Sesja sponsorowana przez Olympus Optical Polska SESJA 8 DIAGNOSTYKA GENETYCZNA. TERAPIA GENOWA WYKŁADY

Sesja sponsorowana przez Olympus Optical Polska SESJA 8 DIAGNOSTYKA GENETYCZNA. TERAPIA GENOWA WYKŁADY

180 SESJA 8 WYKŁADY W08-01 DIAGNOSTYKA MOLEKULARNA-METODY WYKRYWANIA MUTACJI W GENACH Włodzimierz J. Krzyżosiak, Piotr Kozłowski, Anna Jasińska, Marta Birak, Krzysztof Sobczak Instytut Chemii Bioorganicznej PAN, Poznań Nowe tendencje w diagnostyce genetycznej chorób człowieka ukazane są z perspektywy poznanej sekwencji ludzkiego genomu i zaawansowanych badań nad jego polimorfizmem. Przedstawiony jest postęp w poznawaniu związków między genami i chorobami oraz rozwój metod wykrywania mutacji w genach, któremu towarzyszy miniaturyzacja aparatury i skokowy wzrost możliwości jednoczesnego prowadzenia wielu analiz. Na przykładzie badań genów BRCA1 i BRCA2 pokazana jest droga prowadząca od odkrycia genu poprzez opracowanie testu genetycznego do jego wykorzystania w działaniach profilaktycznych i praktyce klinicznej. Przedstawione są również kierunki i podsumowane wyniki badań własnych genów BRCA1 i BRCA2 prowadzonych od kilku lat w Pracowni Genetyki Nowotworów IChB PAN. Główne nurty tych badań obejmowały wykrywanie mutacji predysponujących do choroby nowotworowej w grupie podwyższonego ryzyka, ulepszanie najczęściej stosowanych metod wykrywania mutacji w genach, analizępowszechnych wariantów polimorficznych i rzadkich wariantów sekwencji w aspekcie ich związku z ryzykiem raka piersi oraz badanie potencjalnej roli transkryptu w patogenezie.

DIAGNOSTYKA GENETYCZNA. TERAPIA GENOWA 181 W08-02 MOLEKULARNE PODSTAWY DIAGNOSTYKI NOWOTWORÓW Janusz A. Siedlecki Centrum Onkologii-Instytut, Zakład Biologii Molekularnej, Warszawa Obecny stan wiedzy o molekularnych mechanizmach karcinogenezy nie wydaje sięstwarzać nadziei na znalezienie wielu jednoznacznych korelacji pomiędzy określona zmianą, a typem nowotworu. Dlatego większość opracowywanych obecnie testów diagnostycznych nastawiona jest raczej na jak najwcześniejsze odróżnienie komórki nowotworowej od normalnej. W warunkach początkowych, gdy masa nowotworu jest niewielka analiza morfologiczna jest często niewystarczająca do zidentyfikowania małej grupy zmienionych komórek. Podobnie zawodne mogą okazać siętechniki immunocytochemiczne. Biologia molekularna oferuje narzędzia pozwalające na wykrycie zmian w DNA, RNA i białkach nawet w pojedynczej komórce. Dzięki technice PCR możliwe jest otrzymanie ponad miliona kopii danego fragmentu DNA z pojedynczej nici cząsteczki obecnej w przednowotworowej lub nowotworowej komórce. Stało sięwięc możliwe wykrycie małej grupy nieprawidłowych komórek, które złuszczyły sięz nowotworu do płynów ustrojowych takich jak krew, mocz, plwocina, czy nawet wydzielina z sutka. W cytologicznie negatywnych próbkach plwociny, na 10 przebadanych przypadków w 8 stwierdzono obecność komórek z mutacją w genach Ki-RAS lub P53. We wszystkich tych przypadkach rak płuc został klinicznie potwierdzony w 1 4 miesięcy później, a w przypadku jednego z pacjentów aż 13 miesięcy później. Metoda PCR umożliwia również wykazanie obecności mikronacieków w obszarze otaczającym usuniętą wraz z odpowiednim marginesem zmianę pierwotną oraz ujawnienie mikroprzerzutów w węzłach chłonnych. Technika PCR oparta o tkankowo-specyficzne markery pozwala na znalezienie nawet kilkuset komórek nowotworowych krążących we krwi obwodowej. Poszukuje siętą metodą komórek nowotworowych krążących we krwi obwodowej u chorych po radykalnym zabiegu chirurgicznym i/lub z czynnym procesem nowotworowym. Eksperymenty tego typu prowadzone są dla raka prostaty, sutka, płuca i czerniaka. W Centrum Onkologii opracowaliśmy dwumarkerową metodępozwalającą na wykrycie (w całkowitym RNA izolowanym z krwi obwodowej) obecności mrna dla tyrozynazy i MART 1 transkrypów specyficznych dla komórek czerniaka. Z pobranej krwi izolowano całkowite RNA, a następnie przy pomocy odwrotnej transkryptazy syntetyzowano cdna. W celu ujawnienia obecności transkryptów przeprowadzano reakcjępcr. Badania nad czułością reakcji amplifikacji pozwoliły na ustalenie, że możliwe jest wykrycie krążących komórek czerniaka, gdy ich liczba jest większa niż 1000 w pełnej objętości krwi. Wysoce obiecujące jest wykorzystanie do identyfikacji komórek nowotworowych analizy sekwencji mikrosatelitarnych. Zmiany w ich obrębie są świadectwem niestabilności genomu wywołanej na przykład mutacją w genie mutatorowym. Prostota analizy powtórzeń mikrosatelitarnych oraz możliwość pełnego jej zautomatyzowania stanowi o przewadze tej techniki w porównaniu z techniką wykrywania specyficznych mutacji.

182 SESJA 8 WYKŁADY W08-03 ANALIZY MOLEKULARNE W DIAGNOSTYCE WYSOKIEJ GENETYCZNEJ PREDYSPOZYCJI DO NOWOTWORÓW Jan Lubiński Ośrodek Nowotworów Dziedzicznych, Pomorska Akademia Medyczna, Szczecin W ostatnich latach wykryto, że 5 10% wszystkich nowotworów złośliwych w tym tzw. pospolitych nowotworów jak raki sutka, jelita grubego lub jajnika, wywołanych jest mutacjami w jednym z genów związanych z zespołami nowotworów dziedzicznych. Diagnostyka tych zespołów oparta jest o ocenę danych rodowodowo-klinicznych oraz o testy DNA/RNA. W naszym ośrodku zdiagnozowano ~1000 rodzin z dziedzicznymi predyspozycjami do raków różnych narządów. W ~20% z nich wykryto mutacje markerowe dla rodzin. Znalezienie mutacji umożliwiło postawienie jednoznacznej diagnozy w wielu rodzinach w których rozpoznanie zespołu dziedzicznej predyspozycji mogło być jedynie podejrzewane na podstawie danych rodowodo-klinicznych. Ponadto testy molekularne zmniejszyły o około 50% liczbęosób, które zakwalifikowano do kosztownych programów intensywnych badań kontrolnych. W części przypadków testy DNA okazały się jedyną metodą umożliwiającą zdiagnozowanie genetycznej predyspozycji w związku z wystąpieniem mutacji germinalnych de novo. Techniki stosowane w naszym ośrodku obejmują sekwencjonowanie, SSCP, long PCR i Southern blotting. Testy na BRCA1, BRCA2 są już obecnie tanie dzięki wykryciu founder effect w polskiej populacji. Dzięki wprowadzeniu nowych algorytmów diagnostyki klinicznej i laboratoryjnej osiągnięto znaczną redukcję kosztów badania genów hmsh2, hmlh1 (rak jelita grubego), VHL (nowotwory mózgu, nadnercza, nerek i oka) oraz Rb-1 (siatkówczak oka).

DIAGNOSTYKA GENETYCZNA. TERAPIA GENOWA 183 W08-04 DIAGNOSTYKA MOLEKULARNA: PRZYKŁADY Z DYSTROFII MIĘŚNIOWEJ, STWARDNIENIA GUZOWATEGO, RODZINNEJ POLIPOWATOŚCI JELITA I OSTEOPOROZY Ryszard Słomski Zakład Genetyki Człowieka PAN, Poznań Katedra Biochemii i Biotechnologii AR, Poznań Dystrofia mięśniowa Duchenne a, najczęstsza choroba genetyczna sprzężona z chromosomem X, występuje z częstością 1 na 3500 noworodków płci męskiej i w 30% przypadków jest następstwem nowych mutacji. Najczęstszymi mutacjami w genie DMD są duże delecje, które stanowią 50% wszystkich mutacji. Analizędelecji przeprowadzono dla 46 chorych. Wykryto je u 20 osób. Dla 41 osób przeprowadzono analizęmutacji punktowych w 22 regionach genu DMD. Metody przesiewowe (PCR-SSCP i PCR-HD) umożliwiły wykrycie mutacji punktowych u 17% chorych. Analizęnosicielstwa przeprowadzono dla 38 rodzin. W 6 przypadkach marker położony był w regionie, który u chorego uległ delecji. Dodatkowo analiza wybranych markerów pozwoliła na zidentyfikowanie 7 przypadków rekombinacji wewnątrzgenowych. Stwardnienie guzowate (TSC) jest chorobą autosomalną, dominującą, występującą z częstością 1/10000 urodzeń. TSC charakteryzuje się zmianami w mózgu, sercu i nerkach, o różnym nasileniu w zależności od wieku, jak również zróżnicowaniem klinicznym u członków tej samej rodziny. Analizęmutacji wykonano łącznie dla 161 chorych i zidentyfikowano 17 mutacji, położonych w różnych eksonach. Rodzinna polipowatość jelita grubego (FAP) jest dziedzicznie warunkowaną podatnością na występowanie w jelicie grubym licznych polipów, które charakteryzują sięwysokim potencjałem do rozwoju w kierunku nowotworu złośliwego. Choroba jest cechą autosomalną, dominującą, warunkowaną dziedzicznymi mutacji w genie supresorowym APC na chromosomie 5q21. Badaniami objęto 250 osób z rodzin z FAP. U chorych z FAP zidentyfikowano 16 typów mutacji w genie APC w 28 rodzinach oraz 2 substytucje nie powodujące zmiany aminokwasu. Najczęściej występującą mutacją była delaaaga1309 (9,4% rodzin). Osteoporoza należy do chorób o wzrastającej częstości występowania. Jednym z genów mogących uczestniczyć w rozwoju osteoporozy jest gen osteoprotegeryny (OPG). Wykorzystując analizępcr-hd, analizępcr-sscp oraz bezpośrednie sekwencjonowanie DNA od 85 chorych na osteoporozęlub osteopenięwykryto 7 polimorfizmów: 6 w intronach oraz transwersjęw eksonie 1 (9G>C). Transwersja 9G>C powoduje zmianękonserwatywnej, dodatnio naładowanej lizyny na neutralną asparaginęw trzecim kodonie sekwencji sygnałowej. Uzyskane wyniki pozwoliły oszacować iloraz szans wystąpienia osteoporozy równy 2,99 dla osób posiadających allel C.

184 SESJA 8 WYKŁADY W08-05 WEKTORY WIRUSOWE W TERAPII GENOWEJ Andrzej Mackiewicz Zakład Immunologii Nowotowrów, Akademia Medyczna, Wielkopolskie Centrum Onkologii, Poznań Opracowanie technologii rekombinowanych wirusów w celu przenoszenia genów stało sięprzełomem, który umożliwił zastosowanie terapii genowej u ludzi. Obecnie wykorzystuje siękilkanaście rodzajów wirusów zarówno wirusów RNA jak i DNA. Generalna zasada konstrukcji wektorów wirusowych polega na tym, iż z materiału genetycznego wirusa usuwa sięniektóre sekwencje odpowiedzialne za kodowanie ich elementów strukturalnych (aby zapobiec replikacji w komórce docelowej, obniżyć immunogenność, itp.). W zamian za to wprowadza się geny terapeutyczne i często geny selekcyjne. Najczęściej obecnie używane w badaniach klinicznych są wektory Retrowirusowe (RV), następnie Adenovirusowe (AdV), Adeno-Associated (AAV), Herpes czy Poxwirusowe. Ostatnio opracowano wektory oparte na Lentiwirusach (HIV) oraz wirusie SV40. Każdy z wektorów charakteryzują odrębne cechy związane z biologią poszczególnych wirusów. RV wprowadzają geny do komórek dzielących się, integrując na stałe swój materiał genetyczny z genomem komórki docelowej. AdV wprowadzają geny do komórek nie dzielących i dzielących siębez integracji z genomem komórki docelowej. AAV wprowadzają geny do komórek dzielących i nie dzielących sięprowadząc do stałej ich integracji z genomem. Wektory Lentiwirusowe oraz SV40 maja podobne właściwości do AAV, jednak uważa się, że są znacznie efektywniejsze, szczególnie w przypadku wprowadzania genów do wczesnych komórek pnia (CD34+). Powyższe cechy determinują zastosowanie poszczególnych wektorów, np. RV są doskonałym narzędziem do konstrukcji genetycznych szczepionek komórkowych (GMTV), AdV do transdukcji komórek nabłonkowych drzewa oskrzelowego w mukowiscydozie.

212 SESJA 8 WYKŁADY W08-06 ANTYANGIOGENNA TERAPIA GENOWA Stanisław Szala, Jarosław Szary Zakład Biologii Molekularnej, Centrum Onkologii, Instytut im. M. Skłodowskiej-Curie, Gliwice Szereg danych wskazuje, że proces powstawania unaczynienia w nowotworach litycznych angiogeneza odgrywa ważną rolęzarówno w ich progresji jaki i w powstawaniu przerzutów. Tworzenie sieci okołonowotworowych naczyń krwionośnych jest złożonym procesem, rezultatem wzajemnych oddziaływań komórek nowotworowych z komórkami śródbłonkowymi, a także ze strukturalnymi elementami macierzy zewnątrzkomórkowej. Wydzielane przez komórki nowotworowe czynniki wzrostowe, przy jednoczesnym zmniejszaniu siępoziomu inhibitorów angiogenezy, indukują powstawanie unaczynienia. Odkrycie swoistych, endogennych inhibitorów stworzyło nowe możliwości dla terapii nowotworów. Jednym z takich inhibitorów jest odkryta przez grupęj. Folkmana endostatyna. Endostatyna została zidentyfikowana jako proteolityczny C-końcowy fragment kolagenu XVIII. Endostatyna posiada silne właściwości hamowania angiogenezy, w tym angiogenezy indukowanej przez nowotwory: silnie hamuje wzrost guzów pierwotnych oraz ogranicza ilość i wzrost przerzutów. Wprowadzanie do komórek nowotworowych, a także niektórych komórek prawidłowych, genów kodujących białkowe inhibitory angiogenezy, może stać sięcenną innowacją w antyangiogennej terapii nowotworów. Zaproponowana tu strategia wprowadzania in vivo plazmidu kodującego endostatynęjest alternatywą dla podawania zrekombinowanego białka (co jest bardzo drogie) oraz dla stosowania wektorów wirusowych (podejście skomplikowane technicznie, dość drogie i stwarzające niebezpieczeństwo mutacji insercyjnych). Sekwencje kodujące fragmentu 184 C-końcowych aminokwasów z mysiego kolagenu XVIII zostały zsyntetyzowane przy pomocy reakcji PCR z wykorzystaniem jako matrycy plazmidu zawierającego cdna kolagenu XVIII. Sekwencje kodujące endostatynęzostały połączone z sekwencją sygnalną hemaglutyniny z wirusa grypy, a następnie przeklonowane do wektorów ekspresyjnych. Plazmid kodujący endostatynę wprowadzono do komórek mysiego raka nerki Renca. W eksperymentach in vivo stwierdzono, że guzy wywodzące sięz komórek wydzielających endostatynęrosną u myszy wolniej w porównaniu z guzami wywodzącymi sięz komórek transfekowanych pustym wektorem. W eksperymentach terapeutycznych użyto plazmidu VR1012 zawierającego sekwencję kodującą endostatynę. Podawano doguzowo DNA plazmidowy nieskompensowany z nośnikami. Zaobserwowano wyraźne zahamowanie wzrostu guzów w grupach myszy leczonych plazmidem z endostatyną w porównaniu do myszy, którym podawano pusty wektor nie zwierający wstawki.