polski przeglą d otorynolaryngologiczny 3 (2014) 254 258 Dostępne online www.sciencedirect.com ScienceDirect journal homepage: www.elsevier.com/locate/ppotor Streszczenie pracy doktorskiej/summary of doctoral thesis Analiza amplifikowanych regionów chromosomów zawierających potencjalne onkogeny w płaskonabłonkowym nowotworze krtani Analysis of amplified chromosomal regions containing potential oncogenes in laryngeal squamous cell carcinoma Słowa kluczowe: amplifikacje onkogeny płaskonabłonkowy rak krtani gen wiodący Keywords: Amplifications Oncogenes Laryngeal squamous cell carcinoma Driver gene Rozprawa na stopień naukowy doktora nauk medycznych Poznań 13.06.2014 Promotor: prof. dr hab. Krzysztof Szyfter (Instytut Genetyki Człowieka PAN, Poznań) Recenzenci: prof. dr hab. Janusz Błasiak (Uniwersytet Łódzki) dr hab. Jarosław Markowski (Śląski Uniwersytet Medyczny, Katowice) Nowotwór, w tym również rak krtani, powstaje pod wpływem zmian genetycznych i epigenetycznych zachodzących w różnych genach, między innymi w protoonkogenach. Produkty białkowe protoonkogenów biorą udział we wzroście, proliferacji, różnicowaniu i śmierci komórki. Jednym z mechanizmów prowadzących w komórkach rakowych do nadmiernej ekspresji protoonkogenów jest amplifikacja określonych regionów chromosomowych. Stąd wykrycie genów amplifikowanych w rakach krtani może mieć znaczenie diagnostyczne, prognostyczne i terapeutyczne dla pacjentów obarczonych chorobą. Geny do analizy zostały wybrane na podstawie wyników uzyskanych metodą mikromacierzy array-cgh (wysokorozdzielcza hybrydyzacja porównawcza genomów) dla 11 linii komórkowych płaskonabłonkowego raka krtani. W niniejszej pracy skoncentrowano uwagę na regionach potencjalnie zawierających protoonkogeny, gdzie odnotowano przyrost liczby kopii DNA. Na tej podstawie wyselekcjonowano trzy powtarzające się wróżnych liniach regiony chromosomowe: region 3q25 q29 (linie UT-SCC 6A, 22, 34, 57, 107, 11); region 11q13 (linie UT-SCC 11, 22, 29, 57, 107) oraz Tabela I Zestawianie wyników z dodatkowymi kopiami DNA analizowanych genów Table I The results of additional copy number DNA analysed genes Region Nazwa genu Liczba linii komórkowych oraz guzów krtani z dodatkowymi kopiami DNA 3q25 q29 CCNL1 53/80 66,3 * PIK3CA 46/80 57,5 * THPO 31/80 38,8 MAP3K13 41/80 51,3 * MUC20 22/80 27,5 MUC4 7/80 8,8 11q13 FADD 46/80 57,5 * PPFIA1 44/80 55,0 * CTTN 34/80 42,5 22q11 CRKL 15/80 18,8 MAPK1 8/80 10 * wyniki istotne statystycznie (p < 0,05). %
polski przeglą d otorynolaryngologiczny 3 (2014) 254 258 255 region 22q11 (linie UT-SCC 6A, 11). Region 3q25 q29 obejmuje 41,287,225 pz i zawiera 102 geny. Region 11q13.2 q13.3 obejmuje 1,426,358 pz i zawiera 11 genów. Region 22q11.21 obejmuje 985,480 pz i zawiera 15 genów. W celu ustalenia regionu chromosomowego i wielkości obszaru posługiwano się bazą Human Genome Browser NCBI 2006_hg18. Ponieważ w każdym z wyselekcjonowanych regionów znajduje się wiele genów, zatem wybór kandydatów do analizy oparto na najwyższej wartości współczynnika log2ratio oraz danych z literatury. W niniejszej pracy do dalszej analizy wybrano sześć genów: CCNL1, PIK3CA, THPO, MAP3K13, MUC20, MUC4 z regionu 3q25 q29, trzy geny: CTTN, PPFIA1, FADD zregionu 11q13 oraz dwa geny: MAPK1, CRKL z regionu 22q11. [(Ryc._1)TD$FIG] Celem rozprawy doktorskiej była analiza wybranych genów z wyżej wymienionych trzech regionów chromosomów, pod kątem sprawdzenia dodatkowych kopii DNA, ekspresji oraz korelacji liczby kopii z ekspresją. Ponadto określono związek amplifikacji i nadekspresji wybranych genów z parametrami klinicznymi i stopniem złośliwości guza. Powyższe cele zrealizowano przy wykorzystaniu metody PCR w czasie rzeczywistym do matrycy DNA (określenie liczby kopii genu) oraz do matrycy cdna (określenie ekspresji mrna). Materiał do badań stanowił zestaw 17 ustabilizowanych linii komórkowych wyprowadzonych z płaskonabłonkowych raków krtani (prof. R. Grenmana, Turku, Finlandia) oraz 63 Ryc. 1 Lokalizacja dodatkowych kopii genów regionu 3q25 29 w linii UT-SCC 6A. Strzałką przerywaną oznaczono izochromosomy, strzałką ciągłą chromosomy pochodne. (A) Sonda RP11 245C23 PIK3CA (czerwona), RP 171N2 MUC20 (zielona), CEP 3 (niebieska) (B) Sonda RP11 245C23 PIK3CA (czerwona), RP11 2268P20 MUC4 (zielona), CEP 3 (niebieska) (C) Sonda RP11 125E8 THPO (zielona), 3p telomer RP11 1186B18 (czerwona) (D) Sonda RP11 2302E16 CCNL1 (zielona), 3p telomer RP11 1186B18 (czerwona) Fig. 1 Additonal copy number genes in 3q25-29 chromosomal region UT-SCC 6A cell line
256 polski przeglą d otorynolaryngologiczny 3 (2014) 254 258 wycinki z guza pobrane podczas operacji laryngektomii z płaskonabłonkowych raków krtani (dr Anna Bartochowska, prof. W. Szyfter, Poznań, Polska). Z przeprowadzonych doświadczeń wykonanych techniką PCR w czasie rzeczywistym do matrycy DNA wynika, że dodatkowe kopie DNA obserwowano istotnie statystycznie częściej w grupie pacjentów w porównaniu z grupą kontrolną [(Ryc._2)TD$FIG] dla genów: CCNL1, PIK3CA, MAP3K13 z regionu 3q25 q29 oraz FADD i PPFIA z regionu 11q13 (Tab. I). Analiza statystyczna uwzględniająca parametry kliniczne TNM i histologiczne G dla grup z nadekspresją i z normalną ekspresją genu PIK3CA wykazała, że w grupie o niskim stopniu złośliwości (G1 + G2) obserwowano tendencję do częstszej nadekspresji genu PIK3CA w porównaniu z guzami Ryc. 2 Lokalizacja dodatkowych kopii genów regionu 3q25 29 w linii UT-SCC 22. Strzałką oznaczono chromosomy pochodne. Sonda 3p telomer RP 1186B16 (czerwona), sonda badana zielona: (A) RP11 245C23 PIK3CA (B) RP11 2302E16 CCNL1 (C) RP11 125E8 THPO (D) RP11 171N2 MUC20 Fig. 2 Additional copy number genes in 3q25-29 chromosomal region UT-SCC-22 cell line
polski przeglą d otorynolaryngologiczny 3 (2014) 254 258 257 o najwyższym stopniu złośliwości (G3) (wynik na granicy istotności statystycznej, p = 0,067). Wykorzystując powyższe wyniki wykonane metodą PCR w czasie rzeczywistym, sprawdzono korelację liczby kopii DNA i ich ekspresji przez wykonanie analizy zależności przy użyciu testu Pearsona. Wykazano silną korelację pomiędzy liczbą kopii DNA a ekspresją mrna dla genów CRKL (0,994) oraz FADD (0,585) zarówno w liniach komórkowych, jak i w guzach krtani. Obydwa geny, CRKL i FADD, które wykazały najsilniejszą korelację, poddano analizie statystycznej obejmującej dane kliniczne pacjentów (TNM i G). Zaobserwowano tendencję do częstszego występowania dodatkowych kopii DNA genu FADD (wynik na granicy istotności statystycznej, p = 0,065) w grupie o niskim stopniu złośliwości (G1 + G2) w porównaniu z guzami o najwyższym stopniu złośliwości (G3). Dla wybranych genów wykonano dodatkowe analizy: fluorescencyjną hybrydyzację in situ (dla genów regionu 3q25 q29), pirosekwencjonowanie i sekwencjonowanie metodą Sangera (dla genu PIK3CA) oraz analizę immunohistochemiczną (dla białka CRKL). Fluorescencyjną hybrydyzację in situ (FISH) wykonano w celu lokalizacji nadliczbowych kopii badanych genów oraz określenia aberracji chromosomowych. Szczegółowa analiza wykazała heterogenność aberracji w obrębie regionu 3q25 q29 (Ryc. 1 i 2). Najczęściej obserwowano: 1) chromosomy pochodne powstające w wyniku translokacji chromosomu 3 z innymi chromosomami, 2) izochromosomy ramion q chromosomu 3 oraz 3) zmiany liczby prawidłowych chromosomów pary 3. Kolejną analizą dodatkową objęto genpik3ca, gdyż wykazano, że zpośród wszystkich analizowanych genów najczęściej ulega nadekspresji. Wykazano również jego silną korelację pomiędzy liczbą kopii DNA a ekspresją mrna w liniach komórkowych, której nie potwierdzono w wycinkach guzów krtani. Poszukiwano zatem mutacji aktywujących, które mogą być, oprócz wykazanej amplifikacji, mechanizmem [(Ryc._3)TD$FIG] powodującym obserwowaną nadekspresję. W celu znalezienia mutacji wykonano reakcję pirosekwencjonowania fragmentu eksonu 9, gdyż zawiera on literaturowo potwierdzone dwie najczęściej występujące w genie PIK3CA mutacje 1624G>A (E542K) i 1633G>A (E545K). Znaleziono heterozygotyczną mutację 1633G>A w jednym z badanych przypadków wycinka guza (MK 15) (Ryc. 3). Mutacja ta została następnie potwierdzona metodą sekwencjonowania techniką Sangera. Przy jednoczesnym braku dodatkowych kopii DNA genu PIK3CA można wnioskować, że wykryta mutacja aktywująca odpowiada za nadekspresję tego genu w badanym przypadku. Otrzymane wyniki pozwalają wnioskować, że amplifikacja i mutacja aktywująca to dwa niezależne mechanizmy prowadzące do nadekspresji genu PIK3CA. Analizę immunohistochemiczną wykonano dla genucrkl. Poziom i lokalizację białka kodowanego przez ten gen oceniono z uwagi na najsilniejszą korelację pomiędzy liczbą kopii DNA i ekspresją mrna tego genu. Wykonane analizy immunohistochemiczne potwierdziły wysoki poziom białka w liniach komórkowych o silnej amplifikacji i wysokiej nadekspresji mrna. Dodatkowo wykazano częstszą lokalizację jądrową w liniach wykazujących wyższy poziom białka, co może stanowić o jego aktywności. Następnie sprawdzono poziom białka CRKL na materiale pochodzącym z wycinków guza krtani. We wszystkich analizowanych przypadkach zaobserwowano słaby odczyn cytoplazmatyczny białka CRKL, a w 25% również dodatni jądrowy odczyn oznaczanego białka. Jednakże nie uzyskano statystycznie istotnych zależności pomiędzy grupami z obecnością ekspresji jądrowej i jej brakiem. Przeprowadzone badania pozwalają wskazać geny wiodące (driver gene) w każdym z silnie amplifikowanych regionów. Gen PIK3CA uznano za wiodący dla regionu 3q25 q29. Nadekspresja PIK3CA w badanych przypadkach raka krtani może być spowodowana dwoma niezależnymi mechanizmami: obecnością dodatkowych kopii DNA lub rzadziej mutacją aktywującą 1633G>A. Ponadto analiza przeprowadzona Ryc. 3 Pirogram przedstawiający zmianę odczytu w miejscu potencjalnej mutacji 1633G>A, z wycinka guza pacjenta MK15 Fig. 3 Pirogram with the potential mutation site 1633G>A (MK15 tumor)
258 polski przeglą d otorynolaryngologiczny 3 (2014) 254 258 woparciuofluorescencyjną hybrydyzację in situ pozwoliła na wskazanie kilku mechanizmów powstawania dodatkowych kopii genów, z których najczęstszym było występowanie chromosomów pochodnych zawierających badany fragment chromosomu pary 3. Za gen wiodący amplifikacji regionu 11q13 uznano gen FADD, natomiast dal regionu 22q11 rolę tę pełni gen CRKL. Jako główny mechanizm nadekspresji genów FADD i CRKL wskazano występowanie dodatkowych kopii tych genów. Natomiast zaobserwowana lokalizacja jądrowa białka CRKL w liniach komórkowych i w wycinkach guza może sugerować patogenną aktywację tego białka w przebiegu choroby nowotworowej. Przeprowadzone badania poszerzają rozumienie biologii molekularnej raków krtani poprzez wykazanie roli określonych genów w przebiegu choroby. Tekst pracy liczy: 129 stron i zawiera 39 tabel, 25 rycin oraz 178 pozycji piśmiennictwa. Konflikt interesu/conflict of interest Nie występuje. Finansowanie/Financial support Grant Ministerstwa Nauki i Szkolnictwa Wyższego nr N 401 192 32/4031 (kierownik: prof. med. dr hab. Krzysztof Szyfter) Grant Ministerstwa Nauki i Szkolnictwa Wyższego nr NN 403 455 939 (kierownik: mgr inż. Magdalena Kostrzewska- Poczekaj) Projekt pt.,,wsparcie stypendialne dla doktorantów na kierunkach uznanych za strategiczne z punktu widzenia rozwoju Wielkopolski realizowanego w latach 2012 2013 przez Wojewódzki Urząd Pracy w Poznaniu w ramach Programu Operacyjnego Kapitał Ludzki finansowanego ze środków Europejskiego Funduszu Społecznego przyznany doktorantce M. Kostrzewskiej-Poczekaj. Etyka/Ethics Treści przedstawione w artykule są zgodne z zasadami Deklaracji Helsińskiej, dyrektywami EU oraz ujednoliconymi wymaganiami dla czasopism biomedycznych. Magdalena Kostrzewska-Poczekaj* Instytut Genetyki Człowieka Polskiej Akademii Nauk, Poznań, Polska *Adres do korespondencji: Instytut Genetyki Człowieka Polskiej Akademii Nauk, ul. Strzeszyńska 32,60-479 Poznań, Polska. Tel.: +48 61 657 91 00; fax: +48 61 823 32 35 Adres email: magkos@man.poznan.pl Otrzymano: 15.10.2014 Zaakceptowano: 21.10.2014 Dostępne online: 01.11.2014 http://dx.doi.org/10.1016/j.ppotor.2014.10.006 2084-5308/