Podstawy technik mikroskopowych / Jan A. Litwin, Mariusz Gajda. - wyd. 7. Kraków, cop Spis treści Od autorów 13

Transkrypt

1 Podstawy technik mikroskopowych / Jan A. Litwin, Mariusz Gajda. - wyd. 7. Kraków, cop Spis treści Od autorów Mikroskopy świetlne Budowa mikroskopu świetlnego Zespół mechaniczny Zespół optyczny Teoria mikroskopu Powstawanie obrazu mikroskopowego Powiększenie całkowite mikroskopu Zdolność rozdzielcza mikroskopu Specjalne odmiany mikroskopów świetlnych Ciemne pole Mikroskop polaryzacyjny Mikroskop fazowo-kontrastowy Mikroskop interferencyjny Kontrast interferencyjno-róŝnicowy (optyka Nomarskiego) Mikroskop fluorescencyjny Mikroskop konfokalny Mikroskop dwufotonowy Mikroskop odwrócony Mikroskop cyfrowy Rejestracja obrazu mikroskopowego Mikrofotografia Wideo mikroskopia Mikroskopia wirtualna Mikroskopy elektronowe Zasady optyki elektronowej Transmisyjny mikroskop elektronowy Działo elektronowe Kondensor Soczewka obiektywowa Soczewki projekcyjne Stolik przedmiotowy Ekran luminescencyjny System fotograficznej rejestracji obrazu Zespól pomp próŝniowych Pulpit sterowniczy Wysokonapięciowy mikroskop elektronowy Skaningowy mikroskop elektronowy Niskonapięciowy mikroskop elektronowy Mikroanalizator rentgenowski 47

2 3. Przygotowanie materiału do badań w mikroskopie świetlnym Rodzaje preparatów mikroskopowych Pobieranie materiału Utrwalanie Cele utrwalania Rodzaje utrwalaczy Metody utrwalania Chemiczne podstawy procesu utrwalania Oddziaływanie mikrofal na tkankę Wypłukiwanie utrwalacza Odwadnianie Płyny pośrednie Zatapianie w parafinie Formowanie bloczków Alternatywna technika parafinowa: opracowanie materiału bez rozpuszczalników organicznych za pomocą mikrofal (ang. microwave paraffin processing) Zalety i ograniczenia techniki parafinowej Zatapianie w celoidynie Zatapianie w Ŝywicach Zatapianie w Ŝywicach akrylowych Zatapianie w Ŝywicach epoksydowych Krojenie skrawków Mikrotomy Zasady krojenia Krojenie skrawków parafinowych Krojenie skrawków celoidynowych Krojenie skrawków z Ŝywic akrylowych Krojenie skrawków z Ŝywic epoksydowych Barwienie Przygotowanie skrawków do barwienia Barwienie barwnikami kwaśnymi i zasadowymi Barwienie przyŝyciowe Impregnacja związkami metali Bejcowanie RóŜnicowanie Płukanie Zamykanie preparatów Automatyzacja procesów opracowania materiału do badań mikroskopowych Przygotowanie tkanek zmineralizowanych do badań mikroskopowych Technika szlifów Technika skrawków Przepisy praktyczne Utrwalacze Odwadnianie 74

3 Zatapianie w parafinie Zatapianie w celoidynie Zatapianie w Ŝywicy akrylowej Histocryl Barwienie hematoksyliną i eozyną Barwienie trichromem Massona Barwienie włókien spręŝystych rezorcyno-fuksyną Impregnacja srebrem włókien kratkowych (metoda Gomoriego) Barwienie rozmazów krwi i szpiku metodą Maya-Grxinwalda i Giemsy Barwienie wymazów pochwowych metodą Papanicolaou Przygotowanie materiału do badań w mikroskopie elektronowym Utrwalanie pierwotne Rodzaje utrwalaczy ph utrwalacza Osmolarność utrwalacza Temperatura utrwalania Wypłukiwanie utrwalacza Osmowanie (utrwalanie wtórne) Odwadnianie Zatapianie Zatapianie w Ŝywicach epoksydowych Zatapianie w Ŝywicach akrylowych Krojenie skrawków Przygotowanie bloczka do krojenia (trymowanie) Ultramikrotomy Przygotowanie noŝa szklanego Krojenie i ocena grubości skrawków Montowanie skrawków Kontrastowanie skrawków Specjalne techniki przygotowania materiału do badań w transmisyjnym mikroskopie elektronowym Technika barwienia negatywowego Technika cieniowania metalami Technika replik Technika mroŝenia i łamania (ang. freeze-fracture) Przygotowanie materiału do badań w skaningowym mikroskopie elektronowym Suszenie w punkcie krytycznym Napylanie próŝniowe Technika odlewów mikrokorozyjnych Przepisy praktyczne Utrwalacze Odwadnianie Zatapianie w Ŝywicy Epon Zatapianie w Ŝywicy Araldite Barwienie skrawków półcienkich do celów mikroskopii świetlnej 99

4 Barwienie (kontrastowanie) skrawków ultracienkich do celów mikroskopii elektronowej Technika mroŝeniowa ZamraŜanie materiału Fizyczne podstawy zamraŝania materiału biologicznego ZamraŜanie w ciekłych gazach ZamraŜanie dwutlenkiem węgla ZamraŜanie w kriostacie Krioprotekcja Przechowywanie zamroŝonego materiału Krojenie skrawków z zamroŝonego materiału Kriostat Krioultramikrotom MroŜenie z substytucją (podstawianiem) Liofilizacja Fizyczne podstawy procesu liofilizacji Przebieg procesu liofilizacji Przygotowanie materiału liofilizowanego do badań mikroskopowych Zastosowanie liofilizacji Podstawy klasycznej histochemii Reakcje histochemiczne Podstawy reakcji histochemicznych Typy reakcji histochemicznych Przygotowanie materiału do badań histochemicznych Utrwalanie Przygotowanie materiału do badań w mikroskopie świetlnym Przygotowanie materiału do badań w transmisyjnym mikroskopie elektronowym Wykrywanie białek Wykrywanie cukrowców Reakcja PAS (ang. Periodic Acid-Schiff) Wykrywanie kwaśnych glikozoaminoglikanów błękitem alcjanowym Wykrywanie kwaśnych glikozoaminoglikanów Ŝelazem koloidalnym Metachromazja Wykrywanie lipidów Wykrywanie kwasów nukleinowych Reakcja Feulgena Metoda Bracheta Metody fluorescencyjne Wykrywanie amin biogennych Wykrywanie wybranych składników patologicznych Hemosyderyna i złogi Ŝelaza Lipofuscyny Amyloid Wykrywanie enzymów Reakcja histoenzymatyczna 122

5 Reakcja precypitacji z kationami metali (reakcja Gomoriego) Reakcja sprzęgania do związków azowych Reakcja indygogenna Reakcja utleniania lub redukcji substratu Reakcje kontrolne Przepisy praktyczne Reakcja PAS Reakcja Feulgena Wykrywanie białek błękitem bromofenolowym Barwienie lipidów Sudanem III i IV Fluorescencyjna metoda wykrywania amin biogennych Wykrywanie fosfatazy alkalicznej metodą sprzęgania Wykrywanie kwaśnych hydrolaz lizosomowych metodą sprzęgania Wykrywanie dehydrogenaz Wykrywanie peroksydaz Metoda score" Podstawy immunohistochemii Antygen i przeciwciało Otrzymywanie i oczyszczanie przeciwciał do badań immunohistochemicznych Otrzymywanie przeciwciał poliklonałnych Otrzymywanie przeciwciał monoklonalnych Znakowanie przeciwciał Znakowanie fluorochromami Znakowanie enzymami Znakowanie ferrytyną Znakowanie koloidalnym złotem Przygotowanie materiału do badań immunohistochemicznych Utrwalanie Zatapianie Naklejanie skrawków Odsłanianie miejsc antygenowych Wykonanie reakcji immunohistochemicznej Mikroskopia świetlna Mikroskopia elektronowa Typy reakcji immunohistochemicznych Reakcja bezpośrednia Reakcja pośrednia dwuetapowa Reakcja z mostkiem immunoglobulinowym i kompleksem enzymantyenzym Reakcja z białkiem A Reakcja z awidyną i biotyną Reakcja z łańcuchami polimerowymi Wzmocnienie reakcji za pomocą tyramidów Jednoczesne wykrywanie kilku antygenów Reakcje kontrolne Wykrywanie reszt cukrowcowych za pomocą lektyn 152

6 7.9. Przepisy praktyczne Pośrednia reakcja immunofluorescencyjna na skrawkach parafinowych Hybrydyzacja in situ Wytwarzanie i rodzaje sond Znakowanie sond Przygotowanie materiału do hybrydyzacji in situ Utrwalanie Zatapianie Permeabilizacja Zapobieganie reakcjom nieswoistym Hybrydyzacja Denaturacja kwasów nukleinowych Hybrydyzacja i wpływające na nią czynniki Wykrywanie sond związanych z tkanką Reakcje kontrolne Łańcuchowa reakcja polimerazy in situ (in situ PCR) Metoda PRINS Fluorescencyjne metody badania Ŝywych komórek Znaczniki organelli komórkowych Znaczniki wewnątrzkomórkowego stęŝenia jonów i potencjału elektrycznego Metoda FRET Białka fluoryzujące Białka fluoryzujące jako znaczniki białek wewnątrzkomórkowych Białka fluoryzujące jako wskaźniki ekspresji genów Białka fluoryzujące jako znaczniki linii komórkowych Podstawy autoradiografii ZałoŜenia techniki autoradiograficznej Zastosowanie autoradiografii Izotopy promieniotwórcze stosowane w autoradiografii Wprowadzanie znakowanych substancji do komórek i tkanek Przygotowanie preparatu autoradiograficznego (autoradiogramu) Technika emulsji zdzieranej Technika emulsji płynnej Ekspozycja Wywołanie autoradiogramu Procedura histologiczna towarzysząca autoradiografii Zdolność rozdzielcza autoradiogramów Tło Reakcje kontrolne Opracowanie i ocena wyników WyposaŜenie pracowni autoradiograficznej 181

7 11. Hodowla komórek i tkanek Klasyfikacja i terminologia Ustalone linie komórkowe PoŜywki i warunki hodowli Metodyka hodowli Kontrola Ŝywotności komórek w hodowli Transformacja komórek Agregacja i segregacja komórek Fuzja i hybrydyzacja komórek Hodowla fibroblastów, leukocytów i limfocytów Zastosowanie hodowli komórek i tkanek Przepisy praktyczne Zakładanie hodowli fibroblastów Zakładanie hodowli leukocytów Ocena Ŝywotności komórek Analiza ilościowa preparatów mikroskopowych Densytometria i fluorymetria Fizyczne podstawy densytometrii Metodyka pomiarów densytometrycznych i fluorymetrycznych Urządzenia stosowane w densytometrii i fluorymetrii Cytometria przepływowa Fizyczne podstawy pomiaru cytometrycznego Budowa cytometru Przygotowanie komórek do pomiarów cytometrycznych Zastosowanie badań cytometrycznych Morfometria Planimetria Stereologia Tradycyjne narzędzia stosowane w badaniach morfometrycznych Komputerowa (cyfrowa) analiza obrazu Przekształcanie obrazu mikroskopowego w formę cyfrową Przetwarzanie obrazu cyfrowego Analiza morfometryczna wybranych obiektów Analiza fotometryczna wybranych obiektów Urządzenia do komputerowej analizy obrazu Przygotowanie preparatów do automatycznych pomiarów ilościowych 209 oprac. BPK