enzymy Immunocytochemia - znaczniki fluorochromy białka zawierające metal cięŝki ferrytyna metal cięŝki złoto koloidalne Metody immunoenzymatyczne Enzymatyczne znaczniki przeciwciał: peroksydaza chrzanowa (HRP) fosfataza zasadowa β-d-galaktozydaza oksydaza glukozowa KaŜdy z tych enzymów katalizuje in vitro przekształcenie substratu w barwny, nierozpuszczalny w H 2 O produkt. Enzym jest sprzęgany z przeciwciałem: kowalencyjne (mostki disiarczkowe) poprzez łączniki dekstranowe wiązanie biotyna- awidyna/streptawidyna (bez ewentualnych zmian konformacji cząsteczki Ab, które moŝe mieć miejsce przy znakowaniu chemicznym Ab) 1
Metody immunoenzymatyczne Metody immunoperoksydazowe (znacznikiem HRP) najbardziej rozpowszechnione łatwa izolacja HRP z korzeni chrzanu mała masa cząsteczkowa (44 kda) i gęstość optyczna HRP HRP łatwo wiąŝe się z białkami (sprzęganie z Ab ) reakcja 2-etapowa: - sprzęganie HRP z aldehydem glutarowym - aktywowaną HRP sprzęga się IgG uzyskiwanie swoistych Ab antyperoksydazowych kompleksy PAP (peroksydaza-antyperoksydaza) Metody immunoperoksydazowe (znacznikiem HRP) H 2 O 2 + RH 2 HRP = R + 2 H 2 O R- utlenione aldehydy, fenole, alkohole - barwne Substraty: DAB (3,3 -diaminobenzydyna) powstaje brązowy polimer, nierozpuszczalny, ze zdolnością wiązania metali cięŝkich ( Cu, Co, Ni, Au) - intensyfikuje barwę /powoduje zmianę barwy - wykorzystanie w ME 3-amino-9-etylokarbazol produkt reakcji czerwony, rozpuszczalny w alkoholu TMB (tetrametylobenzydyna) produkt reakcji Ŝółty ortofenylodiamina produkt barwy pomarańczowej 2
Metody immunoenzymatyczne Enzymatyczne znaczniki przeciwciał c.d.: fosfataza zasadowa - stosowana do znakowania chemicznego Ab i immunologicznego (kompleksy fosfataza-antyfosfataza) - głównie jako znacznik w reakcjach z zastosowaniem mo Ab do równoczesnego wykrywania 2 róŝnych Ag β-d-galaktozydaza oksydaza glukozowa- rzadko stosowane - uŝywane do wykrywania kilku Ag w jednym preparacie Zalety: enzymy pochodzenia bakteryjnego brak niebezpieczeństwa wyników fałszywie pozytywnych Metody immunoenzymatyczne MoŜliwość reakcji fałszywych: negatywnych pozytywnych Konieczność reakcji kontrolnych: reakcja dodatnia (pozytywna) przeprowadzenie oznaczenia (ściśle wg stosowanej procedury) na komórkach na pewno zawierających wykrywany Ag Wynik barwienia negatywny: - nieaktywne przeciwciała - błędy w preparatyce reakcji immunoenzymatycznej 3
Reakcje kontrolne negatywne z pominięciem przeciwciała I-rzędowego z pominięciem mostka immunoglobulinowego (w reakcjach immunoenzymatycznych z uŝyciem mostka) Wynik barwienia pozytywny: - nieswoiste wiązanie Ab II-rzędowego (lub kompleksów E-AE) - endogenna aktywność enzymatyczna reakcja adsorpcyjna (z uŝyciem Ab, które in vitro zostało uprzednio związane ze swoistym Ag) blokowanie właściwej reakcji przez preinkubację ze swoistym, lecz nieznakowanym Ab (przy reakcjach bezpośrednich) inkubacja z surowicą nieimmunizowanego zwierzęcia gatunku, który posłuŝył do uzyskania Ab, zamiast Ab I, swoistego dla danego Ag (przy reakcjach pośrednich) Wynik barwienia pozytywny: - niejednorodne Ab I lub nieswoiste wiązanie Ab I - endogenna aktywność enzymatyczna Wykrywanie Ag metodą immunoenzymatyczną (przykłady) Breast Carcinoma: Estrogen receptor (rm), ImmPRESS Anti-Rabbit Ig Kit, DAB (brown) substrate. Hematoxylin QS (blue) counterstain. http://www.youtube.com/watch?v=i7hin90dbb0 Rak piersi Przeciwciało anty-her-2/neu (metoda ABC) 4
Metody immufluorescencyjne Fluorofory - znacznikami przeciwciał Wprowadzone przez: Albert Coons and Melvin Kaplan (1940-50), potem Mary Osborne (1975) - Ab znakowane izocyjanianem fluoresceiny (FIC) do wykrywania Ag tkankowych Najczęściej stosowane (od lat 70-tych XX w) FITC (izotiocyjanian fluoresceiny) FIC (izocyjanian fluoresceiny) TRITC (izotiocyjanian tetrametylorodaminy) Texas Red (czerwień teksańska) DANSYL (chlorek dansylu) fikoerytryna Najczęściej obecnie stosowane fluorescencyjne znaczniki Ab Fluorofor Absorpcja Emisja Kolor fluorescencji Alexa Fluor 350 345 nm 442 nm fioletowy Pacific Blue 410 nm 455 nm niebieski SYTO 45 452nm 484nm Dansyl cadaverine 335 nm 518nm zielony Alexa Fluor 488 488 nm 519nm FITC 485nm 530nm R-phycoerythrin (R-PE) 496, 546, 565 nm 578 nm TRITC 557 nm 576 nm Cy3 570nm 590nm Phycoerythrin 570nm 590 nm Alexa Fluor 594 590 nm 617 nm pomarańczowy Alexa Fluor 647 650 nm 668 nm czerwony CY5 649 nm 670 nm Alexa Fluor 680 680 nm 702 nm 5
Właściwości znaczników fluorescencyjnych Fluorofory koniugowane z przeciwciałami bezpośrednio lub pośrednio wiąŝącymi się z określonym Ag PoŜądane cechy fluoroforów znacznikowych: sprzęganie z Ab bez zmian właściwości Ab wysoka wydajność fluorescencji mała szerokość wiązki emisyjnej dobra fotostabilność właściwości fluorescencyjne, które nie ulegają zmianie przy koniugowaniu z Ab oraz zmianie lokalnego środowiska Właściwości znaczników fluorescencyjnych Ograniczenia fluoroforów znacznikowych: wyświecanie się (photobleaching) ograniczona wydajność fluorescencji Rodzina fluoroforów Alexa Fluor otrzymane przez modyfikację klasycznych barwników fluorescencyjnych np. fluoresceiny przez Molecular Probes zwiększona jasność zwiększona fotostabilność mniejsza zaleŝność od ph w połączeniu z Ab wysokiej jakości - idealne narzędzie do IMF zarówno w metodach pośrednich jak i bezpośrednich 6
Metody immunofluorescencyjne MoŜliwość reakcji fałszywie pozytywnych lub negatywnych Nieswoista fluorescencja: autofluoresencja - fluorescencja własna komórek/tkanek np. chlorofilu, porfiryn, lipofuscyny, biotyny, ryboflawiny, tiaminy itd. A B C D http://en.wikipedia.org/wiki/file:bananaskin40x_fluorescence_.tif Autofluorescencja komórek skórki banana. Microscope Leica DM500 (A) jasne pole; wzbudzenie: UV (B), światło niebieskie (C), zielone (D) 10µm Autofluorescencja NADH w komórkach ludzkiego raka jelita grubego (linii HCT116). Wzbudzenie UV Nieswoista fluorescencja: brak swoistości lub czystości uŝywanych znakowanych Ab (domieszki Ab o innej swoistości) niska jakość znakowanych Ab obecność wolnego fluoroforu (fluorochromacja); wysoki stosunek molarny F/P (F-zawartośc fluoroforu związanego z białkiem; P- całkowita zawartośc białka) nieswoiste wiązanie białek obecnych w roztworze Ab nieznakowanych Zapobieganie: stosowanie Ab monoklonalnych stosowanie Ab wysokiej jakości właściwy dobór rozcieńczenia Ab rozcieńczanie Ab w PBS z dodatkiem BSA / 0,25% Tritonu X-100 7
Metody immunofluorescencyjne bezpośrednie pośrednie Metody bezpośrednie Zalety: prosta procedura krótki czas barwienia łatwość barwienia 2 (lub więcej) Ag równocześnie Wady: niska czułość metody stosunkowo wysoki koszt ograniczona uŝyteczność Ab I/flou trudności znakowania Ab odpowiednie (gdy odpowiednie Ab nie są dostępne komercyjnie) Metody pośrednie Zalety: Metody immunofluorescencyjne wyŝsza czułość metody relatywnie niŝszy koszt szerokie zastosowanie Ab II/flou duŝa róŝnorodność znakowanych Ab dostępnych komercyjnie Wady: bardziej złoŝona i dłuŝsza procedura moŝliwe reakcje-krzyŝowe (zwiększone prawdopodobieństwo reakcji fałszywych) barwienia 2 (lub więcej) Ag równocześnie wymagają Ab uzyskiwanych od róŝnych zwierząt wyŝsze tło ( preparaty posiadające endogenne immunoglobuliny) 8
Metody immufluorescencyjne Barwienia kilku Ag w jednym preparacie odpowiedni dobór znakowanych Ab odpowiednie filtry (kluczowy jest rodzaj mikroskopu fluorescencyjneg) nakładanie się widm emisji 2 fluoroforów np. w kanale detekcji dla FITC sladowa emisja fluorescencji FITC; w kanale detekcji dla PE częściowa emisja fluorescencji FITC; konieczna kompensacja fluorescencji Metody immucytochemiczne z wykorzystaniem cau Znacznikiem wykrywania komplesów Ag-Ab złoto koloidalne (cau) Metody oparte o wykorzystanie zdolności do adsorpcji makrocząsteczek przez cau (właściwości fizykochemiczne) Etapy znakowania liganda: uzyskanie roztworu cau redukcja kwasu chlorozłotowego za pomocą odpowiedniego reduktora (np. kwasu cytrynowego, kwasu askorbinowego, aldehydu mrówkowego, taniny, roztworu eterowego białego fosforu lub boranu sodu); warunki reakcji, rodzaj reduktora decydują o wielkości ziaren cau wyznakowanie liganda Ab, biotyna, awidyna, Ag oczyszczenie wyznakowanego liganda 9
Zalety: Metody immucytochemiczne z wykorzystaniem cau łatwość otrzymywania cau zdolność do łączenia się w stabilne kompleksy z cząsteczkami znakowanymi Ab poli- i monoklonalne, białko A, awidyna, lektyny, Ang moŝliwość wykorzystania na poziomie badań ultramikroskopowych (ME) moŝliwość równoczesnej lokalizacji kilku Ag za pomocą cząstek cau o róŝnej wielkości : około 5nm; 15nm; 30 nm; 60 nm wysoka czułość dobra kontrastowość preparatów trwałość wyznakowanych preparatów umiarkowane koszty Metody immucytochemiczne z wykorzystaniem cau moŝliwość stosowania w barwieniach do mikroskopu świetlnego tzw. wywoływanie fizyczne wysrebrzanie oparte na zdolności metalicznego Au do katalizowania redukcji jonów Ag w obecności substancji redukującej (np. hydrochinonu) Wrzeciono podziałowe (mikrotubule biegunowe) barwienie Ab znakowanymi cau 10
Zastosowanie immunocytochemii Analiza obecności i lokalizacji dowolnych antygenów (białek) w komórce Białko EB3 w komórkach COS7 Klatryna w komórkach HeLa Receptor EGF w komórkach A 371 Zastosowanie immunocytochemii Wizualizacja struktur subkomórkowych mouse anti-vinculin mab/anti-mo-igg-alexa 488; phalloidin-alexa 594; Hoechst Ephitellial cell I mouse anti-cytokeratin Ab; II - goat anti-mo-igg-cy2; DAPI mo_anti-α-tubulin Ab /anti mo-igg-fitc; phalloidin-tritc; DAPI 11
Zastosowanie immunocytochemii Analiza procesów komórkowych (np. proliferacja) Immunofluorescent staining of staining HeLa cells using Cyclin E2 antibody [ab40890] (1/100). ab40890 (1/250) staining human breast carcinoma by immunohistochemistry, paraffin-embedded tissue. http://www.abcam.com/cyclin-e2-antibody-ep454y-ab40890.html Zastosowanie immunocytochemii Analiza procesów komórkowych (np. proliferacja, apoptoza, róŝnicowanie, transport wewnątrzkomórkowy) Komórki HT-1080, wyznakowane przeciwciałami Phospho-Aurora A (Thr288)/Aurora B (Thr232)/Aurora C (Thr198) (D13A11) XP Rabbit mab (Alexa Fluor 488 Conjugate) (zielony) i β-tubulin (9F3) Rabbit mab (Alexa Fluor 555 Conjugate) (czerwony). Niebieski pseudokolor - DRAQ5 #4084. Komórki HeLa po inkubacji ze staurosporyną (1 µm, 4 godz.) znakowane przeciwciałem Cleaved Caspase-3 (Asp175) (D3E9) Rabbit mab (Alexa Fluor 594 Conjugate) (czerwony). Filamenty aktynowe uwidocznione przy pomocy Alexa Fluor 488 phalloidin (zielony). Niebieski pseudokolor - DRAQ5. http://www.lab-jot.pl/mail/201308cst/alexa.html 12
Zastosowanie immunocytochemii Identyfikacja określonych typów komórek (markery róŝnych typów komórek np. nowotworowych; macierzystych) Immunohistochemical analysis of murine lung tissue, staining CD34 with ab8158. (Formalin/PFA-fixed paraffin-embedded sections) - Anti- CD34 antibody - Hematopoietic Stem Cell Marker (ab8158) Staining CD34 from mouse lung cells by Immunocytochemistry. Ab8158 was incubated with the sample for 1 hour and then detected using an Alexa-Fluor 488 goat anti-rat antibody. The staining for CD34 is shown in green. The samples were also stained for Smooth Muscle Actin (red stain). http://www.abcam.com/cd34-antibody-mec-147-hematopoietic-stem-cell-markerab8158.html#description_images_2 Zastosowanie immunocytochemii Cenne narzędzie w diagnostyce róŝnych chorób komórki raka sutka wybarwione na obecność EGFR komórki mięsakoraka prostaty (wybarwiony antygen PSA) 13
Inne niŝ immunocytochemiczne metody wizualizacji cząsteczek w komórce - barwniki flurescencyjne fluorofory wykazujące powinowactwo do określonych organelli (np. DiI wiąŝe się specyficznie z błonami komórkowymi) fluorofory, których właściwości fluorescenycjne zaleŝą od parametrów mikrośrodowiska, np. jego ph lub stęŝenia jonów wapnia (Fluo-4, Fura-2); fluorofory sprzęŝone z substancjami wykazującymi specyficzne powinowactwo do określonych białek (np. rodamina sprzęŝona z falloidyną, toksyną Ammanita phalloides, łączącą się specyficznie z F-aktyną; fluorochromy zdolne do przenikania przez złącza szczelinowe determinujące komunikację międzykomórkową, np. kalceina; białka fluorescencyjne Metody wizualizacji cząsteczek w komórce Genetyczne znakowanie białek GFP (green fluorescent protein) - zielono białko fluoryzujące (z cyklicznym trójpeptydem ser-tyr-glic ) wprowadzanie genu kodującego GFP do komórki i łączenie z genem kodującym badane białko (technika rekombinacji DNA) śledzenie znakowanych białek w Ŝywych komórkach (białka fuzyjne) Aequorea vicotria Nagroda Nobla 2008 Osamu Shimomura Martin Chalfie Roger Y. Tsien 14
Hybrydocytochemia Hybrydyzacja in situ wykorzystuje zjawisko hybrydyzacji kwasów nukleinowych Hybrydocytochemia wykrywanie w komórce odcinka DNA (lub RNA) o określonej sekwencji nukleotydów ( konkretne geny) znakowane sondy fluorochromami znacznikami antygenowymi izotopami promieniotwórczymi uwidocznienie znacznika sondy reakcje immunocytochemiczne autoradiografia 15
Hybrydyzacja in situ Określanie miejsc genów na chromosomie ludzki chromosom 5 izolowany w metafazie mitozy 6 róŝnych znakowanych sond DNA Wizualizacja komórek, w których dochodzi do syntezy określonego rodzaju mrna wybarwione komórki wierzchołka rosnącego pędu wyŝlinu (ekspresja mrna cyklin) Autoradiografia metoda wykrywania izotopów promieniotwórczych dzięki ich zdolności do zaczerniania emulsji światłoczułej syntetyzowane związki znakowane izotopami promieniotwórczymi są wykorzystywane przez komórki jak związki naturalne 16
Autoradiografia UŜywana w badaniach: lokalizacji w komórkach substancji znakowanych izotopami promieniotwórczymi wewnątrzkomórkowych szlaków metabolicznych proliferacji komórek (wbudowywanie znakowanych nukleotydów do syntetyzowanych łańcuchów DNA) wykrywania znakowanych sond w hybrydocytochemii Autoradiografia nałoŝenie emulsji fotograficznej (kryształy bromku srebra) na przygotowany preparat powstanie tzw. obrazu utajonego w emulsji fotograficznej --ekspozycja (promieniowanie β) wywoływanie i utrwalanie emulsji stronty metalicznego srebra w miejscach obecności izotopu 17
Autoradiografia Komórki B trzustki w hodowli Badanie metabolizmu syntezy i wydzielania insuliny podanie 3 H-leucyna (5min) 10min - znakowane białko w ER, aparacie Golgiego (A) 45min- wakuole sekrecyjne (B) BIBLIOGRAFIA J.P. Robinson, J Sturgis and G Kumar. IHC Staining Methods M. Zabel. Immunocytochemia, 1999 PWN I. Katnik-Prastowska. Immunocytochemia w biologii medycznej 2009 PWN B. Alberts i inni Podstawy Biologii Komórki, PWN 2005 Katalogi firm: Sigma-Aldrich, Molecular Probes, Abcam, Cell Signalling 18