [mg 1 g s. m. -1 ] Jednakowymi literami oznazono wartośi nieróŝniąe się istotnie na poziomie α =,5 wg testu Tukey a 12
W dostępnej literaturze dotyząej eleuterokoka rak jest informaji na temat jego udowy anatomiznej i sposou gromadzenia związków iologiznie aktywnyh, dlatego teŝ w niniejszej pray przeprowadzono adania anatomizne organów surowowyh tej rośliny pod kątem poszukiwania struktur w któryh mogłyy yć wytwarzane i magazynowane wześniej wspomniane związki iologiznie aktywne. Na podstawie tyh adań sądzić moŝna, Ŝe większość zidentyfikowanyh przy uŝyiu HPLC sustanji iologiznie aktywnyh gromadzona jest w shizogeniznyh kanałah wydzielnizyh. Ih oeność stwierdzono we wszystkih organah (kłąza, korzenie, pędy, liśie) (Fot. 4 i 5). Kanały te róŝniły się wielkośią oraz lizą otazająyh je komórek epitelialnyh (od kilku do nawet powyŝej 2), natomiast we wszystkih kanałah oena yła wydzielina harakteryzująą się duŝą heterogennośią (Fot. 3). Najprawdopodoniej są w niej takie związki fenolowe, jak eleuterozydy B i E, a takŝe kwasy polifenolowe i flawonoidy. Fenolowy harakter związków występująyh w wydzielinie pośrednio potwierdzają wykonane analizy hemizne. Okazuje się, Ŝe w tkankah zewnętrznyh (łyko wtórne oraz peryderma), w któryh stwierdzono znaznie większą lizę kanałów wydzielnizyh (zęsto o wyraźnie większym świetle) eleuterozydy i kwasy polifenolowe występowały w większyh ilośiah. Nie moŝna równieŝ wykluzyć występowania związków iologiznie aktywnyh o harakterze fenolowym w wakuolah komórek wydzielnizyh i miękiszowyh łyka wtórnego, poniewaŝ wszystkie te komórki zawierały elektronowo gęsty materiał. Związki fenolowe harakteryzują się silną nieieską autofluoresenją. Taką właśnie wykazywała wydzielina w kanałah, przy zym jeśli występowała ona w znaznyh ilośiah, światło autofluoresenji yło prawie iałe. Ani autofluoresenja ani zastosowane arwniki nie pozwalają jednak na dokładne określenie składu wydzieliny ze względu na jej heterogenny harakter. Potrzene są do tego adania histohemizne, które autorka przewiduje prowadzić w dalszyh praah nad eleuterokokiem kolzystym. Fot. 4. Shizogenizny ziornik wydzielnizy w łyku wtórnym kłązy (strzałka ziornik wydzielnizy, gwiazdki druzy, skala 1 µm) Fot. 3. Komórki epitelialne otazająe ziornik shizogenizny kłązy (rozeta zarna heterogenna wydzielina w świetle ziornika wydzielnizego, rozeta iała - gloularne złogi pohodnyh fenolowyh w wakuoli, główki strzałek ysterny endoplazmatyznego retikulum, podwójne główki strzałek aktywność egzoytotyzna przy antyklinalnyh śianah komórek epitelialnyh, skala 5 µm) Fot. 5. Shizogenizny ziornik wydzielnizy w łyku wtórnym korzeni (strzałka fellogen, strzałka smukła ziornik wydzielnizy, skala 1 µm) LB iała tłuszzowe R promień łykodrzewny SPh łyko wtórne V wakuole 13
Rośliny z rodzaju Araliaeae, w tym eleuterokok, harakteryzują się stosunkowo niewielką zdolnośią reprodukyjną [Shrietier 1976]. Zarówno generatywne, jak i wegetatywne rozmnaŝanie eleuterokoka jest mało efektywne [Zhu i Wang 1992]. W warunkah naturalnyh nasiona kiełkują słao, na ogół dopiero po kilku latah, po okresie naturalnej stratyfikaji [You i in. 25, Choi i in. 1999, Park i wsp. 1997, Isoda i Shoji 1994, Zhu i Wang 1992]. Badania nad rozmnaŝaniem eleuterokoka podjęte w tej pray dotyzyły zarówno nasion, jak i materiału wegetatywnego. Nasiona pohodziły z 4-letnih roślin uprawianyh na Polu Doświadzalnym KRWiL. Z tyh samyh roślin pozyskiwany ył materiał wegetatywny z organów nadziemnyh i podziemnyh. Nasiona pozyskane ezpośrednio po dojrzeniu owoów kiełkowały dopiero po kilku miesiąah stratyfikaji, a ih zdolność kiełkowania nie przekrazała 4%, natomiast nasiona przehowywane przez 1 rok nie kiełkowały w ogóle (Wyk. 14). Nasiona pohodząe z owoostanów szzytowyh harakteryzowały się wyraźnie wyŝszą zdolnośią kiełkowania w porównaniu z owoostanami oznymi (Wyk. 15). Uzyskane z nih siewki yły dorodniejsze i lepiej przyjmowały się w polu. 4, 5, 3, 4, [%] 2, 1, [%] 3, 2, 1,, 1 4 7 1 13 16 19 22 25 28 31 34 37 4, 1 4 7 1 13 16 19 22 25 28 31 34 37 4 Dzień od wysiewu stratyfikaja ieplno - hłodna w worezkah foliowyh stratyfikaja ieplno - hłodna w torfie z piaskiem stratyfikaja iepła w worezkah foliowyh stratyfikaja iepła w torfie z piaskiem kontrola Wyk. 14. Wpływ sposou stratyfikaji nasion i uŝytego do tego zaiegu podłoŝa na dynamikę ih kiełkowania [%] Dzień od wysiewu nasiona pohodząe z owoostanów szzytowyh nasiona pohodząe z owoostanów oznyh Wyk. 15. Wpływ osadzenia nasion na roślinie na dynamikę ih kiełkowania [%] Próy prostego wegetatywnego rozmnaŝania eleuterokoka, wykonane w tej pray, polegały na sprawdzeniu przydatnośi sześiu rodzajów sadzonek z nadziemnyh i podziemnyh zęśi roślin. Znaząą zdolność do ukorzeniania wykazały tylko sadzonki z organów podziemnyh, a w szzególnośi sadzonki korzeniowo-pędowe, które równieŝ lepiej rosły po ih wysadzeniu w pole (Ta. 8). Ta. 8. Wpływ rodzaju sadzonek i zastosowanego podłoŝa na ukorzenianie i przyjmowanie się sadzonek wegetatywnyh [%] Rodzaj sadzonek Rodzaje zastosowanyh podłoŝy % ukorzenionyh i ulistnionyh roślin % przyjętyh roślin w warunkah polowyh korzeniowo pędowe torf : piasek 71,3 84,8 torf 64,7 92,7 korzeniowe torf : piasek 42, 79,2 torf 35,3 78,9 pędowe półzdrewniałe torf : perlit 6, 1, torf : piasek 6, 66,7 perlit 8, 1, zielne z piętką torf : perlit, - torf : piasek 5, 1, perlit 5,, zielne ez piętki torf : perlit 5,, torf : piasek 5, 1, perlit 1, 5, 14
W kulturah in vitro adano rozwój zarodków zygotyznyh i somatyznyh na poŝywkah stałyh. Największą lizę prawidłowo wykształonyh siewek z wyizolowanyh zarodków zygotyznyh uzyskano na poŝywe zawierająej,1 mg l -1 BA i,1 mg l -1 NAA (empiryzna wartość statystyki χ 2 dla zaleŝnośi pomiędzy lizą zarodków zygotyznyh rozwijająyh się w prawidłowo wykształone siewki, a rodzajem i stęŝeniem regulatorów wzrostu w poŝywe wyniosła χ 2 (1)=19,3, p=,3, wyk. 16). Siewki te następnie przystosowywano do warunków ex vitro, adają wpływ fotoperiodu oraz rodzaju i ph podłoŝa na lizę prawidłowo zaadaptowanyh ex vitro roślin. Proesowi temu najardziej sprzyjał fotoperiod o długośi dnia 16 h i podłoŝe składająe się z torfu i piasku o ph 5,5 (Ta. 9). [%] 7 6 5 4 3 2 1 ez hormonów,1ba,1naa,1ba,1naa,1naa,1ba,1ba Ta. 9. Udział siewek zaadaptowanyh do warunków ex vitro [%] fotoperiod ph 6,5 6, 5,5 średnio 16/8 75 7 9 78 14/1 55 45 75 58 12/12 65 55 75 65 średnio 65 57 8 siewki prawidłowo wykształone siewki nieprawidłowo wykształone lu omarłe zarodki oumarłe Wyk. 16. Wpływ regulatorów wzrostu na kiełkowanie zarodków zygotyznyh i rozwój siewek [%] Największą lizę zarodków somatyznyh uzyskano z fragmentów hypokotyli pohodząyh z siewek rosnąyh na poŝywe ez regulatorów wzrostu (Ta. 1). Badania nad otrzymywaniem roślin z tyh zarodków są w dalszym iągu prowadzone. Ta. 1. Wpływ regulatorów wzrostu i eksplantatów na tworzenie się zarodków somatyznyh Regulatory wzrostu w poŝywe na której rosły siewki (źródło eksplantatów) Rodzaj eksplantatu % eksplantatów ze zregenerowanymi zarodkami somatyznymi % eksplantatów z wytworzonym kalusem % eksplantatów nekrotyznyh ez regulatorów wzrostu,1 BA,1 NAA,1 BA Liza zregenerowanyh zarodków somatyznyh pąk wierzhołkowy 35 2 45 38 fragment liśienia 1 fragment hypokotyla 7 2 1 64 fragment korzenia 1 2 7 21 pąk wierzhołkowy 6 4 - fragment liśienia 1 - fragment hypokotyla 2 5 3 39 fragment korzenia 4 6 - pąk wierzhołkowy 1 - fragment liśienia 1 - fragment hypokotyla 5 5 - fragment korzenia 1-15
Badania nad składem hemiznym ekstraktów z eleuterokoka przeprowadzono w elu odniesienia uzyskanyh wyników do stosowanyh tehnologii w przemyśle fitofarmaeutyznym. Okazało się, Ŝe najefektywniejszym rozpuszzalnikiem w przypadku eleuterozydów B i E jest 7% roztwór alkoholu etylowego. NiezaleŜnie od uŝytego medium ekstrakyjnego i rodzaju uŝytego surowa najardziej wydajnym sposoem ekstrakji yła ekstrakja iągła w zautomatyzowanym aparaie Soxhleta (Ta. 11 i 12). Ta. 11. Zawartość eleuterozydu B w ekstraktah w zaleŝnośi od zastosowanej metody ekstrakji i rozpuszzalnika [mg 1 g s. m. -1 ] Surowie Rodzaj ekstrakji Medium ekstrakyjne średnio etanol 4% etanol 7% etanol 96% woda świeŝy aparat Soxhleta 17,1 149,37 58,21 14,99 14,92 pod hłodnią zwrotną 66,76 86,97 73,47 98,97 81,54 ultradźwięki 69,68 79,43 38,84 77,29 66,31 a powietrznie suhy średnio 81,18 15,26 56,84 a 93,75 84,26 aparat Soxhleta 129,75 137,47 8,63 117,22 116,27 pod hłodnią zwrotną 9,4 117,17 56,26 86,38 87,46 a ultradźwięki 8,87 1,26 31,13 88,97 75,31 a średnio 1,22 118,3 56,1 a 97,52 93,1 Jednakowymi literami oznazono wartośi nieróŝniąe się istotnie na poziomie α =,5 wg testu Tukey a Ta. 12. Zawartość eleuterozydu E w ekstraktah w zaleŝnośi od zastosowanej metody ekstrakji i rozpuszzalnika [mg 1 g s. m. -1 ] Surowie Rodzaj ekstrakji Medium ekstrakyjne średnio etanol 4% etanol 7% etanol 96% woda świeŝy aparat Soxhleta 74,63 77,64 36,99 53,45 6,68 pod hłodnią zwrotną 39,49 69,36 35,46 61,7 51,5 ultradźwięki 41,1 45, 22,99 34,62 35,91 a średnio 51,71 a 64, 31,81 a 49,92 a 49,36 powietrznie aparat Soxhleta 78,39 79,32 37,31 63,73 64,69 suhy pod hłodnią zwrotną 51,77 61,47 26,22 4,53 45, ultradźwięki 38,6 49,99 13,24 35, 34,21 a średnio 56,25 a 63,59 25,59 a 46,42 a 47,97 Jednakowymi literami oznazono wartośi nieróŝniąe się istotnie na poziomie α =,5 wg testu Tukey a Wyniki kilkuletnih adań przedstawione w tej pray ardzo wyraźnie wskazują, Ŝe eleuterokok kolzysty moŝe yć uprawiany w Polse. W trzeim lu zwartym roku wegetaji roślin uzyskać moŝna wysoki plon surowa o jakośi przewyŝszająej nawet ofijalnie przyjęte w krajah europejskih standardy. Uzyskane wyniki dotyząe sposoów rozmnaŝania roślin wskazują takŝe na moŝliwość uzyskania zróŝniowanego materiału sadzonkowego, w tym pohodząego z kultur in vitro. 16
WNIOSKI 1. Dynamika przyrostu masy podziemnyh i nadziemnyh organów surowowyh w okresie ztereh lat rozwoju roślin yła róŝna. Masa organów podziemnyh (kłązy z korzeniami) rosła z upływem lat i osiągnęła najwyŝszą wartość w zwartym roku wegetaji roślin. Masa kory pędów rosła istotnie w okresie od wiosny do jesieni i osiągała swoje maksimum w trzeim roku wegetaji. Masa w pełni wykształonyh i zdrowyh liśi yła zawsze najwyŝsza w pozątkowym okresie tworzenia się owoów i osiągała swoje maksimum w trzeim roku wegetaji. 2. Organy surowowe róŝniły się składem oraz dynamiką gromadzenia się związków iologiznie aktywnyh. W organah podziemnyh w roznyh yklah rozwojowyh zawartość eleuterozydów B i E yła zawsze najwyŝsza w końowym okresie spozynku roślin ( kwietnia). Rośliny 4- letnie harakteryzowały się najwyŝszą zawartośią tyh związków. Wśród pięiu zidentyfikowanyh w organah podziemnyh kwasów polifenolowyh dominował kwas hlorogenowy. Jego zawartość yła zawsze najwyŝsza w końowym okresie spozynku roślin ( kwietnia) i wzrastała w kolejnyh latah wegetaji. Zawartość pozostałyh kwasów fenolowyh yła kilka razy niŝsza. NiezaleŜnie od wieku roślin kwasy rozmarynowy i protokatehinowy gromadziły się w największyh ilośiah na pozątku zimowego spozynku roślin (listopad). W korze pędów dynamika gromadzenia się eleuterozydów B i E yła podona jak w organah podziemnyh, z tym Ŝe zawartość eleuterozydu B w korze pędów yła około trzykrotnie wyŝsza. W korze pędów, podonie jak w organah podziemnyh, dominująym kwasem fenolowym ył kwas hlorogenowy. Zarówno w organah podziemnyh, jak i w korze pędów zidentyfikowano sześć związków sterolowyh, wśród któryh dominował 3-O-β-D-glukozyd sitosterolu (eleuterozyd A). Ih zawartość w tyh organah wyraźnie rosła od wiosny do późnej jesieni i yła najwyŝsza w roślinah 4-letnih. W liśiah stwierdzono oeność sześiu związków fenolowyh, w tym dwóh flawonoidów i trzeh kwasów fenolowyh, przy wyraźnej dominaji kwasu hlorogenowego i rutozydu. 3. Organy podziemne składają się z wyraźnie wykształonyh kłązy i korzeni. Ih udział w ogólnej masie organów podziemnyh wynosił odpowiednio 6 i 4%. Organy te róŝniły się wyraźnie zawartośią związków iologiznie zynnyh. Kłąza w porównaniu z korzeniami zawierały istotnie więej eleuterozydów B i E oraz istotnie mniej eleuterozydu A (3-O-β-D-glukozydu sitosterolu), kwasów hlorogenowego, rozmarynowego i protokatehinowego. 4. Szzegółowe adania anatomizne wskazują, Ŝe najwaŝniejsze związki iologiznie aktywne eleuterokoka kolzystego o harakterze fenolowym, w tym eleuterozydy B i E, występują w heterogennej wydzielinie gromadzonej w shizogeniznyh kanałah oraz wakuolah komórek epitelialnyh i miękiszowyh łyka wtórnego. 5. Zarówno w oręie gatunku E. sentiosus jak i rodzaju Eleutheroous, stwierdzono ardzo duŝe zróŝniowanie pod względem zawartośi wszystkih zidentyfikowanyh związków iologiznie aktywnyh. 6. Biorą pod uwagę zawartość waŝnyh z farmakologiznego punktu widzenia związków, szzególna uwaga w dalszyh adaniah powinna yć zwróona, poza eleuterokokiem kolzystym, na E. leuorrhizus, E. nodiflorus i E. henryi. 7. Eleuterokok kolzysty harakteryzuje się niewielką zdolnośią reprodukyjną. W warunkah uprawy w Polse znaząą, jak na ten gatunek, zdolność kiełkowania wykazują nasiona pohodząe z owoostanów szzytowyh (około 36%). Organy wegetatywne mają niewielką zdolność do ukorzeniania. Spośród sześiu rodzajów sadzonek z nadziemnyh i podziemnyh zęśi roślin tylko sadzonki korzeniowo-pędowe przyjmowały się w polu w zadawalająy sposó (około 45%). Najwięej prawidłowo wykształonyh siewek z wyizolowanyh zarodków zygotyznyh uzyskano na poŝywe agarowej z regulatorami wzrostu: BA (,1 mg l -1 ) i NAA (,1 mg l -1 ). 17
Spośród ztereh uŝytyh rodzajów eksplantatów największą lizę zarodków somatyznyh uzyskano na fragmentah hypokotyli pohodząyh z siewek rosnąyh na poŝywe ez regulatorów wzrostu. 8. Analiza ilośiowo-jakośiowa ekstraktów uzyskanyh przy uŝyiu trzeh metod ekstrakyjnyh i ztereh rozpuszzalników wykazała Ŝe: zawartość wszystkih oznazonyh związków iologiznie aktywnyh yła najwyŝsza w ekstraktah uzyskanyh przy zastosowaniu ekstrakji iągłej wyzerpująej, najardziej efektywnym medium ekstrakyjnym okazał się 7% alkohol etylowy. 9. Uprawa eleuterokoka kolzystego w Polse jest moŝliwa, a jakość uzyskanyh surowów, mierzona przede wszystkim zawartośią eleuterozydów B, E i A, jest ardzo wysoka. 18
PIŚMIENNICTWO British Pharmaopoeia Online.: 28. Eleutheroous. http://www.pharmaopoeia.o.uk. Choi Y.E, Kim J.W., Yoon E.S.: 1999. High frequeny of plant prodution via somati emryogenesis from allus or ell suspension ultures in Eleutheroous sentiosus. Annals of Botany 83: 39-314. Farmakopea Europejska.: 21. Eleutheroous. Counil of Europe, Strasourg: 762. Fujikawa T., Yamaguhi A., Morita I., Takeda H., Nishie S.: 1996. Protetive effets of Aanthopanax sentiosus Harms from Hokkaido and its omponents on gastri uler in restrained old water stressed rats. Biologial and Pharmaeutial Bulletin 19(9): 1227-123. Galamosi B., Slaanin I.: 28. Cultivation experienes with Eleutheroous sentiosus during 1994-26 in Mikkeli, Finland. W: Book of Astrats, Phytopharm. 12 th International Congress 2-4 July, 28. St. Petersurg, Russia: 42. Gamorg O.L., Miller R.A., Ojima K.: 1965. Nutrient requirements of suspension ultures of soyean ell ultures. Experimental Cell Researh 5: 151-158. Isoda S., Shoji J.: 1994. Studies on ultivation of Eleutheroous sentiosus Maxim. (II) On the germination and raising of sidling. Natural Mediine 48: 75-81. Kang J.S., Linh P.T., Cai X.F., Kim H.S., Lee J.J., Kim Y.H.: 21. Quantitive determination of eleutheroside B and E from Aanthopanax speies y high performane liquid hromatography. Arhives of Pharmaal Researh 24(5): 47-411. Lee S-H., Kang S-S., Cho S-H., Ryu S-N., Lee B-J.: 25. Determination of eleutherosides B and E in various parts of Aanthopanax speies. Korean Journal of Pharmaognosy 36(2): 7-74. Murashige T., Skoog F.: 1962. A revised medium for rapid growth and ioassays with toao tissue ultures. Plant Physiology 15(3): 473-497. Nishie S., Kinoshita H., Takeda H., Okano G.: 199. Phenoli ompounds from stem ark of Aanthopanax sentiosus and their pharmaologial effet in hroni swimming stressed rats 38(6): 1763-1765. Park H.K., Park M.S., Kim T.S., Kim S., Choi K.G., Park K.H.: 1997. Charateristis of emryo growth and dehisene during the after-ripening period in Eleutheroous sentiosus. Korean Journal of Crop Sienes 42: 637-677. Shrietier A.C.: 1976. Svoodnojagodnik koljučij. W: Cikov P.S. (red): Atlas arealov i resursov lekarstviennyh rastienij SSSR. Gosudarstviennoe Izdatiel stvo Mediinskoj Literatury, Moskva: 252. You X.L., Choi Y.E., Yi J.S.: 25. Rapid in vitro germination of zygoti emryos via endosperm removal in Eleutheroous sentiosus. Journal of Plant Biotehnology 7(1): 75-8. Zhu N., Wang Y.H.: 1992. Reprodutive eologial studies of Aanthopanax sentiosus (II) Seed dispersal, seed ank and reruitment. Journal of Northeast Forestry University 2: 13-17. 19