MED. DOŚW. MIKROBIOL., 2013, 65: Natalia Rokosz-Chudziak, Waldemar Rastawicki, Katarzyna Zacharczuk, Rafał Gierczyński

MED. DOŚW. MIKROBIOL., 2013, 65: 245-254 Elektroforetyczna i immunologiczna analiza natywnych białek wydzielniczych wytwarzanych in vitro w warunkach indukcji Ysa (Yersinia secretion apparatus) przez izolaty Yersinia enterocolitica 1B/O8 wyosobnione od ludzi w Polsce Electrophoretic and immunological analysis of native proteins secreted in vitro under conditions inducing Ysa (Yersinia secretion apparatus) by clinical isolates of Yersinia enterocolitica 1B/O8 in Poland Natalia Rokosz-Chudziak, Waldemar Rastawicki, Katarzyna Zacharczuk, Rafał Gierczyński Zakład Bakteriologii Narodowego Instytutu Zdrowia Publicznego - - Państwowego Zakładu Higieny w Warszawie Przeprowadzono elektroforetyczną analizę profili białkowych wybranych izolatów epidemicznego szczepu Yersinia enterocolitica bioserotypu 1B/O8 pochodzących od osób z jersiniozą zamieszkałych na terenie Polski. Badano zdolność wybranych białek do reakcji z surowicą królika immunizowanego referencyjnym szczepem Yersinia enterocolitica 1B/O8 WA-314 oraz próbkami surowicy uzyskanymi od osób z bakteriologicznie potwierdzonym zakażeniem pałeczkami Yersinia enterocolitica bioserotypu 1B/O8. Analiza uzyskanych elektroforegramów nie wykazała obecności białek Ysa i Ysp mimo zastosowania warunków indukcji umożliwiających wytwarzanie tych białek przez szczep referencyjny Yersinia enterocolitica 1B/O8 WA-314 oraz szczepy Yersinia enterocolitica 1B/O8 pochodzące z Instytutu Pasteura. Wyniki badań serologicznych nie potwierdziły obecności swoistych przeciwciał dla białek Ysa i Ysp zarówno w próbce surowicy immunizowanego królika, jak i próbkach surowicy uzyskanych od osób z jersiniozą. Słowa kluczowe: Yersinia enterocolitica 1B/O8, T3SS, białka Ysa, białka Ysp ABSTRACT Introduction: The high pathogenicity Yersinia enterocolitica 1B/O8 produce variety of virulence factors including chromosomal T3SS known as Ysa-Ysp system that is considered to act at the early stage of infection. The aim of the study was to examine the ability to produce Ysa-Ysp proteins in vitro by human clinical isolates of the epidemic Y. enterocolitica 1B/

246 N. Rokosz-Chudziak i inni Nr 4 O8 strains in native conditions and immunological characterization of expressed proteins. Methods: Seven Y. enterocolitica 1B/O8 isolates with known epidemiological link and the reference high pathogenicity strain WA-314 and six strains from the Institute Pasteur (France) were examined for production of Ysa-Ysp proteins according with procedure described by Matsumoto and Young (Mol. Microbiol., 2006, 59:689-76). All the isolates and strains were characterized by SDS-PAGE to determined Ysa-Ysp proteins profile. The immunological characterization was performed by using western-immunobloting method using sera from two immunized rabbits and from two patients with bacteriology confirmed Y. enterocolitica 1B/O8 infection. Results: The reference strain WA-314 yielded typical Ysa-Ysp proteins profile. In contrast all the tested Y. enterocolitica 1B/O8 human isolates yielded the same SDS- -PAGE profile that was apparently distinct from profile of Ysa-Ysp proteins of reference strain WA-314. Conclusions: The Y. enterocolitica 1B/O8 isolates of the epidemic strain circulating in Poland were found to be unable to produce Ysa-Ysp proteins in vitro under conditions sufficient to stimulate expression of the Ysa-Ysp proteins in the reference strain WA-314 and strains from the Institute Pasteur (France). Our results may suggest that the ability to produce Ysa- -Ysp proteins in concentrations sufficient to induce production of specific antibodies is not indispensible for Y. enterocolitica 1B/O8 infection in humans. The western-immunoblotting analysis of human serum samples showed that the antibodies were not induced by Ysa and Ysp proteins during infection caused by the epidemic strain of Y. enterocolitica 1B/O8 circulating in Poland. Similar, negative result was found with serum of a rabbit immunized intravenously by the reference strain WA-314. The project was funded by the National Science Centre in Cracov, Poland, grant N N401 076039. Key words: Yersinia enterocolitica 1B/O8, T3SS, Ysa proteins, Ysp proteins WSTĘP Pałeczki Yersinia enterocolitica bioserotypu 1B/O8 należące do amerykańskiej linii filogenetycznej odznaczają się wysoką zjadliwością w porównaniu do pałeczek z pozostałych bioserotypów Y. enterocolitica występujących w Europie i na świecie (3, 8, 12, 16). Szczepy bioserotypu 1B/O8, poza plazmidem zjadliwości pyv, posiadają również inne czynniki zjadliwości, takie jak inwazyna (białko Inv), adhezyna Ail, enterotoksyna YstA, fimbrie Myf i fosfolipaza A. Za dodatkowy czynnik chorobotwórczości tej grupy drobnoustrojów uznawany jest też chromosomalny system sekrecji białek typu III zwany Ysa, który oprócz wydzielania specyficznych białek zwanych Yersinia secreted proteins (Ysp) może też zwiększać wydajność transportu niektórych białek efektorowych Yop kodowanych przez plazmid pyv i tym samym prawdopodobnie przyczyniać się do intensyfikacji przebiegu zakażenia pałeczkami Yersinia enterocolitica należącymi do bioserotypu 1B/O8 (3, 5, 13). Z dostępnego piśmiennictwa wynika, że szczepy pałeczek Yersinia enterocolitica 1B/O8 mają zdolność do ekspresji aparatu Ysa i syntezy białek efektorowych Ysp transportowanych przez ten aparat (5 14, 15). Mając na uwadze fakt, iż od 2008 roku odnotowuje się coraz

Nr 4 Białka Ysa i Ysp pałeczek Y. enterocolitica 1B/O8 247 częściej przypadki zakażenia pałeczkami Yersinia enterocolitica bioserotypu 1B/O8 u ludzi w Polsce (2, 8) podjęto próbę uzyskania natywnych białek Ysa i Ysp pałeczek Yersinia enterocolitica 1B/O8 celem sprawdzenia, czy w surowicy osób, które przebyły zakażenie tymi drobnoustrojami obecne są swoiste przeciwciała dla tych białek. Celem prezentowanej pracy była elektroforetyczna i immunologiczna analiza natywnych białek Ysa i Ysp uzyskanych z wybranych izolatów Yersinia enterocolitica 1B/O8 pochodzących od osób z jersioniozą zamieszkałych na terenie Polski. MATERIAŁ I METODY Surowice ludzkie. W badaniach posłużono się próbkami surowicy uzyskanymi od dwóch osób z bakteriologicznie potwierdzoną jersiniozą wywołaną przez pałeczki Y. enterocolitica 1B/O8. W próbkach tych stwierdzono odczynem ELISA znamienny poziom swoistych przeciwciał klasy IgA, IgG i IgM dla białka Yop, jak i dla antygenu lipopolisacharydowego uzyskanego z pałeczek Y. enterocolitica 1B/O8 według zmodyfikowanej metody Boivina (10). Odpornościowe surowice królicze. W badaniach wykorzystano archiwalne próbki surowicy uzyskane od dwóch królików immunizowanych dożylnie zawiesiną żywych pałeczek Y. enterocolitica bioserotypu 1B/O8 lub bioserotypu 4/O3. Surowice te uzyskano we własnym zakresie w ramach wcześniej prowadzonych prac badawczych. Szczepy i izolaty użyte w badaniach. Do uzyskania natywnych białek Ysa wybrano siedem izolatów pałeczek Y. enterocolitica 1B/O8 oznaczonych jako: DM0099, DM0102, DM0140, DM0147, DM0149, DM0209 i DM0249. Izolaty te pochodziły z kolekcji Zakładu Bakteriologii NIZP-PZH i zostały wyizolowane w latach 2004-2009, od osób z jersiniozą zamieszkałych na terenie Polski. W badaniach posłużono się również szczepami Y. enterocolitica bioserotypu 1B/O8 pochodzącymi z kolekcji Ośrodka Referencyjnego WHO ds. Yersinia, Instytutu Pasteura we Francji, które oznaczono jako: DM0154, DM0155, DM0157, DM0159, DM0160, DM0161, DM0162 i DM0163. Dodatkowo, w badaniach użyto referencyjny szczep Y. enterocolitica WA-314 reprezentujący bioserotyp 1B/O8 oraz szczep kontrolny Y. enterocolitica 4/O3 z kolekcji Zakładu Bakteriologii NIZP PZH. Szczep WA 314 otrzymano od Dr. Alexandra Rakina z Max von Pettenkofer Instiut w Monachium. Uzyskanie białek natywnych Ysa i Ysp. Białka Ysa i Ysps zostały uzyskane według metodyki opisanej przez Matsumoto i Young (5) z późniejszymi modyfikacjami (7, 13). Zgodnie z procedurą, izolaty i szczepy Y. enterocolitica bioserotypu 1B/O8 namnażano przez całą noc w podłożu Luria-Bertani agar firmy Sigma-Aldrich (1% Trypton i 0,5% ekstrakt drożdżowy) w temp. 26 o C. Następnie 10 ml uzyskanej hodowli dodano do 200 ml podłoża LB-290 wzbogaconego o NaCl w stężeniu 290 mm i inkubowano przy intensywnym wytrząsaniu przez 7 godzin w temp. 26 o C, aż do osiągnięcia gęstości optycznej 0,1 przy długości fali światła 600 nm. Po zwirowaniu hodowli przy 13000 x g przez 20 minut do uzyskanego supernatantu dodawano 10% roztwór kwasu trichlorooctowego o temperaturze 4 o C w stosunku 1:8 i inkubowano w chłodni przez noc przy intensywnym wytrząsaniu (rpm=100). Zawiesinę wytrąconych białek ponownie wirowano przy 13000 x g. Po usunięciu supernatantu osad przemywano jednokrotnie zimnym acetonem, ponownie poddawano wirowaniu i osuszono w cieplarce w temperaturze 37 o C w ciągu 30 minut.

248 N. Rokosz-Chudziak i inni Nr 4 Elektroforeza w żelu poliakrylamidowym. W celu wyznaczenia przybliżonej masy cząsteczkowej natywnych białek uzyskany osad zawieszono w równej objętości w 2-krotnie stężonym roztworze Laemmli zawierającym 0,5 M Tris-HCl o ph 6,8, 10% SDS, 3% 2-merkaptoetanol, 20 % glicerol oraz 0,05% błękit bromofenolowy i ogrzewano we wrzącej łaźni wodnej przez 15 minut. Uzyskane próbki poddawano elektroforezie 3,5 godziny w 12,5% żelu poliakrylamidowym w warunkach denaturujących (bufor: 1,5 M Tris-HCl i 0,4% SDS) przy natężeniu prądu 65 ma, napięciu 300 V i mocy 20 W w buforze glicynowym (25 mm Tris-HCl o Ph=8,3, 250 mm glicyna, 0,1% SDS). Elektroforezę prowadzono przy natężeniu prądu 60 ma przez 3,5 godziny, a następnie żele barwiono barwnikiem Coomassie Brilliant Blue (Sigma-Aldrich). Szacunkową masę cząsteczkową badanych białek określano porównując ich drogę migracji do drogi migracji markerów preparatu firmy Thermo Scientific o nr kat. 26619. Odczyn western-immunoblotting. Elektroforetyczne przeniesienie uzyskanych białek Ysa i Ysp na membranę nitrocelulozową (typ PVDF) firmy AppliChem wykonywano w aparacie (TE70X Semi-dry blotter) firmy Hoefer przy natężeniu prądu 300 ma przez 3 godziny. Następnie powierzchnię nitrocelulozy blokowano 5% roztworem odtłuszczonego mleka, po czym arkusz membrany cięto na paski szerokości 4-5 mm i inkubowano przez 1,5 godziny w temp. pokojowej (20-22ºC) z ludzkimi surowicami lub surowicami immunizowanych królików w buforze PBS z dodatkiem 0,5% roztworu mleka w rozcieńczeniu 1/101. Po trzykrotnym płukaniu buforem PBST (0,8% NaCl; 0,02% KH 2 PO 4 ; 8,1 mm Na 2 HPO 4 ; 0,02% KCl, 0,1% Tween 20) paski nitrocelulozy inkubowano w roztworze odpowiedniego koniugatu dla surowic ludzkich lub króliczych. W badaniach posłużono się kozimi przeciwciałami sprzężonymi z peroksydazą chrzanową dla ludzkich immunoglobulin klasy G (firmy Cappel) oraz kozimi przeciwciałami sprzężonymi z peroksydazą chrzanową dla króliczych immunoglobulin klasy G (firmy Cappel). Użytkowe rozcieńczenie koniugatów wynosiło 1/1000. Po jednogodzinnej inkubacji w temperaturze pokojowej, paski nitrocelulozy płukano roztworem PBST a następnie inkubowano w roztworze benzydyny (Sigma-Aldrich) w buforze cytrynianowym o ph=5,0 z dodatkiem perhydrolu. Po upływie 10 minut reakcję barwną zatrzymywano poprzez przepłukanie pasków nitrocelulozy wodą destylowaną. WYNIKI Porównanie profili elektroforetycznych preparatów białek uzyskanych z wybranych izolatów Y. enterocolitica 1B/O8 szczepu epidemicznego występującego w Polsce, z profilami białek ze szczepów Y. enterocolitica 1B/O8 z Instytutu Pasteura, wykazało znaczne różnice ich topologii i liczby prążków (Ryc. 1 i Ryc. 2). W elektroforegramach białek ze szczepów Y. enterocolitica 1B/O8 z Instytutu Pasteura stwierdzono obecność prążków o masie cząsteczkowej: 112 kda (białko YspL), 80-81 kda (białko YpkA/YopO), 68-58 kda (białko YspA), 55-54 kda (białko YspY), 51-50 kda (białko YopH), 46-45 kda (białko YspE), 43-42 kda (białko YspP), 41-40 kda (białko YopM), 33 kda (białko YopJ), 25 kda (białko YopE), 24 kda (białko YspJ/YspK). W nawiasach podano jakim białkom systemu YSA odpowiadać mogą wyekstrahowane białka w poszczególnych prążkach elektroforetycznych. W profilach preparatów białek wyosobnionych z izolatów szczepu epidemicznego od osób z jersiniozą w Polsce nie stwierdzono obecności szeregu

Nr 4 Białka Ysa i Ysp pałeczek Y. enterocolitica 1B/O8 249 Ryc. 1. Elektroforetyczny obraz białek poszczególnych szczepów Y. enterocolitica 1B/O8 otrzymanych z Instytutu Pasteura oraz szczepu kontrolnego Y. enterocolitica 4/O3 rozdzielonych w 12,5% żelu poliakrylamidowym (SDS- PAGE). MW - marker białkowy firmy Thermo Scientific (nr kat. 26619), 1- Y. enterocolitica 1B/O8 DM0157, 2 - Y. enterocolitica 1B/O8 DM0154, 3 - Y. enterocolitica 1B/O8 DM0155, 4 - Y. enterocolitica 1B/O8 DM0159, 5 - Y. enterocolitica 1B/O8 DM0160, 6 - Y. enterocolitica 1B/O8 DM0163, 7 - Y. enterocolitica 1B/O8 DM0162, 8- Y. enterocolitica 1B/O8 DM0161, 9 - Y. enterocolitica 4/O3. białek o masie cząsteczkowej: 112 kda (białko YspL), 81-80 kda (białko YpkA/YopO), 70-68 kda (białko YspB), 55-54 kda (białko YspY), 33 kda (białko YopJ), 29-28 kda (białko YspH/YopP) i 24 kda (białko YspJ/YspK). W profilu białkowym szczepu referencyjnego Y. enterocolitica 1B/O8 WA-314 nie zaobserwowano natomiast prążków o masie cząsteczkowej: 68-58, 43-42, 33, 29-28 kda. Ostatecznie stwierdzono, iż przeprowadzona analiza profili preparatów białek wybranych polskich izolatów Y. enterocolitica 1B/O8 nie wykazała obecności białek Ysa i Ysp, które były wykrywane w preparatach białek szczepu referencyjnego WA-314 oraz szczepów Y. enterocolitica 1B/O8 pochodzących z kolekcji Instytutu Pasteura. Obecność w badanych próbkach surowicy przeciwciał dla białek Ysa i Ysp oceniono w odczynie western-immunoblotting. Do badania wybrano izolat Y. enterocolitica 1B/O8 DM0140 wyodrębniony na terenie kraju, szczep Y. enterocolitica 1B/O8 DM0162 otrzymany z Instytutu Pasteura oraz szczep referencyjny Y. enterocolitica 1B/O8 WA-314 (Ryc. 3). Wyniki badań przeprowadzonych odczynem western-immunoblotting z surowicą uzyskaną od królika immunizowanego zawiesiną pałeczek Y. enterocolitica 1B/O8 wykazały

250 N. Rokosz-Chudziak i inni Nr 4 Ryc. 2. Elektroforetyczny obraz białek poszczególnych izolatów Y. enterocolitica 1B/O8 wyosobnionych od chorych na terenie kraju oraz szczepów kontrolnych rozdzielonych w 12,5% żelu poliakrylamidowym (SDS- PAGE). MW marker białkowy firmy Thermo Scientific (nr kat. 26619), 1 - Y. enterocolitica 1B/O8 DM0162, 2- Y. enterocolitica 1B/O8 DM0209, 3 - Y. enterocolitica 1B/O8 DM0249, 4 - Y. enterocolitica 1B/O8 DM0149, 5 - Y. enterocolitica 1B/O8 DM0102, 6 - Y. enterocolitica 1B/O8 DM0099, 7 - Y. enterocolitica 1B/O8 DM0147, 8- Y. enterocolitica 1B/O8 DM0140, 9 szczep referencyjny Y. enterocolitica 1B/O8 WA-314. obecność przeciwciał klasy IgG dla białek o masie cząsteczkowej 50, 80, 81 kda obecnych w preparacie białek szczepu Y. enterocolitica DM0162 oraz szczepu referencyjnego Y. enterocolitica 1B/O8 WA-314 (Ryc. 4A). W surowicy uzyskanej od królika immunizowanego zawiesiną pałeczek Y. enterocolitica 4/O3 wykazano obecność immunoglobulin klasy G dla białek o masie cząsteczkowej: 81, 50 i 37 kda (Ryc. 4 B). Odczynem western-immunoblotting w próbkach surowicy uzyskanych od jednej z osób z bakteriologicznie i serologicznie potwierdzonym zakażeniem pałeczkami Y. enterocolitica 1B/O8 stwierdzono obecność przeciwciał klasy IgG dla białek o masie cząsteczkowej 81 kda i 37 kda szczepu Y. enterocolitica 1B/O8 DM0162 oraz dla białka o masie cząsteczkowej 81 kda szczepu referencyjnego Y. enterocolitica 1B/O8 WA-314 (Ryc. 5). Analiza uzyskanych wyników nie wykazała natomiast obecności swoistych przeciwciał dla białek Ysa i Ysp zarówno w próbkach surowicy immunizowanych królików, jak i w próbkach surowicy uzyskanych od osób z bakteriologicznie potwierdzonym zakażeniem pałeczkami Y. enterocolitica 1B/O8 (Ryc. 4).

Nr 4 Białka Ysa i Ysp pałeczek Y. enterocolitica 1B/O8 251 Ryc. 3. Elektroforetyczny obraz białek uzyskanych z trzech różnych szczepów pałeczek Y. enterocolitica 1B/O8 rozdzielonych w 12,5% żelu poliakrylamidowym barwionym Commasie Brilliant Blue. Ścieżki: 1 Y. enterocolitica 1B/O8 DM0140, 2- Y. enterocolitica 1B/O8 DM0162, 3 Y. enterocolitica 1B/O8 WA-314, 4 marker wielkości białka firmy Thermo Scientific nr kat. 26619. Ryc. 4. Wynik reakcji w odczynie western-immunoblotting białek Y. enterocolitica 1B/O8 z surowicami królików immunizowanych dożylnie zawiesiną pałeczek Y. enterocolitica 1B/O8 (A) oraz pałeczek Y. enterocolitica 4/O3 (B). Ścieżki: 1 - szczep Y. enterocolitica 1B/O8 DM0162, 2 - szczep referencyjny Y. enterocolitica 1B/O8 WA-314, 3 - izolat Y. enterocolitica 1B/O8 DM0140, 4- marker wielkości białka firmy Thermo Scientific nr kat. 26619.

252 N. Rokosz-Chudziak i inni Nr 4 Ryc. 5. Wynik reakcji w odczynie western-immunoblotting białek Y. enterocolitica 1B/O8 z surowicami pacjentów z jersiniozą. Ścieżki: 1 - szczep Y. enterocolitica 1B/O8 DM0162, 2 - szczep referencyjny Y. enterocolitica 1B/O8 WA-314, 3 - izolat Y. enterocolitica 1B/ O8 DM0140, 4 - marker wielkości białka Thermo Scientific nr kat. 26619. DYSKUSJA Pałeczki Y. enterocolitica posiadają dwa systemy sekrecji białek typu III - pierwszy to system Ysc (ang. Yersinia secretion system), kodowany na plazmidzie pyv, a drugi to system Ysa (ang. Yersinia secretion apparatus) kodowany chromosomalnie (1, 6, 15, 17). U pałeczek Y. enterocolitica biotypu 1B obszar skupiający geny związane z działaniem chromosomalnego aparatu sekrecji Ysa tworzy wyspę patogenności YSA-PI znajdującą się w strefie plastyczności genomu PZ (ang. plasticity zone). Rola aparatu Ysa w patogenezie zakażenia pałeczkami Y. enterocolitica u ludzi nie została jeszcze dokładnie poznana. Przypuszcza się, iż odgrywa on rolę we wczesnej fazie procesu kolonizacji przez pałeczki Y. enterocolitica biotypu 1B komórek nabłonka jelitowego (1, 17). System Ysa uczestniczy w transporcie białek kodowanych na chromosomie YspE, YspF, YspI, YspK, YSpL, YspP, YspM oraz białek kodowanych na plazmidzie YopE (dawniej uznawane za YspJ), YopN (YspG) i YopP (YspH). Do białek, których geny kodowane są w obrębie locus ysa zalicza się białka aparatu sekrecyjnego (YsaC, YsaQ, YsaW, YsaV), białka YspB, YspC i YspD budujące translokon tworzący kanał w błonie eukariotycznej, białko YspA wydzielane do środowiska, białka opiekuńcze SycB, YspN, YspK oraz białka regulatorowe YsrR, YsrS i YsaE (1, 5, 12, 17). Wiadomo, iż u pałeczek Y. enterocolitica biotypu 1B system YSA w warunkach in vitro może być aktywowany przy zapewnieniu odpowiedniej temperatury hodowli, tj. temp. 26 o C, wysokiej osmolarności (290 mm NaCl) oraz bogatej w składniki pożywce LB (6, 11, 14, 15, 17).

Nr 4 Białka Ysa i Ysp pałeczek Y. enterocolitica 1B/O8 253 W związku z przedstawionymi wyżej danymi piśmiennictwa, zasadniczym założeniem opisanych tu badań było wypreparowanie in vitro natywnych białek Ysa i Ysp z wybranych izolatów Y. enterocolitica 1B/O8 uzyskanych w 2009 roku od osób z jersiniozą zamieszkałych w Polsce. W następnym etapie badań, białka te miały posłużyć jako swoisty antygen przydatny w poszukiwaniu w surowicy osób z przebytym zakażeniem pałeczkami Y. enterocolitica 1B/O8 swoistych przeciwciał dla białek Ysa i Ysp. Obecność tych przeciwciał u osób chorych było by pierwszym potwierdzeniem aktywności aparatu Ysa w przebiegu zakażenia pałeczkami Y. enterocolitica 1B/O8 u ludzi. Wyniki jakie autorzy tej pracy otrzymali po przeprowadzeniu badań wykazały jednak, że stanowiące przedmiot badań izolaty epidemicznego szczepu Y. enterocolitica 1B/O8 w przeciwieństwie do referencyjnego szczepu WA-314, jak i szczepów Y. enterocolitica 1B/O8 pochodzących z kolekcji Instytutu Pasteura nie wytwarzały białek Ysa i Ysp w warunkach laboratoryjnych. Co ciekawe, mimo uzyskania in vitro natywnych białek Ysa i Ysp ze szczepów referencyjnych badanie odczynem western-immunoblotting wykazało, iż w próbkach surowicy uzyskanych od wybranych osób zakażonych pałeczkami Y. enterocolitica bioserotypu 1B/O8 nie stwierdzono obecności przeciwciał klasy IgG swoistych dla białek Ysa czy białek Ysp. Fakt ten może potwierdzać, że białka Ysa i Ysp nie są również wytwarzane w przebiegu naturalnego zakażenia ludzi pałeczkami Y. enterocolitica 1B/O8 epidemicznego szczepu występującego w Polsce. Jedynymi białkami, które reagowały w odczynie western-immunoblotting z przeciwciałami klasy IgG obecnymi w próbce surowicy immunizowanego królika, jak i w próbce surowicy osoby zakażonej szczepem Y. enterocolitica bioserotypu 1B/O8 były białka: YpkA/YopO (o masie cząsteczkowej 81 kda), YopN (37 kda) i YopH (50 kda) związane z aktywnością system Ysc kodowanego przez plazmid pyv. Dostępne publikacje wskazują, iż u ludzi w przebiegu zakażenia pałeczkami Y. enterocolitica bioserotypu 1B/O8 zostaje pobudzony układ immunologiczny i dochodzi do syntezy immunoglobulin swoistych dla białek YopH, YopN lub YpkA/YopO (4, 9). Występowanie przeciwciał swoistych dla tych trzech białek w próbkach surowicy uzyskanych od osób z jersiniozą opisywane było już przez innych badaczy (4, 9). Wyniki prowadzonych niezależnie badań dotyczących typowania metodą PFGE 64 izolatów Y. enterocolitica 1B/O8, wyosobnionych w 2009 roku w Polsce od ludzi (w tym izolatów użytych w niniejszych badaniach) wykazały, że badane izolaty pałeczek Y. enterocolitica 1B/O8 wykazują tak wysoki stopień genetycznego podobieństwa, że można je określić mianem klonu (17). Z tej przyczyny, opisane zjawisko braku zdolności do wytwarzania białek Ysa i Ysp izolatów Y. enterocolitica 1B/O8 wyosobnionych w kraju wydaje się być cechą epidemicznego szczepu tych drobnoustrojów występującego w Polsce i nie powinno być utożsamiane z ogółem szczepów Y. enterocolitica 1B/O8, o czym świadczą zgodne z danymi piśmiennictwa wyniki uzyskane dla badanych szczepów referencyjnych tych drobnoustrojów wyizolowanych w innych krajach. Wyjaśnienie przyczyny braku zdolności do wytwarzania białek Ysa i Ysp opisanej tu dla izolatów epidemicznego szczepu Y. enterocolitica 1B/O8 wymaga natomiast przeprowadzenia dalszych badań, w tym analizy sekwencji promotorowych, systemów regulatorowych i poziomu ekspresji genów znajdujących się w wyspie patogenności Ysa. Badania były finansowane ze środków Narodowego Centrum Nauki przeznaczonych na realizację projektu badawczego nr N N401 076039.

254 N. Rokosz-Chudziak i inni Nr 4 PIŚMIENNICTWO 1. Fabrega A, Vila J. Yersinia enterocolitica: pathogenesis, virulence and antimicrobial resistance. Enf Inf Med 2012; 30: 24-32. 2. Furman S, Napiórkowska A, Sadkowska-Todys M. Jersinioza w Polsce w 2009. Przegl Epidemiol 2011, 65: 235-8. 3. Gierczyński R. Filogeneza, chorobotwórczość i zróżnicowanie pałeczek Yersinia enterocolitica. Med Dośw Mikrobiol 2012; 64:159-81. 4. Golkocheva-Markova E, Christova I, Stoilov R i inni. Cross-reaction between Yersinia outer membrane proteins and anti-borrelia antibodies in sera of patients with Lyme disease. Clin Microbiol Infec 2008;14: 873-5. 5. Matsumoto H, Young GM. Proteomic and functional analysis of the suite of Ysp proteins exported by the Ysa type III secretion system of Yersinia enterocolitica Biovar 1B. Mol Micriobiol 2006; 59: 689-706. 6. Matsumoto H, Young GM. Translocated effectors of Yersinia. Curr Opin Microbiol 2009; 12: 94-100. 7. Mildiner-Earley S, Walker KA, Miller VL. Environmental stimuli expression of the Ysa type three secretion locus. W: The genus Yersinia: from genomics to function. Red. RD Perry, JD Fetherston., Springer Scince-Bussines Media, LLC. USA, 2007, 211-3. 8. Rastawicki W, Szych J, Rokosz N i inni. Seasonality of Yersinia enterocolitica bioserotype 1B/O:8 infections in Poland. Epidemiol Infect 2013; 2039-42. 9. Rawlins ML, Gertner C, Hill HR i inni. Evaluation of a western blot method for the detection of Yersinia antibodies: evidence of serological cross-reactivity between Yersinia outer membrane proteins and Borrelia burgdorferi. Clin Vacc Immunol 2005; 12: 1269-74. 10. Szych J. Rozprawa doktorska pt. Ocena przydatności odczynów nowej generacji do wykrywania przeciwciał dla wybranych O antygenów pałeczek Salmonella i Yersinia oraz antygenu wspólnego pałeczkom jelitowym. PZH, Warszawa, 1993r. 11. Walker KA, Miller VL. Regulation of the Ysa type III secration system of Yersinia enterocolitica by YsaE/SycB and YsrS/YsrR. J Bacteriol 2004; 186: 4056-66. 12. Walker KA., Miller VL. Synchronous gene expression of the Yersinia enterocolitica Ysa type III secretion system and its effectors. J Bacteriol 2008; 191: 1816-26. 13. Witkowski SE, Walker KA, Miller VL. YspM, a newly identified Ysa type III secrated protein of Yersinia enterocolitica. J Bacteriol 2008; 190: 7315-25. 14. Young BM, Young GM. Evidence for targeting of Yop effectors by the chromosomaly encoded Ysa type III secretion system of Yersinia enterocolitica. J Bacteriol 2002; 184: 5563-71. 15. Young BM, Young GM. YplA is exported by Ysc, Ysa, and flagellar type III secretion systems of Yersinia enterocolitica. J Bacteriol 2002:1324-34. 16. Zacharczuk K, Rokosz N, Rastawicki R i inni. The epidemic high pathogenicity strain of Yersinia enterocolitica 1B/O8 circulating in Poland is permanently defective for productions of the chromosomal T3SS known as the Ysa-Ysp show by multiple serial passages. Presented at the European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases, Berlin, 27-30 April, 2013. 17. Zacharczuk K. Rozprawa doktorska pt. Molekularna charakterystyka pałeczek Yersinia enterocolitica 1B/O8 wyizolowanych od ludzi w Polsce w 2009 roku, NIZP PZH, Warszawa, 2013. str. 17-18. Otrzymano: 25 XI 2013 r. Adres Autora: 00-791 Warszawa, ul. Chocimska 24, Zakład Bakteriologii Narodowego Instytutu Zdrowia Publicznego Państwowego Zakładu Higieny w Warszawie