METODY OZNACZANIA AKTYWNOŚCI ANTYBIOTYKÓW. Podstawowe pojęcia:

Podobne dokumenty
II. Badanie lekowrażliwości drobnoustrojów ćwiczenia praktyczne. Ćwiczenie 1. Oznaczanie lekowrażliwości metodą dyfuzyjno-krążkową

Testy aktywności przeciwdrobnoustrojowej na przykładzie metody dyfuzyjnej oraz wyznaczania wartości minimalnego stężenia hamującego wzrost.

VI. Antybiotyki i chemioterapeutyki ćwiczenia praktyczne

Właściwości biobójcze nanocząstek srebra

II. OZNACZANIE LICZBY BAKTERII Z GRUPY COLI I BAKTERII Z GRUPY COLI TYP FEKALNY METODĄ PŁYTKOWĄ W ŻYWNOŚCI I INNYCH PRODUKTACH wg PN-ISO 4832: 2007

Ćwiczenie 1. Oznaczanie wrażliwości szczepów na metycylinę

IV. Streptococcus, Enterococcus ćwiczenia praktyczne

Czy potrzebujesz pomocy w pisaniu pracy? Nasz numer telefonu: Nasz adres prace@edutalent.pl

ĆWICZENIA Z MECHANIZMÓW DZIAŁANIA WYBRANYCH GRUP LEKÓW

Interpretacja wyników analiz ilości i obecności drobnoustrojów zgodnie z zasadami badań mikrobiologicznych żywności i pasz?

Detekcja i identyfikacja drobnoustrojów. oznaczanie lekowrażliwości bakterii

Biotechnologia w przemyśle farmaceutycznym

XIII. Staphylococcus, Micrococcus ćwiczenia praktyczne

Obszar niepewności technicznej oznaczania lekowrażliwościatu w rekomendacjach EUCAST 2019

Hodowlą nazywamy masę drobnoustrojów wyrosłych na podłożu o dowolnej konsystencji.

ĆWICZENIE I BADANIE WRAŻLIWOŚCI BAKTERII NA ANTYBIOTYKI I CHEMIOTERAPEUTYKI

Odpowiedzi ekspertów EUCAST na pytania najczęściej zadawane przez mikrobiologów dotyczące oznaczeń wrażliwości drobnoustrojów

Leki przeciwbakteryjne. Podstawy antybiotykoterapii. Katedra i Zakład Mikrobiologii Lekarskiej, WUM Dr n. med. Dorota Wultańska

Laboratorium 7. Testy na genotoksyczność

XXV. Grzyby cz I. Ćwiczenie 1. Wykonanie i obserwacja preparatów mikroskopowych. a. Candida albicans preparat z hodowli barwiony metoda Grama

Staphylococcus ćwiczenia praktyczne. a. agarze z dodatkiem 5% odwłóknionej krwi baraniej (AK)

CENTRALNY OŚRODEK BADAŃ JAKOŚCI

Kontrola pożywek mikrobiologicznych. Sekcja Badań Epidemiologicznych

1276: (ATCC

Załącznik Nr 7 do SIWZ

KARTA KURSU. Kod Punktacja ECTS* 4

Nowe definicje klinicznych kategorii wrażliwości wprowadzone przez EUCAST w 2019 roku

Przedmiot zamówienia -Specyfikacja cenowa

1. Demonstracja preparatów bakteryjnych barwionych metodą negatywną ukazujących kształty komórek bakteryjnych.

Ćwiczenie 4-5 Mikrobiologiczne kryteria oceny sanitarnej wody

CZĘŚĆ 1 TEST KASETKOWY DO WYKRYWANIA KALPROTEKTYNY I LAKTOFERYNY W KALE. 53/PNP/SW/2018 Załącznik nr 1 do SIWZ formularz asortymentowo cenowy

PRZEGLĄD: DATA WYDANIA: PRODUCENT: ROSCO Diagnostica A/S, Taastrupgaardsvej 30, DK-2630 Taastrup, Denmark.

ODPOWIEDZI NA PYTANIA

ĆWICZENIE 5 MECHANIZMY PROMUJĄCE WZROST ROŚLIN

Instrukcje do ćwiczeń oraz zakres materiału realizowanego na wykładach z przedmiotu Inżynieria bioprocesowa na kierunku biotechnologia

METODY OZNACZANIA LEKOWRAŻLIWOŚCI DROBNOUSTROJÓW I WYKRYWANIA MECHANIZMÓW OPORNOŚCI NA LEKI MOŻLIWOŚCI TERAPII ZAKAŻEŃ PRZEWODU POKARMOWEGO

XIX. Pałeczki Gram-ujemne część I - ćwiczenia praktyczne

Badania mikrobiologiczne wg PN-EN ISO 11737

Ćwiczenie 1 Morfologia I fizjologia bakterii

KLONOWANIE DNA REKOMBINACJA DNA WEKTORY

Oznaczanie lekowrażliwości kompleksowa oferta firmy

woda do 1000 ml ph=6,9-7,1. Po sterylizacji dodać nystatynę (końcowe stężenie ok. 50 μg/ml). Agar z wyciągiem glebowym i ekstraktem drożdżowym (YS)

Interpretacja wg EUCAST S-wrażliwy I-średniowrażliwy R - oporny

Laboratorium Pomorskiego Parku Naukowo-Technologicznego Gdynia.

Zalecenia rekomendowane przez Ministra Zdrowia. KPC - ang: Klebsiella pneumoniae carbapenemase

Strategia zapobiegania lekooporności

Inżynieria Genetyczna ćw. 3

Adres strony internetowej, na której Zamawiający udostępnia Specyfikację Istotnych Warunków Zamówienia:

Instrukcje do ćwiczeń oraz zakres materiału realizowanego na wykładach z przedmiotu Mikrobiologia na kierunku chemia kosmetyczna

Odpowiedzi ekspertów EUCAST na pytania najczęściej zadawane przez lekarzy klinicystów i mikrobiologów

Badanie właściwości mechanicznych, korozyjnych i przeciwdrobnoustrojowych powłok na bazie ZrC

Lek od pomysłu do wdrożenia

- podłoża transportowo wzrostowe..

VII. Pałeczki Gram-dodatnie: Corynebacterium, Listeria, Erysipelothtix, Lactobacillus - ćwiczenia praktyczne

GRUPA I Lp Nazwa Jm Ilość Cena jedn netto 1. Columbia agar z 5 %krwią baranią

SYLABUS. Wydział Biologiczno - Rolniczy. Katedra Biotechnologii i Mikrobiologii

KARTA PRZEDMIOTU. (pieczęć wydziału) Z1-PU7 WYDANIE N1 Strona 8 z 9

SPRAWOZDANIE Z BADAŃ MIKROBIOLOGICZNYCH Nr 20006/11859/09

CHARAKTERYSTYKA PRODUKTU LECZNICZEGO. Każdy gram maści zawiera jako substancję czynną 20 mg mupirocyny (Mupirocinum) w postaci soli wapniowej.

Ocena skuteczności procesów sterylizacji za pomocą wskaźników biologicznych r.

E.coli Transformer Kit

Zastosowanie nowych technologii w diagnostyce mikrobiologicznej. Ireneusz Popławski

Narodowy Instytut Leków ul. Chełmska 30/34, Warszawa Tel , Fax Warszawa, dn r.

LEKI CHEMICZNE A LEKI BIOLOGICZNE

Monitorowanie oporności w Polsce dane sieci EARS-Net

Oznaczanie wrażliwości patogenów

Instrukcja do ćwiczeń laboratoryjnych

SPRAWOZDANIE Z BADAŃ MIKROBIOLOGICZNYCH Nr 20005/11858/09

Przemiana materii i energii - Biologia.net.pl

Pytania Egzamin magisterski

SZCZEGÓŁOWY OPIS PRZEDMIOTU ZAMÓWIENIA

KARTA PRZEDMIOTU. (pieczęć wydziału) Z1-PU7 WYDANIE N1 Strona 8 z 9

Ćwiczenie 11. Temat: Wskaźniki higieniczne żywności.

Nazwa i typ aparatu:.. Lp. Opis parametru Kryterium Parametr wymagany

PL B1. INSTYTUT PRZEMYSŁU ORGANICZNEGO, Warszawa, PL BUP 23/08

PL B1. UNIWERSYTET MEDYCZNY W LUBLINIE, Lublin, PL BUP 11/11

liczba godzin 2 MIKROBIOLOGIA KOSMETOLOGICZNA dla studentów II roku, studiów I st. kierunku KOSMETOLOGIA półpłynne stałe

Identyfikacja mikroorganizmów systemem firmy Biolog

Columbia Agar + 5% krew barania. Szt Sabouraud Dextrose Agar + chloramfenikol + gentamycyna. Szt. 800

Definicja immobilizacji

BIOSYNTEZA ACYLAZY PENICYLINOWEJ. Ćwiczenia z Mikrobiologii Przemysłowej 2011

POLITECHNIKA ŁÓDZKA INSTRUKCJA Z LABORATORIUM W ZAKŁADZIE BIOFIZYKI. Ćwiczenie 3 ANALIZA TRANSPORTU SUBSTANCJI NISKOCZĄSTECZKOWYCH PRZEZ

Pracownia w Kaliszu Kalisz ul. Warszawska 63a tel: fax: zhw.kalisz@wiw.poznan.pl

RAPORT Z BADAŃ 164/Z/ /D/JOGA. Dostarczony materiał: próbki tworzyw sztucznych. Ilość próbek: 1. Rodzaj próbek: tworzywo

1.Przedmiotem zamówienia jest dostawa kultur mikrobiologicznych z podziałem na 9 niżej wymienionych Pakietów:

Przedmiot : Mikrobiologia

Justyna Krystyna Ciepły Nr albumu Charakterystyka lekoopornych szczepów wirusa HIV 1 izolowanych w Polsce w 2008 roku

1. Biotechnologia i inżynieria genetyczna zagadnienia wstępne 13

Badanie mikrobiologiczne płynów z jam ciała

KARTA KURSU. Podstawy mikrobiologii i immunologii. Dr hab. Magdalena Greczek- Stachura

VIII. Pałeczki Gram-ujemne z rodziny Enterobacteriaceae

Do jednego litra medium dodać 10,0 g skrobi ziemniaczanej lub kukurydzianej i mieszać do uzyskania zawiesiny. Sterylizować w autoklawie.

PL B1. ZACHODNIOPOMORSKI UNIWERSYTET TECHNOLOGICZNY W SZCZECINIE, Szczecin, PL BUP 08/12. EDYTA BALEJKO, Mierzyn, PL

Projekt Alexander w Polsce w latach

BADANIA TOKSYCZNOŚCI ZANIECZYSZCZEŃ ORGANIZMÓW WODNYCH (PN -90/C-04610/01;03;05)

E.coli Transformer Zestaw do przygotowywania i transformacji komórek kompetentnych Escherichia coli

RAPORT Z BADAŃ 01369/2015/D/AGST. Blirt S.A Gdańsk, ul. Trzy Lipy 3/1.38. Dział DNA-Gdańsk. Nr zlecenia

Przygotowanie mianowanych zawiesin szczepów wzorcowych znajdujących zastosowanie w badaniach mikrobiologicznych

PL B1. INSTYTUT BIOTECHNOLOGII SUROWIC I SZCZEPIONEK BIOMED SPÓŁKA AKCYJNA, Kraków, PL BUP 08/08

SYLABUS. Wydział Biologiczno - Rolniczy. Katedra Biotechnologii i Mikrobiologii

Transkrypt:

METODY OZNACZANIA AKTYWNOŚCI ANTYBIOTYKÓW Zakład Biotechnologii i Inżynierii Genetycznej SUM Podstawowe pojęcia: Antybiotyk substancja o aktywności przeciwdrobnoustrojowej, wytwarzana przez mikroorganizmy, uzyskana na drodze półsyntetycznej lub syntetycznej lecz mająca naturalny wzorzec. Chemioterapeutyk substancja o aktywności przeciwdrobnoustrojowej, uzyskana na drodze syntetycznej, nie posiadająca naturalnego wzorca. Oporność: mikrobiologiczna oznacza, że dany szczep posiada mechanizm oporności farmakologiczna zdolność przeżycia w obecności antybiotyku w stężeniu wyższym niż jest możliwe do osiągnięcia w warunkach in vivo kliniczna pomimo osiągnięcia maksymalnych dawek leku zabicie drobnoustrojów nie jest możliwe. krzyżowa niewrażliwość na wszystkie bądź niektóre antybiotyki należące do tej samej grupy chemicznej lub grupy niespokrewnionej, gdy miejsca uchwytu dla antybiotyków znajdują się blisko siebie (np. oporność na linkozamidy i makrolidy) skojarzona mechanizmy oporności wynikające z braku przepuszczalności błony komórkowej lub aktywnego wypompowania leku z komórki, powodujące oporność na więcej niż jedną grupę chemiczną. Oporność nabyta - nowa cecha szczepu, która wynika ze zmian w jego materiale genetycznym. Oporność naturalna jest cechą danego gatunku czy szczepu mikroorganizmów. Może wynikać z: a) braku w komórce celu (np. receptora) dla danego antybiotyku lub niskiego powinowactwa do niego, np. oporność Mycoplasma pneumoniae czy Chlamydia pneumoniae na antybiotyki β-laktamowe b) wytworzenia alternatywnego szlaku metabolicznego (mechanizm by-pass), np. oporność na sulfonamidy c) braku lub utrudnionego transportu antybiotyku przez ścianę komórkową, np. oporność na makrolidy u Enterobacteriaceae d) aktywnego usuwania antybiotyku z komórki przez białka transbłonowe do przestrzeni periplazmatycznej 1

e) wytwarzania enzymów unieczynniających antybiotyk w wyniku jego hydrolizy, np. β-laktamazy rozszczepiające pierścień β-laktamowy f) wytwarzania enzymów wprowadzających do cząsteczki antybiotyku podstawniki, które zmieniają swoistość jego działania, np. O-fosforylacja, N-acetylacja, O-adenylacja odpowiednich pozycji w cząsteczce anminoglikozydów przez enzymy (kodowane w plazmidowym DNA) powoduje inaktywację antybiotyku, uniemożliwiając jego oddziaływanie z rybosomami MIC (ang. minimal inhibitory concentration) wartość określająca najmniejsze stężenie leku, (wyrażone w mg/l), które w warunkach in vitro hamuje wzrost bakterii przy określonej gęstości inokulum i w określonym czasie. MBC (ang. minima bactericidial concentration) wartość określająca najmniejsze stężenie leku, (wyrażone w mg/l), które w warunkach in vitro powoduje zabicie 99,9% komórek bakteryjnych, przy określonej gęstości inokulum i w określonym czasie. Antybiogram wynik oceny wrażliwości danego gatunku drobnoustroju na działanie określonych antybiotyków, przeprowadzonej w laboratorium (na szalce Petriego). Metody określania wrażliwości: 1. Metoda rozcieńczeń (probówkowa) antybiotyk rozcieńcza się w dowolnym stosunku z podłożem bulionowym o odpowiednim składzie (przygotowuje się serię rozcieńczeń antybiotyku), które następnie zaszczepia się badanym szczepem. Zmętnienie lub osad w pożywce świadczy o wzroście bakterii. Największe rozcieńczenie antybiotyku (czyli najmniejsze stężenie), w którym nie wystąpił wzrost przyjmuje się jako MIC. Im mniejsze są różnice pomiędzy wartościami stężeń antybiotyku w szeregu rozcieńczeń, tym uzyskana wartość MIC jest bardziej zbliżona do rzeczywistej. Oznaczenie wykonuje się w probówkach (objętość podłoża wynosi min. 2 ml) lub w płytkach titracyjnych (100 µl). 2. Metoda rozcieńczeń (płytkowa) antybiotyk rozcieńcza się w upłynnionym podłożu agarowym, które po zestaleniu zaszczepia się badanymi drobnoustrojami (jedna płytka = jedno rozcieńczenie antybiotyku). Z użyciem tej samej serii płytek możliwe jest oznaczenie wrażliwości kilkunastu szczepów jednocześnie. 3. Metoda dyfuzyjna (krążkowa) dyfuzja antybiotyku z bibułowego krążka do podłoża agarowego i jego działanie na posiane drobnoustroje. Na płytce ze stałym podłożem metodą murawkową posiewa się badany szczep, a następnie umieszcza się kilka krążków zawierających 2

antybiotyk. Po inkubacji odczytuje się średnicę stref zahamowania wzrostu wokół krążka, będącą miarą wrażliwości szczepów na badaną substancję. Możliwe reakcje oraz typy stref powstających wokół krążka przedstawia poniższa ilustracja: Oporność brak sfery zahamowania: bakterie rosną przy samym krążku. Oporność pośrednia wąska strefa braku wzrostu wokół krążka. Wrażliwość szeroka strefa wokół krążka wolna od wzrostu. Inaktywacja enzymatyczna wąska strefa braku wzrostu wokół krążka. W przeciwieństwie do strefy pośredniej, brzeg strefy jest ostro zarysowany i składa się na niego nieco silniejszy wzrost w postaci pewnych kolonii normalnej wielkości lub większych niż pozostałe. Działanie selektywne taki wynik otrzymuje się, gdy inokulum zawiera dwa szczepy różniące się podatnością na dany antybiotyk. W pobliżu krążka stężenie antybiotyku jest na tyle duże, że hamuje wzrost obydwu szczepów (wąska strefa wolna od wzrostu). W dalszej odległości od krążka (mniejsze stężenie antybiotyku) wzrost jednego ze szczepów zostaje zahamowany, podczas gdy drugi rośnie. Porównanie z kontrolą półstrefa otrzymana ze szczepem kontrolnym (po jednej stronie krążka) jest naprzeciwko półstrefy dla szczepu badanego (po przeciwnej stronie krążka). By to uzyskać, szczepy badany i kontrolny wysiewa się na odrębne połówki szalki, a krążek kładzie się między nimi. Mutanty oporne inokulum zawierało niewielki procent komórek zmutowanych zdolnych do tworzenia kolonii w warunkach hamujących wzrost komórek dzikich. Mutanty zwykle charakteryzują się opornością na antybiotyk. Istnieje jednak pewien typ mutantów rosnących jedynie w obecności danego antybiotyku i mutanty te będą również tworzyć kolonie w strefie wolnej od wzrostu innych komórek bakteryjnych. Przykładem są mutanty zależne od streptomycyny, które mają takie zmiany w rybosomach, że dopiero w obecności streptomycyny następują przemiany konformacyjne pozwalające na ich prawidłowe funkcjonowanie. Zakażenia inokulum składa się z mieszaniny organizmów, z których przynajmniej jeden jest oporny na badany antybiotyk. 3

Synergizm dwa krążki zawierają różne antybiotyki. Strefa zahamowania wzrostu jest większa niż suma efektów każdego z antybiotyków z osobna. Inaczej mówiąc, działanie tych antybiotyków jest synergiczne. Antagonizm dwa krążki zawierają różne antybiotyki. W tym przypadku jeden z antybiotyków hamuje aktywność drugiego. 4. Metoda dyfuzyjna (cylinderkowa) metalowe, szklane lub porcelanowe cylinderki (bez dna) o znormalizowanych wymiarach (10 mm wysokości, 8 mm średnicy) umieszcza się na pożywce agarowej z powierzchniowo posianym szczepem wzorcowym i napełnia roztworami antybiotyku o znanych odpowiednich stężeniach. W czasie inkubacji antybiotyk, dyfundując do pożywki, powoduje zahamowanie wzrostu drobnoustroju. Wielkość stref zahamowania wzrostu jest proporcjonalna do stężenia antybiotyku umieszczonego w cylinderku. Czas i temperatura inkubacji płytek z cylinderkami zależne są od właściwości drobnoustrojów i antybiotyku. Jeżeli mamy do czynienia z antybiotykiem szybko dyfundującym, płytki umieszcza się w cieplarce tuż po napełnieniu cylinderków. W warunkach powolnej dyfuzji związku, przygotowane płytki z wypełnionymi cylinderkami powinny pozostać przez określony czas w niskiej temperaturze. 5. E-testy (ang. Epsilometer tests) antybiotyk dyfunduje z plastikowego paska, w którym stopniowo (gradientowo) zmienia się stężenie antybiotyku do pożywki agarowej, gdzie powierzchniowo posiany został wzorcowy szczep drobnoustroju. 4

6. Genotypowanie kontrola obecności/nabycia genu warunkującego oporność na dany antybiotyk (PCR), analiza mutacji w obrębie genu oporności (PCR, SSCP, sekwencjonowanie, hybrydyzacja). Literatura: 1. Hryniewicz W., Sulikowska A., Szczypa K., Krzysztoń-Russjan J., Gniadkowski M.: Rekomendacje doboru testów do oznaczania wrażliwości bakterii na antybiotyki i chemioterapeutyki. Krajowy Ośrodek Referencyjny ds. Lekowrażliwości Drobnoustrojów. Centralne Laboratorium Surowic i Szczepionek w Warszawie. 2. Markiewicz Z., Kwiatkowski Z.A.: Bakterie antybiotyki lekooporność. Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa 2001. 3. Kędzia W.: Materiały do ćwiczeń z mikrobiologii farmaceutycznej. PZWL, Warszawa 1984. 5