Zestaw SIT Szybki Identyfikacyjny Test Szczepów Salmonella Enteritidis i Typhimurium W związku z wprowadzeniem w 2011 roku przez Komisję UE zmian w rozporządzeniach nr 2160/3003 i 2073/2005 w odniesieniu do Salmonelli w świeżym mięsie drobiowym 1, które kładą szczególny nacisk na wykrywanie i identyfikację serowarów S. Enteritidis i S. Typhimurium przygotowaliśmy dla Państwa skrócony zestaw surowic do serologicznej identyfikacji wymienionych szczepów. W skład zestawu wchodzą surowice, które służą do szczegółowej identyfikacji zalecanych szczepów. Istotnym jest rozpoznanie i potwierdzenie serologiczne bakterii Salmonella przy jednoczesnym wykluczeniu innych typów serologicznych o podobnym składzie antygenów rzęskowych (skrócony schemat Kauffmann-White-Le Minor znajduje się na stronie internetowej naszej Firmy www.immunolab.com.pl, w zakładce: do pobrania ). Jednocześnie pragniemy także zwrócić Państwa uwagę na jednofazowe szczepy Salmonella Typhimurium, które odznaczają się szczególną zjadliwością dla ludzi i zwierząt. Informacja dla użytkownika Wprowadzenie Bakterie Salmonella są jedną z głównych przyczyn zatruć pokarmowych. Pośród bakterii z gatunku Salmonella enterica można wyróżnić 2579 różnych serotypów. 80% salmonelloz wywoływanych jest przez serotypy Salmonella Enteritidis oraz Salmonella Typhimurium. Ze względu na wciąż obecne zakażenia produktów żywnościowych, w tym szczególnie mięsa drobiowego, istotnymi są kontrola żywności, diagnostyka oraz dokładna identyfikacja zakażeń. Bakterie Salmonella posiadają antygeny somatyczne (O), otoczkowe Vi oraz rzęskowe (H). Ich identyfikacja jest niezbędna do prawidłowego serologicznego zakwalifikowania badanego szczepu. Antygen somatyczny (O) jest lipopolisacharydem, który można określać u bakterii pobranych z agarowego podłoża twardego wzbogaconego, np. 1,5%. Natomiast antygeny rzęskowe (H) są białkami. Antygeny te są najlepiej wykształcone, gdy bakterie rosną na podłożu miękkim wg Garda. Istotną cechą bakterii Salmonella jest posiadanie jednej lub dwóch faz antygenów rzęskowych, np. szczep Salmonella Enteritidis posiada tylko jedną fazę H:g,m, natomiast szczepy Salmonella Typhimurium mogą posiadać jedną fazę H:i lub dwie fazy H:i oraz H:1,2. W danym momencie ekspresji ulega tylko jedna faza, dlatego aby móc zidentyfikować drugą fazę należy zahamować ekspresję obecnej fazy dominującej. Pozwoli to na ujawnienie drugiej fazy (patrz: Hamowanie fazy dominującej). Wyprodukowane przez nas surowice zawierają przeciwciała przeciwko specyficznym antygenom somatycznym lub rzęskowym. Aglutynacja szkiełkowa przebiega na zasadzie przyłączania się przeciwciał do antygenów bakterii i tworzenia tzw. agregatów/strątów (Rys.1), które są widoczne gołym okiem. Tworzenie się aglutynatów jednocześnie powoduje zwiększanie przejrzystości kropli, w której zostały zawieszone bakterie. Rys. 1 Bakterie z zaznaczonymi antygenami Zastosowanie Przeciwciała 1
Surowice produkowane w Zakładzie Immunolab są króliczymi surowicami poliklonalnymi. Surowice w przygotowanym zestawie pozwalają na pełną identyfikację serologiczną szczepów Salmonella Enteritidis oraz Salmonella Typhimurium zgodnie z zaleceniami 1). Skład Surowice do aglutynacji pałeczek Salmonella są wykonane z surowic królików szczepionych inaktywowanymi szczepami bakterii. Są one kontrolowane z zestawami szczepów i preparowane w rozcieńczeniach pozwalających na uzyskanie czytelnego odczytu w krótkim czasie. Surowice są rozcieńczone w 0,85% NaCl i konserwowane 0,01% mertiolatem w postaci gotowej do użycia. Zestaw zawiera 15 buteleczek surowic wraz z zakraplaczem: HM; O:4; O:9; O:46; H:g,m; H:m; H:q; H:s; H:t; H:i; H:2; H:5, H:6, H:i oraz H:2 do hamowania. Dodatkowo dołączamy podłoże Garda do przygotowania 2x0,5l podłoża 0,5%, którego skład wspomaga rozwój antygenów rzęskowych bakterii Salmonella. Instrukcja szczegółowa Sposób postępowania Po przeprowadzeniu testów biochemicznych, którego wyniki sugerują, że badane szczepy należą do rodzaju Salmonella należy: 1. Badane szczepy hodować w temperaturze 37 0 C przez 20 godzin na podłożu stałym (dla określenia antygenów somatycznych 1,5% agar odżywczy, dla antygenów rzęskowych podłoże miękkie wg Garda). 2. Wykonać test aglutynacji szkiełkowej (patrz: Schemat kolejności postępowania) Przed użyciem doprowadzić surowice do temperatury pokojowej (18-24ºC). W przypadku zmętnienia surowice odwirować przy 4000-5000 RPM przez 30 min. Wykonywanie identyfikacji należy zacząć od sprawdzenia szczepu z 3% roztworem NaCl. Jeśli wystąpi aglutynacja, oznacza to, że szczep jest w fazie szorstkiej i wykazuje auto-aglutynację. Takiego szczepu nie można identyfikować serologicznie w teście aglutynacji szkiełkowej. Następnie przeprowadza się aglutynację z poliwalentną surowicą HM. Pozytywny wynik potwierdza, że badany szczep należy do rodzaju Salmonella. II. Na odtłuszczonym szkiełku podstawowym umieścić kroplę NaCl lub surowicy. III. Opaloną, ostudzoną ezą lub jałową bagietką pobrać szczep z podłoża i umieścić obok kropli. Rozcierać szczep na szkiełku łącząc z surowicą tak, aby powstała jednolita zawiesina o mlecznym kolorze. Eza 2
IV. Kołysząc lekko szkiełkiem ruchem kolistym przez 10 30 sekund (najdłużej do 1 minuty!) obserwować wynik reakcji. Uważać, aby kropla nie ściekła ze szkiełka. Aglutynacja +++ Brak aglutynacji aglutynaty zwiększanie się przezroczystości kropli brak strątów mleczna kropla Aglutynacja jest lepiej widoczna, jeśli wynik reakcji obserwuje się nad ciemnym tłem. NIE DOPUSZCZAĆ DO WYSCHNIĘCIA KROPLI, GDYŻ DAJE TO WYNIK FAŁSZYWIE POZYTYWNY. Wykonać badanie z surowicami O:9 i O:4. Pozytywna reakcja z jedną z surowic pozwala na wstępne określenie grupy serologicznej. [Brak reakcji wskazuje ma konieczność prowadzenia badań z dalszymi surowicami dla antygenów grupowych. Oznacza to, że w badanym materiale nie ma bakterii S. Enteritidis i S. Typhimurium, ale mogą być inne szczepy Salmonella]. Do przeprowadzenia pełnej identyfikacji antygenów rzęskowych należy posiać bakterie na podłoże z agarem miękkim 0,5% wg Garda i inkubować w 37 0 C przez 20 godzin. Materiał do aglutynacji pobiera się z obrzeży porośniętego obszaru płytki.! Należy pamiętać o tym, że samo potwierdzenie obecności pożądanych antygenów nie wystarczy. Trzeba wykluczyć możliwe występowanie innych antygenów, które odróżniają szczepy Salmonella od Salmonella Enteritidis i Typhimurium. Poniżej przedstawione są właściwe wyniki reakcji potwierdzające obecność Salmonella Enteritidis (Tabela 1) oraz Typhimurium (Tabela 2): Tabela 1 Salmonella Enteritidis Surowica 3% NaCl HM O:9 O:46 H:g,m H:m H:q H:s H:t Wynik - +++ +++ - +++ +++ - - - +++ reakcja dodatnia, aglutynacja widoczna gołym okiem - reakcja ujemna, brak aglutynacji, mleczna zawiesina 3
Tabela 2 Salmonella Typhimurium * Surowica 3% NaCl HM O:4 H: i H:2 H:5 H:6 Wynik - +++ +++ +++ +++ - - * Należy pamiętać, że występują również jednofazowe szczepy Salmonella Typhimurium o wzorze antygenowym 1,4,[5],12:i:- +++ reakcja dodatnia, aglutynacja widoczna gołym okiem - reakcja ujemna, brak aglutynacji, mleczna zawiesina Dodatkowe informacje potrzebne do identyfikacji Salmonella Typhimurium Jeśli aglutynacja z surowicą H:i jest dodatnia, a z surowicą H:2 nie, oznacza to silną pierwszą fazę szczepu, którą trzeba zahamować. Drugą fazę ujawnia się przez hamowanie fazy dominującej poprzez dodanie do miękkiego agaru 0,5% wg Garda surowicy z przeciwciałami przeciwko antygenom silnej fazy, w tym wypadku surowicy H:i (szczegółowa procedura: Hamowanie fazy dominującej). Jeżeli po zahamowaniu fazy wciąż nie uzyskuje się potwierdzenia fazy H:2 należy przyjąć, że ma się do czynienia z jednofazowym szczepem S. Typhimurium. Hamowanie fazy dominującej Hamowanie przeprowadza się na płytkach z agarem miękkim wg metody S. Garda, w sytuacji, gdy silne występowanie jednej z faz uniemożliwia wykrycie drugiej fazy szczepu. Sposób postępowania: 1. Upłynnić przygotowany wg przepisu agar miękki 05,% wg Garda w kuchence mikrofalowej i schłodzić do temperatury 45 C. 2. Nakropić zakraplaczem 5 kropli surowicy H do hamowania na środek dna małej, sterylnej płytki Petriego (Ø ok.5 cm). Silna faza H:i -> hamowanie surowicą H:i do hamowania w celu wzmocnienia ekspresji fazy H:2 Silna faza H:2 -> hamowanie surowicą H:2 do hamowania w celu wzmocnienia ekspresji fazy H:i 3. Do nakropionej surowicy dodać ok. 10 ml agaru miękkiego 0,5% wg Garda i wymieszać delikatnie kołysząc płytką. 4. Pozostawić płytki w temperaturze pokojowej, aż do stężenia agaru. (Nie suszyć!) 5. Za pomocą ezy pobrać hodowlę z płytki agarowej lub z hodowli bulionowej i zaszczepić agar w centralnej części. 6. Inkubować przez noc w temperaturze 37 C. 7. Materiał z peryferyjnych części płytki jest odpowiedni do wykonania aglutynacji szkiełkowej. Jeśli dominująca faza H nie została zahamowana, należy powtórzyć procedurę. Materiał do zaszczepienia należy pobrać z płytki, na której przeprowadzano wcześniejsze hamowanie. Przechowywanie i środki ostrożności Surowice należy przechowywać w temperaturze od 2 0 C do 8 0 C. - NIE ZAMRAŻAĆ!. 4
Chronić od światła. Czasami po przedłużonym okresie przechowywania widoczna jest mętność spowodowana wytrąceniem lipoprotein. Wytrącenie można usunąć poddając surowicę wirowaniu (4000-5000 RPM przez 30 min). Nie stosować po upływie terminu ważności zamieszczonego na opakowaniu. 1) ROZPORZĄDZENIE KOMISJI (UE) NR 1086/2011 z dnia 27 października 2011 r. zmieniające załącznik II do rozporządzenia (WE) nr 2160/2003 Parlamentu Europejskiego i Rady oraz załącznik I do rozporządzenia Komisji (WE) nr 2073/2005 w odniesieniu do Salmonelli w świeżym mięsie drobiowym. (9) Zgodnie ze wspólnotowym sprawozdaniem zbiorczym w sprawie tendencji w chorobach odzwierzęcych i ich źródeł, zwierzęcych czynników chorobotwórczych oraz ognisk chorób przenoszonych przez żywność w Unii Europejskiej w 2008 r. przygotowanym przez Europejski Urząd Bezpieczeństwa Żywności około 80 % przypadków salmonellozy u ludzi wywoływanych jest przez Salmonella Enteritidis i Salmonella Typhimurium, podobnie jak w latach poprzednich. Mięso drobiowe pozostaje najważniejszym źródłem salmonellozy u ludzi. (13) Jednofazowe szczepy Salmonella Typhimurium szybko stały się jednym z najbardziej rozpowszechnionych serotypów Salmonelli u kilku gatunków zwierząt i w izolatach klinicznych od ludzi. Zgodnie z opinią naukową w sprawie monitorowania i oceny zagrożenia dla zdrowia publicznego stwarzanego przez szczepy podobne do Salmonella Typhimurium jednofazowe szczepy Salmonella Typhimurium o wzorze antygenowym 1,4,[5],12:i:- są uważane za odmiany Salmonella Typhimurium i, jak wykazują obecne dowody, stanowią zagrożenie dla zdrowia publicznego porównywalne do zagrożenia stwarzanego przez inne szczepy Salmonella Typhimurium. Należy zatem wyjaśnić, że przepisy dotyczące Salmonella Typhimurium mają zastosowanie także do tych szczepów jednofazowych. Producent Zakład Badawczo-Wdrożeniowy Ośrodka Salmonella IMMUNOLAB Sp. z o.o. Adres: 81-451 Gdynia, Al. Zwycięstwa 96/98 Tel./Fax: 058 781-44-91 E-mail: info@immunolab.com 5
Schemat kolejności wykonywania testu aglutynacji szkiełkowej Szczep bakteryjny po przeprowadzeniu szeregu biochemicznego podejrzewany o przynależność do rodzaju Salmonella (posiany na agar 1,5%) Aglutynacja wstępna z 3% NaCl [+++] [ - ] Aglutynacja obecna - - szczep nie może zostać zidentyfikowany Brak aglutynacji - - szczep nie należy do rodzaju Salmonella Brak aglutynacji Aglutynacja wstępna z surowicą HM [ - ] [+++/++] O:4 O:9 O:46 - +++ - Aglutynacja obecna Identyfikacja z surowicami O O:9 i O:4 wg tabeli 1 i 2 O:4 O:9 +++ - Przesianie bakterii na podłoże miękkie wg Garda (Pobieranie materiału z obrzeży porośniętej strefy) Identyfikacja z odpowiednimi surowicami H wg tabeli 1 i 2 H:g,m H:m H:q H:s H:t +++ +++ - - - Salmonella Enteritidis H: i H:2 H:5 H:6 +++ +++ - - Salmonella Typhimurium* * Należy pamiętać, że występują również jednofazowe szczepy Salmonella Typhimurium o wzorze antygenowym: 1,4,[5],12:i:- O:4 O:9 H: i H:2 H:5 H:6 +++ - +++ - - - 6