Metody badań struktury i funkcji komórek

Transkrypt

1 Metody badań struktury i funkcji komórek Współczesne badania mikroskopowe Barwienia cytochemiczne Autoradiografia Wizualizacja cząsteczek w Ŝywej komórce Badania biochemiczne i molekularne w biologii komórki Materiał do badań biologii komórki Pobieranie materiału z organizmów Hodowle komórkowe Organizmy modelowe

2 Mikroskopy świetlne Zdolność rozdzielcza mikroskopu λ d = κ A A = n x sin α A = apertura numeryczna λ = długość fali światła tworzącego obraz κ = współczynnik zaleŝny od stosunku A kondensora do A obiektywu α = kąt między osią optyczną a skrajnym promieniem wpadającym do obiektywu n = współczynnik załamania fali w środowisku 2α Ob K gdy A = 1,4 i λ= 0,45µm d = 0,2 µm Wizualizacja komórek przejrzystych Kontrastowanie komórek: barwienia specjalne odmiany mikroskopów Mikroskopy: kontrastowo-fazowe interferencyjne polaryzacyjno-interferencyjne z układem optycznym Nomarskiego

3 Mikroskop kontrastowo-fazowy Fizyk holenderski Frits Zernike opracował zasadę kontrastu-faz; nagroda Nobla bezpośrednie przekształcenie zmian fazowych fali świetlnej w badanym preparacie na zmiany natęŝenia światła w obrazie mikroskopowym tego preparatu przesłona pierścieniowa kondensora płytka fazowa w obiektywie Układ optyczny, który przesuniecie fazy fali świetlnej przekształca w zmianę amplitudy Mikroskopy świetlne specjalne odmiany mikroskopów Fibroblast (HSF) z hodowli; zdjęcie spod mikroskopu: A) jasnego pola, B) kontrastu-faz, C) kontrastu róŝnicowego Nomarskiego, D) ciemnego pola

4 Mikroskop fluorescencyjny wykorzystuje zjawisko fluorescencji substancji : obecnych w komórce: chlorofil, witamina A, porfiryny, lipofuscyny wprowadzonych (znaczniki fluorescencyjne): fluoresceina, rodamina, oranŝ akrydyny, DAPI, Hoechst, bromek etydyny, Alexa, Cyto... Mikroskop fluorescencyjny oświetlenie epi oświetlenie dia

5 Mikroskop fluorescencyjny Wrzeciona mitotyczne w metafazie u embriona muszki owocowej Drosophila (DNA wybarwione na zielono; mikrotubule wrzeciona na czerwono). Mitoza w komórkach płuc traszkiw hodowli (DNA wybarwione na niebiesko; mikrotubule wrzeciona na zielono). uniwersalny mikroskop badawczy wykorzystanie róŝnych odmian mikroskopii świetlnej przy uŝyciu 1 przyrządu wizualizacja i analiza procesów biologicznych z wykorzystaniem zautomatyzowanych systemów mikroskopowych (chłodzone kamery CCD); moŝliwości poklatkowej rejestracji obrazów; cyfrowy zapis obrazów i analiza.

6 Wizualizacja struktury komórki Klasyczne barwienia cytologiczne (histologiczne) Metody immunocytochemiczne oparte na wysokiej swoistości wiązania antygenu z przeciwciałem Autoradiografia metoda wykrywania izotopów promieniotwórczych dzięki ich zdolności do zaczerniania emulsji światłoczułej Barwienia cytologiczne (histologiczne) Hematoksylina jądra powinowactwo do cząsteczek ujemnie naładowanych (DNA, RNA, kwaśne białka) Eozyna- substancja międzykomórkowa Komórki zbiorczego kanalika moczowego nerki

7 Immunocytochemia Znaczniki: fluorochromy enzymy metale cięzkie antygen -kaŝda substancja w komórce, która ma właściwości immunogenne przeciwciało - immunoglobulina skierowana przeciw danemu antygenowi róŝnorodność swoistość przeciwciał Immunocytochemia

8 Metody wizualizacji cząsteczek w Ŝywej komórce Genetyczne znakowanie białek GFP (green fluorescent protein) - zielono białko fluoryzujące (z cyklicznym trójpeptydem ser-tyr-glic ) wprowadzanie genu kodującego GFP do komórki i łączenie z genem kodującym badane białko (technika rekombinacji DNA) 238 aa śledzenie znakowanych białek w Ŝywych komórkach (białka fuzyjne) Aequorea vicotria Hodowla komórek i tkanek utrzymanie przy Ŝyciu oddzielonych od organizmu komórek (w warunkach sztucznych), in vitro hodowla dostarczenie wszystkich składników i odpowiednich warunków niezbędnych do wzrostu i rozwoju - poŝywki: odpowiedni skład, ph, osmolarność poŝywki naturalne (osocze, wyciągi tkankowe) poŝywki sztuczne (zdefiniowane; z dodatkiem surowicy) - temperatura, %CO 2

9 zachowanie jałowości - jałowość całej procedury hodowli - naczynia hodowlane - antybiotyki Hodowla komórek i tkanek Zdjęcie fibroblastów w hodowli Zdjęcie mioblastów w hodowli Zdjęcie komórek prekursorowych oligodendrocytów w hodowli

10 Organizmy modelowe w badaniach Cecha małe rozmiary i proste poŝywienie duŝa liczba potomstwa krótki cykl Ŝyciowy mały genom duŝe chromosomy dostępność informacji i technik badawczych Zalety hodowla nie wymaga duŝo miejsca, jest łatwa i tania w utrzymaniu pozwala na wiarygodną analizę statystyczną wzorów dziedziczenia umoŝliwia obserwację wzorów dziedziczenia w kolejnych pokoleniach mała ilość DNA do analizy; łatwiej badać chromosomy w mikroskopie świetlnym wiele genetycznych mutantów jest dostępnych do analiz Organizmy modelowe -Prokarionty Escherichia coli (pałaczka okręŝnicy) (Enterobacteriaceae) Gram-ujemna bakteria flora bakteryjna jelita grubego symbiont podział co 20min Poznanie mechanizmów replikacji, transkrypcji i 2µm; 0,8µm translacji 1 kolista cząsteczka DNA 4,6 mln par zasad; 4300 białek od 15 tys. do 30 tys. rybosomów

11 Organizmy modelowe -Eukarionty Organizmy jednokomórkowe Saccharomyces cerevisiae - droŝdŝe piekarskie DNA 12,1 mln par zasad (2,5 x więcej) genów (5800 funkcjonalnych) 23% genomu droŝdŝy - jak u ludzi kompletna sekwencja genomu (1-szy eukariont) Poznanie mechanizmów cyklu komórkowego komórki eukariotycznej Rośliny modelowe bliskie pokrewieństwo ewolucyjne roślin kwiatowych (200mln lat) z gatunków Arabidopis thaliana - rzodkiewnik pospolity 5-30 cm Łatwość hodowli w szklarniach hydroponiczna Genom -110 mln par zasad, znana sekwencja Badania mechanizmów rozwoju i róŝnicowania roślin kwiatowych

12 Zwierzęta modelowe Caenorhabditis elegans - nicień Genom 97 mln par zasad genów sekwencja znana 959 komórek 70% białek człowieka ma odpowiedniki u C. elegans Poznanie mechanizmów rozwoju embrionalnego i działania wielu genów ( apoptozy) Drosophila melanogaster - muszka owocowa genom (4 chromosomy) 185 mln par zasad Samiec i samica białek Poznanie podstaw genetyki klasycznej i mechanizmów rozwoju zarodkowego i larwalnego

13 Kręgowce modelowe Danio rerio Danio pręgowany (ryby) Genom 1,527,000,581par zasad genów białek sekwencja znana Szybki rozwój Łatwość uzyskiwania mutantów Poznanie mechanizmów rozwoju embrionalnego i działania wielu genów kręgowców Mus musculus Mysz domowa (ssaki) Prosta i tania hodowla DuŜa liczba potomstwa Zarodki myszy moŝna łatwo hodować in vitro Zarodki hodowane in vitro moŝna poddawać licznym manipulacjom np. nokauty genowe Uzyskiwanie myszy transgenicznych (z ekspresją obcego genu) Linie myszy z mutacjami genowymi lub skonstruowanymi genami Izolacja i hodowla in vitro komórek ES Genom: sekwencja poznana mysz ma 2,7 mld par zasad, człowiek ok. 3,1 mld par zasad, mysz ma 20 par chromosomów, człowiek - 23 pary Poznanie mechanizmów działania wielu genów na poziomie komórki i całego organizmu

14 Homo sapiens człowiek (ssaki) Badania na róŝnorodnych komórkach ludzkich w hodowlach in vitro ( defekt w genie kit - komórki barwnikowe) PoniewaŜ geny człowieka mająścisłe odpowiedniki u organizmów prostszych, to badania tych organizmów (modelowych) mogą być kluczem do zrozumienia jak skonstruowane są i jak funkcjonują organizmy zwierzęce i organizm człowieka. Chemiczne składniki komórek Vis vitalis do XIX w. Zbudowane z takich samych związków jak materia nieoŝywiona 65% 96,5% masy komórek H, O, C i N Pierwiastki chemiczne w komórkach: - makroelementy (pierwiastki biogenne) H, O, C, N, S, P Ca, Mg, K, Na, Cl >1% suchej masy - mikroelementy Fe, Cu, Mn, Mo, B, Zn, Co, J, F 0,01% - 0,00001% suchej masy 18% - ultraelementy Ra, Au, Ag, Pt, Se <10-6 % suchej masy 3%

15 Komórki wykorzystują prawa fizyki i chemii, aby przeŝyć Chemia komórki opiera się na związkach C (związki organiczne) zaleŝy od reakcji przebiegających w środowisku wodnym, wąskim zakresie temperatur wykazuje ogromną złoŝoność zdominowana przez cząsteczki polimerowe zachodzące reakcje sąściśle kontrolowane (miejsce, czas) Chemiczne składniki komórek DNA RNA białka jony nieorganiczne 1% małe cząsteczki organiczne 3% makrocząsteczki 26% polisacharydy ogromne zagęszczenie cząsteczek dynamika ruchu i oddziaływań cząsteczek

16 Skład chemiczny komórki bakteryjnej % masy komórki liczba rodzajów cząsteczek jony nieorganiczne 1 20 małe cząsteczki organiczne cukry i ich prekursory aminokwasy i prekursory 0,4 100 nukleotydy i prekursory 0,4 100 kwasy tłuszczowe i prekur inne 0,2 300 makrocząsteczki Małocząsteczkowe związki organiczne: masa cząst do ok. 30 atomów C cukry, aminokwasy, nukleotydy, kwasy tłuszczowe ok rodzajów cząsteczek w komórce eukariotycznej wolne cząsteczki w cytoplazmie jednostki monomeryczne makrocząsteczek elementy konstrukcyjne makrocząsteczek i struktur komórkowych źródło energii inne funkcje (sygnałowe)

17 Makrocząsteczki Ogólna reakcja uzyskiwania/degradacji makrocząsteczek H- -OH + H H 2 O hydroliza - H 2 O kondensacja H wiązania kowalencyjne glikozydowe peptydowe fosfodiestrowe podjednostka - makrocząsteczka Makrocząsteczki łączenie podjednostek w odpowiedniej kolejności = sekwencja reakcje katalizowane przez enzymy róŝnorodność sekwencji Białko o łańcuchu 150 aminokwasów kombinacji DNA o łańcuchu nukleotydów kombinacji Trisacharyd - setki kombinacji (łańcuchy rozgałęzione) róŝnorodność konformacji (elastycznośc łańcuchów)

18 unikatowy układ przestrzenny makrocząsteczek - wiązania niekowalencyjne: wodorowe jonowe van der Waalsa hydrofobowe własności biologiczne Makrocząsteczki wiązania niekowalencyjne -wybiórcze wiązanie innych cząsteczek powierzchnie nie pasują, ruchy termiczne rozdzielają cząsteczki powierzchnie pasują, cząsteczki związane - wiązania niekowalencyjne

19 Cukry - małocząsteczkowe związki Monosacharydy (CH 2 O) n n = 3 7 róŝnorodność * triozy * tetrozy * pentozy * heksozy * heptozy Monosacharydy - róŝnorodność stereoizomeria n- liczba C 2 n - stereoizomerów C 6 H 12 O 6 D- galaktoza D- glukoza D-mannoza

20 Monosacharydy - róŝnorodność izomeria optyczna L- glukoza D- glukoza konfiguracja α lub β Monosacharydy - pochodne cukrów glukozy kwas glukuronowy glukozoamina N-acetyloglukozoamina

21 Disacharydy (dwucukry) - róŝnorodność 11 róŝnych disacharydów z kondensacji 2 cząsteczek glukozy Disacharydy Sacharoza z kondensacji cząsteczki glukozy i fruktozy Oligosacharydy od trisacharydów do około 50 podjednostek cukrowych Polisacharydy (wielocukry, cukry złoŝone) materiał zapasowy >10 do tysięcy podjednostek cukrowych elementy konstrukcyjne struktur komórkowych i substancji międzykomórkowej

22 skrobia glikogen Polisacharydy (C 6 H 10 O 5 )n n>300 ; wyłącznie mery α D-glukozy; amyloza łańcuchy nierozgałęzione; ; α 1,4 1,4 glikozydowe; amylopektyna - rozgałęzione (C 6 H 10 O 5 )n; n=12-18, wyłącznie mery α D-glukozy; łańcuchy silnie rozgałezione; celuloza pektyny chityna (C 6 H 10 O 5 )n n-kilkaset, wyłącznie mery D-glukozy; łańcuchy nierozgałezione; wiązania β 1,4 1,4 glikozydowe; skład zmienny, gł. z jednostek kwasu D-galakturonowego; wiązania α 1,4 1,4 glikozydowe; łańcuchy nierozgałęzione i rozgałęzione (C 8 H 13 O 5 N)n ; mery acetyloglukozoaminowe ; łańcuchy nierozgałezione; wiązania β 1,4 1,4 glikozydowe; Małocząsteczkowe związki organiczne - aminokwasy R łańcuch boczny forma niezjonizowana forma zjonizowana 20 aminokwasów powszechnych (α-amiokwasów) kwaśne (Asp, Glu) zasadowe (Lys, Arg, His) polarne bez ładunku (Asn, Gln, Ser, Thr, Tyr) niepolarne (Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Phe, Met, Trp, Cys)

23 aminokwasy izomeria optyczna formy D- i L- aminokwasów D i L-alanina L- aminokwasy białka D- aminokwasy ściany komórek bakterii antybiotyki jednostki monomeryczne peptydów, polipeptydów, białek aminokwasy - peptydy/ polipeptydy/ białka polarność strukturalna wiązanie peptydowe α-helisa; β-harmonijka; superhelisa; oligomeryzacja Filmy sekwencja peptydu: Phe-Ser-Glu-Lys

24 Małocząsteczkowe związki organiczne - nukleotydy adenina Nukleotydy: rybonukleotydy deoksyrybonukleotydy film ryboza adenozyna ATP trifosforan Zasady azotowe: pirymidynowe: cytozyna (C), tymina, (T) uracyl (U) Purynowe: adenina (A), guanina (G) Małocząsteczkowe związki organiczne - nukleotydy krótkotrwałe nośniki energii chemicznej (ATP, GTP) nośniki innych grup chemicznych cząsteczki sygnałowe (camp) połączone z innymi cząsteczki (CoA) monomery kwasów nukleinowych (przekaz informacji biologicznej)

25 kwasy nukleinowe wiązanie fosfodiestrowe DNA; RNA filmy peptyd G-A-T-C Małocząsteczkowe związki organiczne kwasy tłuszczowe R-COOH (R oznacza łańcuch węglowodorowy), C: zwykle łańcuchy nasycone łańcuchy nienasycone (cis) cząsteczka amfipatyczna kwasu palmitynowego

26 kwasy tłuszczowe C 18; 1= C 18 kwas oleinowy kwas stearynowy C 18; 2= kwas linolenowy C18; 3= w komórkach (zwykle) : estry lub amidy; kwas linolowy Pochodne kwasów tłuszczowych triacyloglicerole (tłuszcze obojętne) estry kwasów tłuszczowych i glicerolu materiał energetyczny fosfolipidy glikolipidy Inne lipidy steroidy pochodne glicerolu lub sfingozyny składniki błon plazmatycznych terpenoidy (poliizoprenoidy)