Spektrometria masowa

Rozdział 5 Spektrometria masowa 5.1. Wstęp Spektrometria masowa jest techniką analityczną, umoŝliwiającą dokładny pomiar masy. Nie jest to metoda nowa albowiem pierwsze instrumenty wprowadzono do uŝytku juŝ w latach 1907-1912. Za protoplastę spektrometru masowego uwaŝa się aparat skonstruowany przez J.J. Thomson a w roku 1897, za pomocą którego wyznaczono stosunek masy do ładunku (m/z) dla elektronu. W ostatnich latach spektrometria masowa przeŝywa dynamiczny rozwój, szczególnie w zastosowaniach w proteomice (patrz kolejne rozdziały), a instrumenty stają się prostsze w uŝyciu, tańsze i znacznie łatwiejsze w obsłudze. Poza wspomnianą juŝ proteomiką i identyfikacją materiału biologicznego, moŝliwości stosowania spektrometrii masowej są bardzo szerokie, począwszy od ochrony środowiska (np. identyfikacja dioksyn) poprzez analizę metali śladowych, analizę i identyfikację syntetyzowanych związków, analizę produktów ropopochodnych, badania farmakologiczne czy kontrolę antydopingową i identyfikację narkotyków. Spektrometria masowa stosowana jest takŝe w diagnostyce medycznej do monitorowania tzw. programu metadonowego, a takŝe do diagnostyki mutacji białek, np. hemoglobin. 5.2. Zasada działania spektrometru masowego Wszystkie spektrometry masowe, bez względu na konstrukcję, pozwalają na wyznaczenie stosunku masy do ładunku (m/z). Jest to bardzo istotne załoŝenie, poniewaŝ znajomość metody jonizacji (patrz poniŝej), umoŝliwia nam przeliczenie tego parametru (m/z) na właściwą masę badanego związku. KaŜdy spektrometr masowy, niezaleŝnie od przeznaczenia, składa się z trzech podstawowych segmentów: 1. źródła jonów gdzie badany związek ulega jonizacji i przyśpieszeniu za pomocą pola elektrycznego (tylko cząstki naładowane moŝna przyspieszyć w polu elektrycznym) 2. analizatora, gdzie następuje separacja jonów o takich samych wartościach m/z 3. detektora, w którym jony o takich samych wartościach m/z są zliczane, co daje moŝliwość prowadzenia analiz ilościowych a nie tylko jakościowych. 1

Obrazuje to schemat przedstawiony na rys. 5-1. Układ wprowadzania próbki Źródło jonów Analizator(y) jonów Detektor jonów Rejestrator (komputer) Rysunek 5-1: Poszczególne segmenty spektrometru masowego. Analiza jonów odbywa się w próŝni m.in. celem uniknięcia przypadkowych kolizji z cząsteczkami powietrza. Ta wędrówka jonów w polu elektrycznym w próŝni skłania do przyrównania spektrometrii masowej do elektroforezy w rozrzedzonym powietrzu - przez analogię do elektroforezy w Ŝelu poliakrylamidowym czy elektroforezy kapilarnej (w roztworach). Na rys. 5-2 przedstawiono budowę wysokorozdzielczego, podwójnie ogniskującego spektrometru masowego. Obecność dwóch analizatorów mas zamiast jednego przynosi wiele korzyści. Podwójnie ogniskujący przyrząd oferuje moŝliwość uzyskania znacznie wyŝszej rozdzielczości analiz, co w praktyce oznacza dokładniejszy pomiar masy badanej próbki. Masy cząsteczkowe związków mogą być wyznaczone z dokładnością do czwartego miejsca po przecinku (dla związków o masie do ok. 1000 Da), co umoŝliwia wyznaczenie składu elementarnego badanej próbki. Aby tak dokładny pomiar był moŝliwy do przeprowadzenia, intensywność analizowanego jonu musi być stosunkowo duŝa, poniewaŝ zwiększanie rozdzielczości pomiaru zawsze odbywa się kosztem intensywności sygnału. Przy zbyt niskiej intensywności jonu dokładność pomiaru masy zdecydowanie maleje lub nawet jest niemoŝliwa. 2

2FFR + _ analizator elektrostatyczny analizator magnetyczny 1FFR źródło jonów detektor Rysunek 5-2: Schemat podwójnie ogniskującego spektrometru masowego o normalnej geometrii EB (E - analizator elektrostatyczny, B - analizator magnetyczny, FFR - obszar wolny od pola). W analizie białek, peptydów, oligosacharydów, oligonukleotydów, polimerów, a takŝe niektórych polarnych związków organicznych, stosuje się współcześnie dwie techniki jonizacji: electrospray (elektrorozpraszanie, elektrorozpylanie) i desorpcję/jonizację laserową wspomaganą matrycą (matrix-assisted laser desorption/ionization, MALDI). W uŝyciu jest takŝe nieco starsza metoda jonizacji przez bombardowanie obojętnymi cząsteczkami (Fast Atom Bombardment, FAB) i jej warianty. Ze wzgledu na ograniczoność miejsca, opisane zostaną jedynie electrospray i MALDI, jako najbardziej rozpowszechnione w analizie białek, peptydów i innych związków endogennych. 5.3. Podstawowe pojęcia Widmo masowe to zbiór wszystkich jonów przedstawiony w sposób graficzny. Znajdują się na nim zidentyfikowane w czasie analizy jony o poszczególnych wartościach m/z. Na osi x odkłada się wartości m/z a na osi y względną intensywność poszczególnych jonów. Jonem molekularnym nazywamy zjonizowaną formę analizowanej cząsteczki. MoŜe to być np. metan pozbawiony elektronu (CH 4 ) + lub sprotonowany peptyd [M + H] +. Próbka, zawierająca kilka składników będzie reprezentowana na widmie masowym poprzez kilka jonów molekularnych, z których kaŝdy odpowiada konkretnej substancji. Technika electrospray polega na jonizacji związków przy zastosowaniu wysokiego napięcia (około 2-5 kv). Próbka, rozpuszczona w fazie ruchomej (patrz rozdział: techniki chromatograficzne), przepływa przez cienką kapilarę kwarcową (fused-silica), na końcu 3

której przyłoŝone jest wysokie napięcie. W wyniku działania tego potencjału powstaje rozproszona chmura jonów (spray), jak na rys. 5-3 poniŝej. kapilara ciśnienie atmosferyczne wysoka próŝnia d~100um przepływ cieczy 5-100 ul/min. suche jony do spektrometru 2500V naładowane kropelki Rysunek 5-3: Budowa źródła electrospray i zasada działania metody. Ruch chmury jonów odbywa się w kierunku analizatora, poniewaŝ w analizatorze mamy próŝnię. Jony substancji zostają w trakcie swojej drogi osuszane przy pomocy strumienia azotu a niekiedy przechodzą dodatkowo przez ogrzewana kapilarę. Tak więc do analizatora docierają suche jony bez rozpuszczalnika. Metoda electrospray ma jeszcze jedną bardzo istotną zaletę sam proces jonizacji (na końcu kwarcowej kapilary) odbywa się w obszarze znajdującym sie pod ciśnieniem atmosferycznym. Oznacza to, Ŝe nie ma tu ograniczeń związanych z wprowadzaniem znacznych objętości roztworów bez ryzyka utraty wysokiej próŝni. To z kolei umoŝliwia bezpośrednie połączenie spektrometrii masowej z wysokosprawną chromatografią cieczową (HPLC) lub elektroforezą kapilarną. Fazę ruchomą w technice electrospray (analiza peptydów i białek) stanowią najczęściej mieszaniny: woda/metanol (50:50) lub woda/acetonitryl (50:50) z dodatkiem 0.1% kwasu mrówkowego. Dodatek kwasu trifluorooctowego, stosowanego rutynowo w HPLC, moŝe spowodować znaczne obniŝenie sygnału i pogorszenie czułości analiz. Przeciętna czułość metody electrospray w nowoczesnych urządzeniach wynosi około 250 fmoli. Technika ta nadaje się przede wszystkim do analizy polarnych związków i małych białek do około 30 kda. Jonizacja ESI moŝe być połączona z róŝnymi analizatorami: magnetycznymi, kwadrupolowymi, pułapkowymi lub pomiaru czasu przelotu. Uzupełnienie systemu o 4

automatyczny sampler próbek zwiększa znacząco moŝliwości analityczne takich instrumentów. Metoda MALDI oparta jest na jonizacji promieniem lasera. Energia lasera przekazywana jest matrycy zmieszanej z badaną próbką i przenoszona na analizowaną substancję. Wykaz najczęściej stosowanych matryc znajduje się w tabeli 5-1. Idealna matryca powinna spełniać pewne warunki: 1. być stabilna 2. nie wchodzić w reakcje z badaną substancją 3. dawać stosunkowo niewielką liczbę sygnałów w spektrometrze aby nie maskować analizowanej próbki 4. Tabela 5-1: Niektóre matryce, stosowane w technice MALDI. Matryca Zastosowanie Wzór strukturalny kwas sinapinowy peptydy, białka CHCOOH CH H 5 C 2 O OH OC 2 H 5 kwas α-cyjanohydroksycynamonowy (αchca) peptydy, białka C(CN)COOH CH OH kwas 2,5-dihydroksy-benzoesowy (DHB) mieszaniny peptydów, węglowodory, glikolipidy, COOH OH syntetyczne polimery polarne, małe cząsteczki H O kwas 3-hydroksopikolinowy, kwas 2-aminobenzoesowy oligonukleotydy N COOH OH COOH NH 2 Ditranol syntetyczne polimery niepolarne OH O OH, 5

W ostatnim roku opisana została moŝliwość jonizacji laserowej na modyfikowanej powierzchni krzemu, bez uŝycia jakiejkolwiek matrycy. Jest to niezwykle obiecująca perspektywa, eliminująca problem doboru matrycy i stwarzająca moŝliwości analizy niskocząsteczkowych związków. W wyniku uderzenia promiania lasera (rys. 4A), próbka ulega jonizacji co jest warunkiem jej przyspieszenia w polu elektrycznym. Laser H + Próbka zmieszana z matrycą r Wzbudzenie matrycy promieniem lasera Desorpcja próbki i jonizacja Rysunek 5-4A: Jonizacja za pomocą promienia laserowego w metodzie MALDI. W odróŝnieniu od metody ESI, w aparacie panuje wysoka próŝnia. Próbki, zmieszane z matrycą, przygotowuje sie na płytce mieszczącej kilkanaście do kilku tysięcy miejsc. A więc metoda ta, po zautomatyzowaniu, moŝe być niezwykle wydajna. Jony analizowane są za pomocą detektora czasu przelotu (time-of-flight, TOF), w którym jony cięŝsze docierają wolniej do detektora niŝ jony lŝejsze. Przypominamy w tym miejscu ponownie, Ŝe wynikiem analizy jest zawsze wartość m/z a nie masa próbki. Zasadę działania tej metody obrazuje rys. 5-4B. 6

Rysunek 5-4B: Zasada działania MALDI TOF. Na rysunku zaznaczona jest droga jaką przebywają jony w analizatorze czasu przelotu (TOF). Na końcu toru, jony o tych samych wartościach m/z są ogniskowane za pomocą układu soczewek elektronicznych (reflectron) i zawracane do detektora. Soczewki (reflectron) spełniają podwójną rolę: ogniskują jony poprawiając rozdzielczość analiz a droga przebyta przez jony wydłuŝa się prawie dwukrotnie co dodatkowo zwiększa rozdzielczość pomiarów. Widmo albuminy wołowej wykonane metodą MALDI TOF przedstawia rys. 5-5. Największą intensywność ma jon molekularny o wartości m/z 66431, ale widoczne są takŝe: dwukrotnie sprotonowany jon (m/z 33 216) i dimer (m/z 132 899). Bez dodatkowych analiz trudno jest, na podstawie uzyskanych danych, stwierdzić, czy dimer albuminy tworzy się w spektrometrze masowym czy teŝ rzeczywiście występuje w analizowanej próbce. Pozostałe sygnały widoczne na widmie masowym mogą pochodzić prawdopodobnie od zanieczyszczeń znajdujących się w próbce. 7

[M+H] + [M+2H] 2+ 2[M+H] + Rysunek 5-5: Widmo albuminy wołowej (ok. 2 pmole) wykonane techniką MALDI TOF. Na widmie, oprócz jonu molekularnego, dobrze widoczne są równieŝ: jon podwójnie naładowany oraz dimer. m/z Metoda MALDI TOF posiada szereg zalet. Jedną z nich jest moŝliwość analizowania substancji o masach nawet do miliona Da. Dzięki zastosowaniu nadmiaru matrycy w stosunku do analitu ogranicza się powstawanie agregatów i ułatwia formowanie jonów molekularnych. Ponadto nie ma potrzeby dostrajania długości fali lasera do częstotliwości absorpcji analizowanych próbek - wystarczy jedynie dobrać odpowiednią matrycę dla danej klasy związku (przykłady w tabeli 5-1). Technika MALDI TOF nadaje się ponadto do identyfikacji związków w chemii kombinatorycznej. 5.4. Interpretacja wyników Jak juŝ wspomniano, spektrometr masowy, bez względu na konstrukcję, podaje w wyniku analizy wartość m/z a nie masę. Wybór metody jonizacji determinuje dalszą interpretację uzyskanych wyników. Zastanówmy się, co stanie się ze związkiem o masie 5000 Da poddanemu jonizacji. JeŜeli w wyniku procesu jonizacji przyłączy się do niego jeden proton, to obserwowany w aparacie sygnał będzie miał wartość: m/z = (5000 +1)/1 czyli 5001 JeŜeli przyłączone zostaną dwa protony, wówczas sygnał będzie miał wartość: 8

m/z = (5000+ 2)/2 czyli 5002/2 =2501 Dodanie np. 10 protonów spowoduje obserwację naszej próbki w zakresie m/z = 501. PowyŜsze proste wyliczenia pokazują, Ŝe moŝliwa jest analiza związków nawet o znacznych masach w zakresie m/z 500-2000. Protony przyłączane są do zasadowych aminokwasów Arg i Lys oraz do N-końca i liczba tych reszt warunkuje stopień jonizacji. Mówimy, Ŝe czasteczka jest np. pięciokrotnie zjonizowana, jeŝeli przyłączone zostało 5 protonów. Z drugiej strony, moŝemy w prosty sposób wyliczyć rzeczywistą masę takiej 5-krotnie zjonizowanej próbki. Jezeli wartość m/z wynosi dla niej np. 700 to masa próbki wyliczymy: (700x5) 5 czyli 3500 5= 3495 Da. Podstawowe wyliczenia w spektrometrii masowej wymagają zastosowania czterodziałaniowego kalkulatora. Rysunek 5-6: Widmo ESI dla peptydu. Widoczny jon molekularny [M+H] + o m/z 1066,3 oraz dwukrotnie naładowany jon [M+2H] 2+ o m/z 533,6. Rys. 5-6 przedstawia widmo masowe peptydu o masie 1065,3. Na widmie masowym największą intensywność ma jon o wartości m/z = 533,6. Rozkład izotopowy w otoczeniu tego sygnału wskazuje na róŝnicę co 0,5 m/z. To świadczy, Ŝe jon ten jest dwukrotnie naładowany. Wiedząc, Ŝe wartość m/z dla tego piku wynosi 533,6, łatwo wyliczyć, Ŝe masa peptydu równa jest: (533,6 x 2) 2= 1065,2. 9

Zasadę podaną powyŝej wykorzystuje się w metodzie electrospray, gdzie moŝliwe jest nawet przyłączenie znacznej liczby protonów. Przykładem jest widmo mioglobiny przdstawione na rys. 5-7 A ib. A m/z B masa 10

Rysunek 5-7: A) Widmo masowe końskiej mioglobiny (wstrzyknięto 12 pmoli białka) wykonane techniką electrospray. Wybranym pikom przyporządkowano odpowiedni stopień jonizacji; B) transformacja widma masowego do masy rzeczywistej związku (dekonwolucja). W wyniku jonizacji uzyskano szereg jonów o róŝnej liczbie przyłączonych protonów. Widmo takie naleŝy poddać t.zw. dekonwolucji czyli przeliczenia danych na rzeczywistą masę białka. Dla ułatwienia, te obliczenia wykonuje się przy pomocy oprogramowania dostarczanego wraz z instrumentem. Innym przykładem jest transferryna o masie około 78 kda. Jest to białko heterogenne, ze względu na niejednorodne obładowanie resztami cukrowców, co przedstawia rys. 5-8A i 5-8B. Rysunek 5-8A: Widmo ESI transferryny. Widoczne wielokrotnie naładowane jony. 11

Rysunek 5-8B: Widmo ESI transferryny. Powiększony obszar na widmie wskazuje na obecność reszt cukrowych, przyłączonych do łańcucha białkowego Przyjęliśmy tu, dla uproszczenia, Ŝe analizujemy wyłącznie jony dodatnie, co jest prawdą w przewaŝającej większości przypadków w analizie peptydów i białek (ale juŝ nie w przypadku analizy oligosacharydów i oligonukleotydów). Proces dekonwolucji wykorzystuje zaleŝności pozwalające zinterpretować widmo masowe złoŝone z wielokrotnie naładowanych jonów i wykonane metodą electrospray. Stosowany algorytm bazuje na załoŝeniu, Ŝe dwa sąsiadujące piki (o wartościach m/z = m 1 i m 2 ) róŝnią się jednym ładunkiem. Uwzględniając to załoŝenie, poniŝsze równania stosowane są do wyznaczenia stopnia jonizacji (n 1 i n 2 ) oraz masy cząsteczkowej badanego związku: n 2 = n 1 1 (dla: m 2 > m 1 i n 2 < n 1 ) (1) n 2 = (m 1 m a )/(m 2 m 1 ) (2) M = n 2 (m 2 m a ) (3) gdzie: m 1 - m 2 - m a - wartość m/z dla pierwszego piku wartość m/z dla drugiego piku masa przyłączonego jonu. Najczęściej masa ta stanowi masę protonu i wynosi 1 a.m.u. Jako przykład, opisany algorytm zastosowany zostanie do wyznaczenia masy transferryny. Widmo masowe transferryny przedstawione jest na rys. 5-8B. Do równań powyŝej 12

wybierzemy piki o wartościach m/z 1420,3 i 1446,5. MoŜemy teraz zdefiniować m 1, m 2 i ma jako: m 1 = 1420,3 m 2 = 1446,5 m a = 1 Stąd, po wprowadzeniu do równania (2): n 2 = (1420,3 1)/(1446,5 1420,3) = 1419,3/26,2 = 54 (stąd, stopień jonizacji dla n 2 wynosi 54). Podstawienie tej wartości do równania (3) daje: M = n 2 (m 2 m a ) = 54(1446,5 1) = 54 x 1445,5 = 78 057 Dla uzyskania lepszej dokładności naleŝałoby powtórzyć analogiczne obliczenia dla innej pary jonów i wyciągnąć średnią wartość ze wszystkich obliczeń. Kalkulacje takie moŝna wykonać za pomocą odpowiednich programów. 5.5. Porównanie metod Analiza związków za pomocą ESI oraz MALDI powoduje zawsze przyłączenie jednego lub większej liczby protonów. Podstawową róŝnicą pomiędzy tymi dwiema metodami jest liczba przyłączonych protonów. W technice ESI liczba przyłączonych protonów zaleŝy na ogół od wielkości cząsteczki a tym samym od liczby zasadowych aminokwasów. W metodzie MALDI przyłączany jest zazwyczaj tylko jeden proton, w rzadkich wypadkach widoczne są cząsteczki podwójnie czy potrójnie zjonizowane, ale zawsze mają one znacznie niŝsze intensywności. Reasumując, technika ESI wymaga najczęściej dekonwolucji celem wyznaczenia rzeczywistej masy, natomiast technika MALDI pozwala na bezpośrednie wyznaczenie m/z dla jonu molekularnego. PoniewaŜ w zaokrągleniu masa protonu wynosi 1 Da, przybliŝoną masę związku moŝna łatwo wyliczyć. Dodatkowo, metoda MALDI umoŝliwia równoczesną analizę wielu substancji w mieszaninie. ESI natomiast wymaga zastosowania połączonych technik LC/MS lub CE/MS do analizy złoŝonych mieszanin ale wówczas jej moŝliwości rozdzielcze wzrastają niepomiernie. Obie techniki wzajemnie się uzupełniają i powinny być stosowane równolegle. Metoda MALDI jest w chwili obecnej znacznie czulsza niŝ standardowa technika ESI i osiąga poziom nawet zeptomolowy (10-21 mola). Ponadto, próbka zdeponowana wraz z matrycą na płytce pozostaje tam po analizie i moŝe być następnie wykorzystana do dalszych testów. Natomiast próbka raz wprowadzona do spektrometru z jonizacją ESI jest tracona 13

bezpowrotnie. Nie bez znaczenia jest takŝe czas analizy. Próbka zdeponowana na płytce MALDI moŝe być analizowana wielokrotnie. Czas analizy w metodzie ESI jest krótszy i warunkowany szybkością przepływu fazy ruchomej (patrz podpunkt nanospray). 5.6. Rozdzielczość Jak moŝna zauwaŝyć na prezentowanych wcześniej widmach, niektóre sygnały są dobrze porozdzielane względem siebie a inne zlewają się razem i nie udaje się uzyskać rozkładu izotopowego. Dotyczy to zwłaszcza jonów o wyŝszych wartościach m/z. Mówimy tu o rozdzielczości analizy. Rozdzielczością nazywamy zdolność urządzenia do rozdzielania dwóch sygnałów i w praktyce parametr ten nie róŝni się od np. od zdolności rozdzielczej kolumny chromatograficznej. Rozdzielczość wyraŝamy zaleŝnością, przedstawioną na rys. 5-9. Rysunek 5-9: Rozdzielczość wyznaczana przy 10% wysokości piku. Rozdzielczość moŝemy zdefiniować np. jako t.zw. rozdzielczość jednostkową (unit resolution), przy której istnieje moŝliwość rozróŝnienia masy 100 od masy 101 lub masy 1000 od masy 1001. ZaleŜność wyznaczająca rozdzielczość przedstawiona jest jako: R = m/ m (4) gdzie: R rozdzielczość; m masa jednej substancji m róŝnica mas pomiędzy dwoma sąsiadujacymi pikami 14

RozwaŜmy prosty przykład. Oznaczamy związek o m = 100. Aby rozróŝnić ten jon od sąsiedniego, róŝniącego się o 1 Da (czyli 101 Da i m = 1), rozdzielczość analizy musi wynieść: R = 101/1 = 100 Dla dwóch związków o masach odpowiednio: 1000 i 1001 parametr R wyniesie juŝ: R = 1000/1 = 1000 Rozdzielczość moŝna takŝe wyznaczyć dysponując widmem jednego piku. Parametr ten wynosi wówczas: R = W 10% /m (5) gdzie: W - szerokość piku przy 10% wysokości; m - masa piku Analizy przy wysokiej rozdzielczości wykonuje się przede wszystkim dla niskocząsteczokwych związków organicznych (do ok. 500 Da). Chodzi tu o bardzo dokładne wyznaczenie masy substancji do 4 miejsca dziesiętnego i z dokładnością ok. 5 ppm. Aby spełnić te warunki, rozdzielczość musi wynosić 5-10 000. Spektrometria masowa słuŝy w tym wypadku do wyznaczenia składu elementarnego związku. Warto zaznaczyć, Ŝe podwyŝszona rozdzielczość analiz w przypadku peptydów i innych związków wysoko cząsteczkowych jest pomocna w wyznaczeniu stopnia jonizacji. Ułatwia to późniejszą dekonwolucję widma. 5.7. Nanospray i nanotechnologie Rosnące zainteresowanie analizą materiału biologicznego, gdzie dostępność tkanek czy płynów ustrojowych jest znacznie ograniczona, stworzyło potrzebę opracowania odpowiednich mikrometod. Metody te umoŝliwiają kompleksową analizę związków w bardzo małych objętościach i z wysoką czułością. Jedną z tych metod jest nanospray, odmiana techniki electrospray, działająca przy bardzo niskich przepływach fazy ruchomej (pomiędzy 20-300 nanolitrów). Niski przepływ oraz bardzo mała średnica kapilary powodują co najmniej 10-krotną poprawę wydajności jonizacji co oznacza, Ŝe znacznie więcej cząsteczek analizowanego związku zostanie zjonizowanych i dotrze do detektora co wpływa znacząco na poprawę czułości oznaczeń. Niski przepływ fazy ruchomej umoŝliwia takŝe wydłuŝony czas analizy. JeŜeli przyjmiemy, Ŝe nasza próbka znajduje się w objętości 1 mikrolitra, to przy 15

przepływie 50 nanolitrów/min będziemy w stanie analizować ją przez około 20 minut! W tym czasie moŝna wykonać zarówno analizę jonu molekularnego dla kilku składników mieszaniny, ale takŝe przeprowadzić fragmentację celem uzyskania sekwencji peptydów. Zupełnie inny wymiar analityczny mają nanotechnologie. Techniki te umoŝliwiają miniaturyzację urządzeń analitycznych i pomiarowych, stosując m.in. trawienie nanostruktur na płytkach krzemowych. Struktury takie zawierają kompletny system chromatograficzny wraz z mieszalnikiem gradientu, kolumną a nawet detektorem. Dla przykładu, cały chromatograf gazowy z kolumną oraz detektorem mieści się w przeciętnych rozmiarów mydelniczce. System dla chromatografii cieczowej oraz widmo masowe uzyskane za jego pomocą przedstawione są na rys. 5-10. Układ ten ma wymiary około 15 x 15 mm. Rysunek 5-10: Przykłady mikrosystemów TAS. Inną technologią wprowadzaną w chwili obecnej jest tworzenie całych systemów analitycznych na płytkach z tworzyw sztucznych, w których znajdują się mikrokanaliki. Systemy te są w załoŝeniu układami jednorazowego uŝytku i zawiarają kompletne systemy analityczne. Nie bez podstaw, urządzenia takie określane są często jako laboratoria na mikrochipach lub zintegrowane systemy analityczne (the lab on the chip, total analysis systems, TAS) i mają ogromne perspektywy rozwoju w najbliŝszych 10 latach. 16

5.8. Wyznaczanie sekwencji aminokwasowej Spektrometria masowa umoŝliwia równieŝ wyznaczanie struktury I-rzędowej peptydów. Stwarza to dodatkowe moŝliwości identyfikacyjne, w oparciu o bazy danych o białkach (patrz równieŝ rozdział Proteomika). MoŜliwość fragmentacji zapewniają kolizje jonów z atomami gazu szlachetnego (Hel, Argon), zachodzące w komorze kolizyjnej. Technika ta nosi nazwę tandemowej spektrometrii masowej (tandem mass spectrometry, MS/MS, collision-induced dissociation, CID). Na rys. 5-11 przedstawiono poszczególne etapy fragmentacji. Ÿród³o jonów pierwszy analizator komora kolizyjna drugi analizator rejestrator (komputer) wszystkie jony jon próbki o wybranym m/z (jon macierzysty) fragmentacja jonu macierzystego (jony potomne) Rysunek 5-11: Zasada eksperymentu MS/MS. Do analizy wybierany jest jon molekularny widoczny na widmie masowym rys. 5-12A. Jony o określonej wartości m/z (jon macierzysty, parent ion) wprowadzane są do komory kolizyjnej, w której znajduje się gaz pod pewnym ciśnieniem. Cząsteczki gazu zderzają się z przyspieszonymi w polu elektrycznym jonami, powodując rozpad peptydu na fragmenty (rys. 5-12C), nazywane jonami wtórnymi (daughter ions) lub fragmentacyjnymi (fragment ions). 17

A Widmo podstawowe B Wyselekcjonowany jon (parent ion) C Widmo MS/MS (daughter ions) m/z Rysunek 5-12: Poglądowy schemat fragmentacji metodą tandemowej spektrometrii masowej. W sytuacji gdy w komorze kolizyjnej nie ma jeszcze gazu, moŝemy obserwować wyłącznie jon o wybranej wartości m/z (rys. 5-12B). Jak wynika z rysunku, na widmie masowym odcięte zostało całe tło oraz inne jony obecne na widmie pierwotnym. W wyniku takiego elektronicznego zabiegu następuje swoiste oczyszczanie jonów oraz poprawiony stosunek sygnału do szumów. Proces ten poprawia czułość analiz i jest stosowany w wielu oznaczeniach rutynowych. W przypadku otrzymywania widm MS/MS dla peptydów, powstałe fragmenty opisuje się zgodnie z powszechnie stosowaną nomenklaturą podaną przez Roepstorff a i Fohlman a i. Zasadę zaproponowanego przez nich nazewnictwa przedstawiono na rys. 5-13. Zgodnie z tą 18

nomenklaturą fragment Y 1 będzie oznaczał fragment związku powstały poprzez rozerwanie pierwszego wiązania peptydowego licząc od strony C-końcowej peptydu. X 2 X 3 Y 3 Y 1 Z 1 Z 3 Y 2 Z 2 X 1 R 1 O R 2 O R 3 O R 4 H 2 N C C N C C N C C N C COOH H H H H H H H A 1 B 1 C 1 A 2 B 2 C 2 A 3 B 3 C 3 Rysunek 5-13: Nazewnictwo jonów fragmentacyjnych w spektrometrii masowej. Według nomenklatury Roepstorff a i Fohlman a. Na rys. 5-14 przedstawiono fragmentację jednego z neuropeptydów, nocyceptyny/orphaniny FQ(1-6). 19

Nociceptin (1-6) Phe-Gly-Gly-Tyr-Phe-Gly Y'' 6 Gly Phe Tyr Gly Gly Gly Phe B 3 B 4 Y'' 5 B 5 A 6 B 2 A 3 Y'' 4 Y'' 3 B 6 m/z Rysunek 5-14: Tandemowe widmo masowe 80 pmoli nocyceptyny (1-6). Eksperyment (rozpad indukowany wysokoenergetycznymi kolizjami) przeprowadzono w pierwszym obszarze wolnym od pola (1FFR) instrumentu przy stałym stosunku B/E. Przepływ próbki ustalono na 150 nl/min. Jony fragmentacyjne opisano zgodnie z nomenklaturą Roepstorff a i Fohlman a. 5.9. Połączenie wysokosprawnej chromatografii cieczowej ze spektrometrią masową Powodem stosowania technik sprzęŝonych (np. LC/MS) jest moŝliwość natychmiastowej detekcji składników mieszaniny w czasie ich rozdziału na kolumnie chromatograficznej. Spektrometr masowy wykorzystuje się w tym układzie jako jeszcze jeden detektor. Stosowanie takiej metody zapobiega równieŝ utracie części materiału biologicznego poniewaŝ kaŝda operacja zagęszczania próbki, przenoszenia czy pipetowania powoduje adsorpcję składników np. na ściankach probówek, końcówkach pipet itp. Jedną z głównych zalet metody ESI jest jej kompatybilność z technikami HPLC. Kolumny analityczne (I.D. = 4,6 mm) i mikroanalityczne (I.D. = 2,4 mm) wymagają przepływu fazy ruchomej rzędu 0,5-1,0 ml/min., natomiast źródło ESI optymalnie działa przy przepływie 20

cieczy do 100 µl/min. Problem moŝna rozwiązać umieszczając za kolumną tzw. split. Część cieczy trafia wtedy do spektrometru natomiast resztę eluatu moŝna wykorzystać kierując go do detektora UV i ewentualnie do kolektora frakcji (rys. 5-15). HPLC mikser 1ml/min. iniektor 4.6 x 250 mm kolumna split 50 µl/min. ESI-MS 950 µl/min. UV Rysunek 5-15: SprzęŜenie wysokociśnieniowej chromatografii cieczowej ze spektrometrią masową. Trzeba pamiętać, Ŝe w takim układzie tylko część próbki (ok. 5% w zaleŝności od przepływu) trafia do spektrometru co moŝe okazać się wadą, jeŝeli dysponujemy mieszaniną o składnikach występujących w bardzo małych stęŝeniach. Optymalnym rozwiązaniem w takim przypadku wydaje się zastosowanie kolumn kapilarnych (I.D. = 0.3 mm). Przepływ cieczy przez kolumny kapilarne jest rzędu kilku mikrolitrów na minutę. PoniewaŜ w typowych systemach HPLC rzadko występuje moŝliwość uzyskiwania tak niskich przepływów, z pomocą ponownie przychodzi zastosowanie splitu. Tym razem split umieszcza się przed iniektorem (rys. 5-16), dzięki czemu cała objętość wstrzykniętej próbki trafia do spektrometru. HPLC mikser split 2 µl/min. iniektor 0.3 x 300 mm kolumna ESI-MS 178 µl/min. odpady 21

Rysunek 5-16: Przykładowy schemat sprzęŝenia kapilarnej chromatografii cieczowej ze spektrometrią masową. Ilość materiału zuŝytego do rozdziału moŝe być wtedy znacznie mniejsza, niŝ przy zastosowaniu kolumn analitycznych. Przykład zdolności rozdzielczej prototypowej kolumny kapilarnej do sączenia molekularnego (przygotowanej przez firmę LC-Packings, Amsterdam, Holandia) podłączonej do spektrometru masowego, przedstawia rysunek. Na kolumnę wstrzyknięto mieszaninę syntetycznych neuropeptydów. Ilości kaŝdego składnika wprowadzonego do układu wynosiły 50 pmoli, z wyjątkiem Leu-enkefaliny (25 pmoli). Wynik testu obrazuje chromatogram masowy (rys. 5-17), na którym widoczne są profile rozdziału dla poszczególnych składników mieszaniny. 22

Leu-enkefalina Prodynorfina (209-240) Dynorfina A (9-17) Leu-enkefalina-Arg 10:00 20:00 30:00 czas retencji [min.] Rysunek 5-17: Chromatogram masowy mieszaniny peptydów, rozdzielonej na kolumnie kapilarnej Superdex Peptide (0.3 x 300 mm). KaŜdy składnik obecny w mieszaninie w stęŝeniu 50 pmoli z wyjątkiem Leu-enkefaliny (25 pmoli). Wybrane wartości m/z odpowiadają peptydom obecnym w mieszaninie. 5.10. Podsumowanie Spektrometria masowa jest niezwykle szybko rozwijającą się techniką analityczną, umoŝliwiającą jednoznaczną identyfikację badanej próbki. Zaletą spektrometrii masowej jest przede wszystkim jej swoistość czyli moŝliwość bezwzględnej identyfikacji analizowanych związków. Metody chromatograficzne jak np. HPLC, GC, CZE itp. posługują się wyłącznie czasem retencji i ewentualnie widmem UV. Nie są to parametry wystarczające do pełnej identyfikacji substancji. Nawet najbardziej symetryczny pik uzyskany w detektorze UV, moŝe 23

zawierać kilka składników, moŝliwych do zidentyfikowania dopiero w spektrometrze masowym. Czułość współczesnych instrumentów i ich prostota obsługi pozwolą, być moŝe w niedługim czasie, na oznaczanie stęŝeń endogennych substancji bezpośrednio w ekstraktach tkankowych lub płynach ustrojowych. WiąŜe się to ze stosowaniem technik sprzęŝonych jak np. LC/MS, mikrodializa/ms lub CZE/MS. Pełna identyfikacja musi obejmować zarówno pomiar jonu molekularnego jak i fragmentację a uzyskane wyniki powinny być porównane innymi metodami, np. za pomocą sekwencjonowania chemicznego. Podziękowania Autorzy dziękują mgr A. Kraj oraz dr P. Suderowi z Zespołu Neurobiochemii Wydziału Chemii oraz Środowiskowego Laboratorium UJ za cenne uwagi i pomoc w opracowaniu niniejszego tekstu. WyraŜamy równieŝ wdzięczność dr Matthiasowi Pelzingowi, Bruker Saxonia oraz Joergowi Nieblowi, Micromass, za moŝliwość opublikowania rysunków 5-4B i 5-8A i B oraz przekazanie własnych wyników. Rysunek 5-10 został udostępniony przez dr hab. Jan Dziubana z Instytutu Technologii Mikrosystemów, Politechniki Wrocławskiej). Dziękujemy teŝ dr M. Smoluchowi wyraŝenie zgody na przedruk rysunków zamieszczonych w jego rozprawie doktorskiej (UJ, Kraków 1998). 24